Name: In vivo drie-dimensionale twee-Fotonmicroscopie om uitgevoerde vasculaire responsen te bestuderen door lokale ATP-ejectie met behulp van een glazen micro pipet (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Leer drie-dimensionale twee-fotonmicroscopie om vasculaire responsen in cerebrale capillairen te bestuderen via lokale ATP-ejectie. Deze methode simuleert synaptische activiteit en helpt onderzoekers neurovasculaire interacties in vivo begrijpen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd gesteund door de Stichting Lundbeck, de Stichting NOVO-Nordisk, de Deense Raad voor onafhankelijk onderzoek | Medische wetenschappen, en de NORDEA Foundation verlenen aan het centrum voor gezonde veroudering.

Alle procedures met betrekking tot dieren zijn goedgekeurd door het Deens nationaal ethisch comité overeenkomstig de richtsnoeren die zijn uiteengezet in het Verdrag van de Europese Raad inzake de bescherming van gewervelde dieren die worden gebruikt voor experimentele en andere wetenschappelijke doeleinden en voldoen aan de richtlijnen voor de aankomst. Dit is een terminale procedure waarbij de muizen voorafgaand aan verdovings herstel worden geëmoriseerd.
1. pre-chirurgische voorbereiding
<ol><li>Reinig de chirurgische tafel en alle omliggende gebied met 70% ethanol. Grondig reinigen en drogen van de chirurgische gereedschappen voor de operatie.</li>
	<li>Anesthetiseer een NG2DsRed Mouse (TG (Cspg4-DsRed. T1) 1Akik/J; beide geslachten; 4-8 maanden oud) door een peritoneale injectie van ketamine + xylazine (60 mg/kg + 10 mg/kg) opgelost in gesteriliseerd water, pH 7,4. Dien elke 25 minuten aanvullende doses ketamine (30 mg/kg) toe tot de voltooiing van de chirurgische ingreep. Controleer de staart-en teen knijp reflexen regelmatig om de diepte van de anesthesie te controleren.</li>
	<li>Injecteer de zoutoplossing subcutaan op vier verschillende plaatsen op de achterzijde van de muis voor een totaal volume van 1 mL om uitdroging tijdens het experiment te voorkomen. Om de ogen te beschermen tegen uitdroging, moet u een oogsmeer middel aanbrengen. Handhaaf de lichaamstemperatuur bij 37 °C met een rectale temperatuursonde en een verwarmings deken.</li>
</ol>2. chirurgische ingreep
<ol><li>Tracheotomie
	<ol>
<li>Plaats de muis op de achterkant. Injecteer 0,04 mL 0,5% lidocaïne subcutaan onder de geplande incisie en wacht 2 min. Maak een 10 mm lange incisie boven het borstbeen (manubrium). Scheid de submandibulaire klieren en sternoschildklier spieren, en vervolgens bloot de luchtpijp.</li>
		<li>Maak tracheostomie tussen twee tracheale ringen met een schaar. Plaats een kleine metalen buis met een lengte van 16,2 mm en een diameter van 1 mm in de luchtpijp. Sluit de buis aan op een mechanische ventilator en capnograph om de end-expiratory CO2 (Figuur 1a) te bewaken.</li>
	</ol></li>
	<li>Inbrengen van de katheter
	<ol>
<li>Injecteer 0,5% lidocaïne (0,04 mL) subcutaan onder de geplande incisie en wacht 2 minuten.</li>
		<li>Met behulp van fijne tip Tang voorzichtig scheiden van de slagader van de ader. Stop de bloedstroom stroomopwaarts met een microvasculaire klem. Vernauwing van de bloedstroom stroomafwaarts met een 10-0 nylon hechtdraad die beide bloedvaten liggende.</li>
		<li>Gebruik micro-dissecting schaar om een kleine incisie te maken in zowel de slagader als de ader. Plaats plastic katheters in beide bloedvaten. Zet de katheters vast door de hechtingen te verdraaien (8-0 of 10-0 nylon hechtingen afhankelijk van de grootte van het vat) zonder afbreuk te doen aan katheter lumens. Verwijder de microvasculaire klem en sluit de huid.</li>
		<li>Controleer de bloeddruk via de arteriële katheter. Meetniveaus van bloedgassen in arteriële bloedmonsters (50 μL) voor en na elk experiment (normale waarden: pO2, 90-120 mmHg; PCO2, 35-40 mmHg; pH, 7,25-7.45) met behulp van een bloedgasanalysator. Gebruik de ader katheter voor infusie van fluoresceïne en anesthesie.</li>
	</ol></li>
	<li>Craniotomie
	<ol>
<li>Scheer de vacht van het hoofd van de muis tussen de oren. Injecteer 0,04 mL 0,5% lidocaïne subcutaan onder de geplande incisie en wacht 2 min.</li>
		<li>Veeg de schedel met een ijzer chloride oplossing van 10% om het periosteum te verwijderen. Spoel de schedel grondig met een zoutoplossing. Lijm een metalen kopbar aan de schedel met Cyanoacrylaat lijm en activator (Figuur 1a). Let op: de metalen kopbar is 75 mm lang en 13,5 mm breed, met een rond gat van 5 mm diameter in het midden.</li>
		<li>Boor een craniotomie met een diameter van 4 mm, gecentreerd op 0,5 mm achter en 3 mm rechts van de bregma over de juiste sensorische Barrel cortex. Verwijder de Dura met een fijn-Tip vat dilator.</li>
		<li>Bedek de blootgestelde cortex met 0,75% agarose-gel, opgelost in kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF; pH = 7,4) en gekoeld tot 35 °C. Bedek 80-90% van de craniotomie met een glazen afdekplaat onder een hoek van 10-15 ° tot de metalen kopbalk (Figuur 1B) die het inbrengen en plaatsen van de glazen micro pipet toestaat.</li>
		<li>Om de hersen pulsatie te minimaliseren, lijm de twee hoeken van de glazen afdekplaat op de metalen hoofdbar met Cyanoacrylaat lijm en activator. Breng de activator zorgvuldig aan om te voorkomen dat je op de blootgestelde hersenen. Spoel de gelijmde glazen dekslip grondig af met een zoutoplossing achteraf.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer het inbrengen van de whisker pad stimulatie sonde uit. Plaats een set van op maat gemaakte bipolaire elektroden (8 mm lengte en 0,25 mm dikte) in de linker kant van het gezicht om de Ramus infraorbitalis van de trigeminuszenuw contralateraal aan de craniotomie te stimuleren. Plaats de kathode dicht bij de hiatus infraorbitalis, en steek de anode in de kauw stelsel spieren7. Voer de stimulatie uit met een elektrische stimulator met een intensiteit van 1,5 mA voor 1 MS in treinen van 20 sec. bij 2 Hz.</li>
	<li>Dien na voltooiing van de operatie een bolus van 0,05 mL fluoresceïne isothiocyanaat-dextran (FITC-dextran, 4% m/v, molecuulgewicht [MW] 50.000) in de dijader in om het bloed plasma te labelen. Stop met ketamine en schakel de anesthesie naar continue intraveneuze infusie van α-chloralose (17% w/v, eindconcentratie) vermengd met FITC-dextran (2% w/v, eindconcentratie) bij 0,02 mL/10 g/h. wacht ongeveer een half uur voor stabilisatie van de nieuwe anesthetische toestand. Opmerking: zowel FITC-dextran als α-chloralose worden opgelost in 0,9% zoutoplossing.</li>
</ol>3. eerste twee-Photon Imaging Session
<ol><li>Breng de muis over naar het podium van een commerciële twee-photon-Microscoop (tabel met materialen). Onder zowel rode fluorescerende eiwitten (RFP, Figuur 1c) en groen fluorescerende eiwitten (GFP, Figuur 1c) modi van epi-fluorescerende verlichting, neem een foto van de blootgestelde cortex met een 5x doelstelling. Gebruik de RFP-foto als een ' map ' voor het inbrengen van de glazen micro pipet in de volgende sessie. Opmerking: de GFP ' kaart ' wordt gebruikt om aderen/venules van slagaders/arteriolen te onderscheiden.</li>
	<li>Voer Two-photon Imaging uit met behulp van de Two-photon Microscoop en een 25x 1,0 numerieke diafragma (NA) water-immersie doelstelling met piëzo-motor. Stel de golflengte van de excitatie in op 900 nm. Zoek de cortex en volg elke penetrerende Arteriole en vind de horizontale takken (1St orde capillairen).</li>
	<li>Beeld penetrerende arteriolen en hun 1St orde capillairen in rust en tijdens de whisker pad stimulatie. Zie de gedetailleerde beeldvormings parameters in sectie 5.</li>
	<li>Markeer locaties van 1St orde capillairen met > 5% vasodilatatie tijdens de whisker pad stimulatie op de RFP ' map ' (Figuur 1C). Locaties met < 5% vasodilatatie worden beschouwd als buiten de whisker Barrel cortex regio. Opmerking: bij gebruik van wild-type muizen in plaats van NG2DsRed muizen in het experiment, wordt de GFP-afbeelding in plaats daarvan gebruikt als ' map '.</li>
</ol>4. inbrengen van de glazen micro pipet
<ol><li>Maak glazen micropipetten klaar voor het puffen met behulp van een pipet trekker (tabel met materialen). De glazen micropipetten hebben een weerstand van 3-3.5 MΩ en een conus lengte van 4,5-5 mm. Laad een pipet met een mengsel van 1 mM ATP en 10 μM Alexa 594 om de pipetpunt onder de epi-fluorescentielamp en de twee-fotopmicroscoop te visualiseren.</li>
	<li>Monteer de glazen micro pipet op een patch houder en sluit deze aan op een luchtpomp. Zet de pomp met druk op 0 psi.</li>
	<li>Gebruik rode epi-Fluorescentieverlichting en concentreer u op de pipetpunt met de 5x-doelstelling. Plaats de glazen micro pipet in de aCSF boven de agarose. Stel de houd druk van de luchtpomp in op 0,2 psi. Een kleine rode wolk kan worden waargenomen uitwerpen uit de pipetpunt in de aCSF. Dit is om verstopping te voorkomen tijdens pipet inbrengen.</li>
	<li>Kies een van de gemarkeerde locaties in de RFP ' map ' als bestemming. Verplaats de pipetpunt naar het horizontale vlak van de afdekglas rand met een afstand van 30 μm, die ongeveer naar de bestemming in het x-y-vlak wijst.</li>
	<li>Verlaag de pipetpunt voorzichtig in de z-as onder de afdekglas strook. Begin vervolgens met het bevorderen van de glazen pipet naar de bestemming tot ~ 500 μm boven het hersen oppervlak. Schakel regelmatig scherp tussen de afdekglas rand, de pipetpunt en het hersen oppervlak en zorg ervoor dat er voldoende vrije ruimte is om de pipet te verplaatsen.</li>
	<li>Stel de doelstelling in op 25x. Plaats de pipetpunt opnieuw en de pipetpunt verder naar de bestemming op de kaart van de RFP. Houd de pipetpunt in de agarose-laag.</li>
	<li>Wanneer de pipetpunt ~ 100 μm boven het hersen oppervlak ligt, schakelt u de beeldvormings modus in op twee-photon-microscopie. Concentreer u op een doellocatie waar u wilt bladerdeeg. Noteer de x-, y-coördinaten (x0, y0) en de diepte onder het oppervlak (z0). Bereken de coördinaten van het invoegpunt op het hersen oppervlak (xi, yi) als volgt: xi = x0 + z0 /Tan θ yi = y0 waarbij θ de hoek is tussen de pipet houder en het horizontale vlak.</li>
	<li>Plaats de pipetpunt op de coördinaten (xi, yi) op het hersen oppervlak. Plaats de pipet voorzichtig en langzaam totdat deze bereikt (x0, y0, z0). Als een vat in de weg staat van een insertie pad, trekt u de pipet in en berekent u andere invoegings coördinaten en het pad; of draai de werk plaat lichtjes (zoals aangegeven in Figuur 1A).</li>
	<li>Stel de pomp met druk op 0 psi en ejectiedruk bij 10-15 psi. Puff ATP voor 200-400 MS op de doellocatie tijdens twee-Photon Imaging. Pas de druk en de duur van de puffing voor elke pipet en na verloop van tijd aan zoals uitgelegd in de sectie discussie.</li>
</ol>5. hyperstack Two-photon Imaging
<ol><li>Voer experimenten uit met de twee-photon Microscoop en een 25 x 1,0 NA water-immersie doelstelling met piëzo-motor. Stel de golflengte van de excitatie in op 900 nm. Filter het uitgezonden licht om rood licht te verzamelen van DsRed (pericytes)/tetramethylrhodamine isothiocyanaat-dextran (TRITC-dextran) kleuring bloed plasma en groen licht van FITC-dextran (bloed plasma)/GCaMP6 (GFP, astrocytisch calcium).</li>
	<li>Produceer een z-stack met hoge resolutie op de locatie van belang die een penetrerende Arteriole bevat, een 1St -orde capillair, een 2ND -volgorde capillair en mogelijk naburige fluorescerende cellen (bijv. pericytes, astrocyten). Bepaal het x * y * z-volume van hyperstack-beeldvorming door de 3D-structuur van de bloedvaten zoveel mogelijk te opnemen. De totale hoogte van elke stapel kan variëren van 30-50 μm, terwijl het x-y-vlak ruwweg een oppervlakte van 60 μm x 40 μm beslaat.</li>
	<li>Stel de afbeeldingsstapel in de beeldvormings software in op 8-10 vlakken met een interplane-afstand van 4-5 μm. De piëzo-motorische doelstelling stopt op elk niveau op de z-as om het beeld van elk vlak te verwerven. De bemonsteringsfrequentie is 1 s per stapel en de pixel resolutie in het x-y-vlak is 0,2-0,3 μm (Figuur 2A). Een opname omvat normaalgesproken 10 pre-Puff afbeeldingsstapels en 150 post-Puff afbeeldingsstapels.</li>
</ol>6. gegevensverwerking
<ol><li>Gegevens verwerken met behulp van op maat gemaakte analytische software. Afvlakken van elke afbeeldingsstapel in één afbeelding door projectie met maximale intensiteit (Figuur 2B). Teken een rechthoekig gebied van belang (ROI) met een breedte van 3 μm loodrechte over het betreffende vaartuig (Figuur 2C).</li>
	<li>Om interferentie door schaduwen van rode bloedcellen en kleine trillingen van de cortex te minimaliseren, gemiddelde de rechthoekige ROI door het te projecteren in één regel, die vervolgens het gemiddelde Profiel van het vaartuig segment vertegenwoordigt. Doe dit voor elke afbeelding met maximale intensiteit.</li>
	<li>Plot de profiel lijnen als een 2D-afbeelding met de x-as die maximale intensiteit beelden in chronologische volgorde vertegenwoordigt (Figuur 2D, bovenste paneel). Gebruik een actieve contour algoritme (Chan-Vese segmentatie) om de randen van het vat te vinden8,9 (aangegeven door rode bochten; Figuur 2 D, bovenste paneel).</li>
	<li>Bereken de tijdsduur van de diameter verandert als het verschil tussen de randen van de bloedvat (verticale afstand tussen de bovenste en onderste rode krommen in Figuur 2D, onderste paneel). Normaliseren diameter wijzigingen in voor-puffing diameter basislijn en plot curven van diameter verandering in de tijd. Doe dit voor elke ROI (Figuur 2E).</li>
	<li>De respons amplitude van het vat wordt na het puffen gedefinieerd als de hoogste/laagste piek amplitude. De respons latentie wordt gedefinieerd als de latentie van de halve Max amplitude (afbeelding 2G). Volg handmatig de geskeletteerde vasculaire structuur door knopen langs de vaten te plaatsen (Figuur 2F) en de geografische afstand tussen elke ROI en de penetrerende Arteriole te meten. Bereken de snelheid van CVR door de afstanden te delen door latentie verschillen.</li>
</ol>7. virale vector injectie
<ol><li>Om gelijktijdig astrocytische calcium responsen te bestuderen, injecteert u een volume van 0,6 μL virale vector (pZac 2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f, Addgene) in de Somatosensorische cortex van NG2DsRed muizen, na de standaard stereotactische virale vector injectieprocedure 10.</li>
	<li>Na drie weken, de astrocyten in de muis Somatosensorische cortex Express de genetisch gecodeerde calcium indicator, GCaMP6f. Volg de bovengenoemde chirurgische ingreep en Two-photon Imaging voor muizen. Om onderscheid te maken tussen astrocyten en het vat lumina, wordt TRITC-dextran in plaats van FITC-dextran gebruikt voor het vlekken van het vat Lumina Red.</li>
</ol>

<ol><li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Function+of+the+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Structure and Function of the Blood-Brain Barrier.</a> Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).</li>
<li>Hall, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+Pericytes+Regulate+Cerebral+Blood+Flow+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Capillary Pericytes Regulate Cerebral Blood Flow in Health and Disease.</a> Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).</li>
<li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation-Induced+Increases+in+Cerebral+Blood+Flow+and+Local+Capillary+Vasoconstriction+Depend+on+Conducted+Vascular+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stimulation-Induced Increases in Cerebral Blood Flow and Local Capillary Vasoconstriction Depend on Conducted Vascular Responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (25), 5796-5804 (2018).</li>
<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Two-Photon+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In Vivo Two-Photon Calcium Imaging of Neuronal Networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li>
<li>Mathiesen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-Dependent+Increases+in+Local+Oxygen+Consumption+Correlate+with+Postsynaptic+Currents+in+the+Mouse+Cerebellum+in+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-Dependent Increases in Local Oxygen Consumption Correlate with Postsynaptic Currents in the Mouse Cerebellum in Vivo.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18327-18337 (2011).</li>
<li>Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Patch-Clamp+Recordings+and+Single-Cell+Electroporation+of+Unlabeled+Neurons+in+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Targeted Patch-Clamp Recordings and Single-Cell Electroporation of Unlabeled Neurons in Vivo.</a> Nature Methods. 5 (1), 61-67 (2008).</li>
<li>Norup Nielsen, A., Lauritzen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+and+Uncoupling+of+Activity-Dependent+Increases+of+Neuronal+Activity+and+Blood+Flow+in+Rat+Somatosensory+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Coupling and Uncoupling of Activity-Dependent Increases of Neuronal Activity and Blood Flow in Rat Somatosensory Cortex.</a> The Journal of Physiology. 533 (3), 773-785 (2001).</li>
<li>Wang, X. F., Huang, D. S., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Efficient+Local+Chan-Vese+Model+for+Image+Segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Pattern+Recognition%22%5BJournal%5D)">An Efficient Local Chan-Vese Model for Image Segmentation.</a> Pattern Recognition. 43 (3), 603-618 (2010).</li>
<li>Chan, T. E., Sandberg, B. Y., Vese, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+Contours+without+Edges+for+Vector-Valued+Images%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Communication+and+Image+Representation%22%5BJournal%5D)">Active Contours without Edges for Vector-Valued Images.</a> Journal of Visual Communication and Image Representation. 11 (2), 130-141 (2000).</li>
<li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+Gene+Delivery+in+the+Rodent+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic Gene Delivery in the Rodent Brain.</a> Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li>
<li>Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+Role+for+the+Vascular+Endothelium+in+Functional+Neurovascular+Coupling+in+the+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">A Critical Role for the Vascular Endothelium in Functional Neurovascular Coupling in the Brain.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (3), 000787(2014).</li>
<li>Lind, B. L., Brazhe, A. R., Jessen, S. B., Tan, F. C., Lauritzen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Stimulus-Evoked+Astrocyte+Ca2%2B+Elevations+and+Hemodynamic+Responses+in+Mouse+Somatosensory+Cortex+in+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid Stimulus-Evoked Astrocyte Ca2+ Elevations and Hemodynamic Responses in Mouse Somatosensory Cortex in Vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (48), 4678-4687 (2013).</li>
<li>Stobart, J. L., Ferrari, K. D., Barrett, M. J. P., Gluck, C., Stobart, M. J., Zuend, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+Circuit+Activity+Evokes+Rapid+Astrocyte+Calcium+Signals+on+a+Similar+Timescale+to+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cortical Circuit Activity Evokes Rapid Astrocyte Calcium Signals on a Similar Timescale to Neurons.</a> Neuron. 98 (4), 726(2018).</li>
<li>Bouchard, M. B., Voleti, V., Mendes, C. S., Lacefield, C., Grueber, W. B., Mann, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swept+Confocally-Aligned+Planar+Excitation+%28Scape%29+Microscopy+for+High+Speed+Volumetric+Imaging+of+Behaving+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Swept Confocally-Aligned Planar Excitation (Scape) Microscopy for High Speed Volumetric Imaging of Behaving Organisms.</a> Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een uitdaging voor vasculaire studies is de precieze meting van de diameter van het vat. De methode die we hier beschrijven gebruikten een gemotoriseerde piëzo-doelstelling om snelle en repetitieve hyperstack-beeldvorming te maken met twee fotonmicroscopie. Ten eerste, deze methode maakt herhaalde onderzoeken van de penetrerende Arteriole, 1St orde en 2ND orde capillairen zonder verlies van focus en leidde tot de ontdekking van langzaam uitgevoerde vasculaire reacties in capillairen in vivo. Ten twe...

De hersenen hebben een hoog energieverbruikpercentage. Ongeveer 20% van de zuurstof en 25% van de glucose verbruikt door het menselijk lichaam zijn gewijd aan de hersenfunctie, terwijl de hersenen slechts 2% van de totale lichaamsmassa inneemt. Het behoud van de normale hersenfunctie vereist een voldoende en efficiënte toevoer van zuurstof en voeding door de bloedtoevoer in een complex netwerk van schepen. Lokale hersenactiviteit en cerebrale doorbloeding (CBF) zijn robuust gekoppeld, afhankelijk van de functionele eigenschappen van neuronen, astrocyten, pericytes, gladde spiercellen (Smc's) en endotheel cellen (ECs)1. Onlangs zijn de eerste paar orders van capillairen vertakkingen van penetrerende arteriolen ontstaan als een ' hotspot '2, met actieve regulering van capillaire bloedstroom. Een traag uitgevoerde vasculaire respons (CVR) werd ontdekt in deze ' hotspot ' in de muis Somatosensorische cortex tijdens zowel whisker stimulatie en lokale ejectie (puffing) van ATP met een glazen micro-pipet3.
Hoewel in vivo imaging by Two-photon laser scanning fluorescerende microscopie is op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van neurovasculaire reacties in de hersenschors, de meeste van de studies gemeten bloedvat diameters en onderzocht hun verordening in een tweedimensionaal (2D) x-y-vlak. De uitdagingen zijn: ten eerste, cerebrale bloedvaten en hun omarmen astrocyten, pericytes en SMCs construeren takken in drie dimensies (3D). Het is daarom van cruciaal belang om hun interacties in 3D te bestuderen. Ten tweede zal zelfs een kleine hoeveelheid drift in de focus de precieze meting van zowel de diameter van het vaartuig als de cellulaire fluorescerende signalen beïnvloeden. Tot slot zijn de CVRs snel en verreikend in drie dimensies. 3D-volume scanning is optimaal voor het opsporen van Cvr's en het ontdekken van hun mechanismen. We implementeerden een piëzo-motorische doelstelling in een twee-Fobe Microscoop om de muis Somatosensorische cortex in vivo te bestuderen, waardoor precieze diameter metingen mogelijk werden door maximale intensiteits projecties van de verkregen beelden.
Glas micro-pipetten zijn vaak gebruikt voor in vivo hersenstudies, bijvoorbeeld om organische kleurstoffen in bulk te laden4, EEGs5 op te nemen en voor patch klemmen6. Niettemin, beperkingen blijven. Gewoonlijk wordt de punt van de glazen micro-pipet onrustig geplaatst of wordt de micro pipet niet gebruikt voor lokale ingrepen. Hier hebben we de procedure voor het inbrengen van micropipetten en lokale uitwerpen geoptimaliseerd.
Bovendien biedt de combinatie van 3D twee-photon microscopie en genetisch gecodeerde fluorescerende indicatoren een ongekende kans om neurovasculaire koppeling in een 3D-scope te onderzoeken. In deze studie, we profiteerde van deze en geïnjecteerd virale vectoren die astrociet specifieke genetisch gecodeerde calcium indicatoren in de muis Somatosensorische cortex. Astrocyten en de diameter van het vat werden gelijktijdig afgebeeld door verschillende fluorescerende markers te combineren.
Over het algemeen presenteren we een geoptimaliseerde methode van lokale ejectie (puffing) door glazen micro-pipet en snelle Two-photon hyperstack Imaging, die nauwkeurige meting van capillaire diameter wijzigingen mogelijk maakt. Daarnaast biedt onze methode een nieuwe tool om tegelijkertijd 3D-profielen van CA2 + -reacties in astrocyten en vasculaire diameter reacties te bestuderen.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Sigma&ndash;Aldrich</td><td>A6138</td><td>Aanbrengen op de blootgestelde cortex voor bescherming</td></tr><tr><td>Alexa 594</td><td>Life Technologies</td><td>A-10438</td><td>Kleurstof voor het verven van het opblaasbare compound naar rood fluorescerend</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>Vasodilator en vasoconstrictor, opblaasbaar compound</td></tr><tr><td>Cyanoacrylaatlijm en activator</td><td>Loctite</td><td>Adhesives en SF7452</td><td>Lijm voor metalen onderdeel en dekglas</td></tr><tr><td>Oogsmeer</td><td>Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denemarken</td><td></td><td>De ogen van de muis vochtig houden</td></tr><tr><td>FITC-dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD500S</td><td>Kleurstof voor bloedserum, groen fluorescerend</td></tr><tr><td>NG2DsRed muizen</td><td>Jackson Laboratory</td><td>8241</td><td>Deze transgene muizen drukken een rood fluorescerend eiwitvariant (DsRed) uit onder controle van de muis NG2 (Cspg4) promotor</td></tr><tr><td>pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f</td><td>Addgene</td><td>52924-AAV5</td><td>Astrocyt-specifieke virale vectoren met genetisch gecodeerde calciumindicatoren</td></tr><tr><td>TRITC-dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52194</td><td>Kleurstof voor bloedserum, rood fluorescerend</td></tr><tr><td>Lijst van apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luchtpomp</td><td>WPI</td><td>PV830</td><td>Luchtdruk geven voor het opblazen van de pipet</td></tr><tr><td>Bloedgasanalysator</td><td>Radiometer</td><td>ABL 700</td><td>Meet niveaus van bloedgas</td></tr><tr><td>Bloeddrukmeter</td><td>World Precision Instruments</td><td>BP-1</td><td>Controleer de arteriële bloeddruk</td></tr><tr><td>Lichaamstemperatuurregelaar</td><td>CWE</td><td>Model TC-1000</td><td>Houd de lichaamstemperatuur van de muis binnen fysiologische grenzen</td></tr><tr><td>Capnograaf</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Type 340</td><td>Controleer het eind-expiratoire CO2 van de muis</td></tr><tr><td>Elektrische stimulator</td><td>A.M.P.I.</td><td>ISO-flex</td><td>Toepassen van snorhaarkussentjestimulatie</td></tr><tr><td>Mechaanse ventilator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>D-79232</td><td>Mechaans beademen van de muis binnen fysiologische grenzen</td></tr><tr><td>Micropipettrekker</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Twee-fotonmicroscoop</td><td>Femtonics Ltd</td><td>Femto3D-RC</td><td></td></tr><tr><td>Lijst van chirurgische instrumenten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anatomisch pincet</td><td>Lawton</td><td>09-0007</td><td></td></tr><tr><td>Gevlochten en gebalanceerd pincet</td><td>S&amp;T AG</td><td>00595 FRAS-18 RM-8</td><td></td></tr><tr><td>Iris schaar</td><td>Lawton</td><td>05-1450</td><td></td></tr><tr><td>Microvasculaire klem</td><td>S&amp;T AG</td><td>462</td><td></td></tr><tr><td>Vasculaire katheters voor muizen</td><td>Verutech</td><td>100828</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo drie-dimensionale twee-fotonmicroscopie om uitgevoerde vasculaire responsen te bestuderen door lokale atp-ejectie met behulp van een glazen micro pipet

In Vivo Three-Dimensional Two-Photon Microscopy to Study Conducted Vascular Responses by Local ATP Ejection Using a Glass Micro-Pipette

Het behoud van de normale hersenfunctie vereist een voldoende en efficiënte toevoer van zuurstof en voeding door een complex netwerk van schepen. Echter, de regulering van cerebrale doorbloeding (CBF) is niet volledig begrepen, vooral op het capillaire niveau. Two-photon microscopie is een krachtig hulpmiddel op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van CBF en de verordening. Momenteel wordt dit veld beperkt door het ontbreken van in vivo twee-fotonen microscopie studies die onderzoeken (1) CBF-responsen in drie dimensies, (2) voerden vasculaire reacties uit en (3) gelokaliseerde interventies binnen het vasculaire netwerk. Hier beschrijven we een 3D in vivo-methode met behulp van twee-fotonmicroscopie om uitgevoerde vasculaire reacties te bestuderen die worden opgewekt door lokale uitwerpen van ATP met een glazen micro pipet. Onze methode maakt gebruik van snelle en repetitieve hyperstack Two-photon Imaging voor nauwkeurige diameter metingen door de maximale intensiteit projectie van de verkregen beelden. Bovendien tonen we aan dat deze methode ook kan worden gebruikt om 3D astrocytische calcium responsen te bestuderen. We bespreken ook de voordelen en beperkingen van het inbrengen van glazen micropipetten en twee Fobe hyperstack-beeldvorming.

Nadat de operatie voltooid was, werden muizen getransporteerd naar twee-photon Microscoop (Figuur 1A). Er werd een glazen micro pipet met 1 mM ATP in de nabijheid van het bestemmings bloedvat op de doellocatie ingebracht (Figuur 1B).
We voerden hyperstack Imaging uit terwijl we een Puff van 1 mM ATP gaven (afbeelding 2a, aanvullende video 1</stron...

We presenteren een geoptimaliseerde lokale ejectieprocedure met behulp van een glazen micro-pipet en een snelle twee-fotonen hyperstack-beeldvormings methode, die nauwkeurige meting van veranderingen in de capillaire diameter mogelijk maakt en het onderzoek van de verordening in drie dimensies.

In vivo drie-dimensionale twee-Fotonmicroscopie om uitgevoerde vasculaire responsen te bestuderen door lokale ATP-ejectie met behulp van een glazen micro pipet

Maintenance of normal brain function requires a sufficient and efficient supply of oxygen and nutrition by a complex network of vessels. However, the ...

Dit protocol is ontworpen om de langzaam uitgevoerde vasculaire reacties in cerebrale haarvaten veroorzaakt door lokale uitwerping van ATP te bestuderen. Het voordeel van deze techniek is om lokale synaptische activiteiten te simuleren door lokale pipet-uitwerping en om het karige vat scherp te houden door 3D twee-foton microscopie. Deze methode kan ook worden gebruikt voor het bestuderen van cerebrale neuroma en gliaactiviteit in rust en bij stimulatie in drie dimensies. Het aantonen van de procedure zal Michael L.

in-vivo-three-dimensional-two-photon-microscopy-to-study-conducted

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een nieuwe veelzijdige methode voor het observeren van de microcirculatie wordt gepresenteerd. Het wordt beschouwd als geschikt voor waarneming op lange termijn, en voor de combinatie met pharmacophysiological of moleculaire biologische interventies.

In vivo micro-circulatie meting in de skeletspier door Intra-vitale Microscopie

Om te begrijpen netwerk dynamiek van microcircuits in de neocortex, is het essentieel om tegelijkertijd op te nemen van de activiteit van een groot aantal neuronen. In-vivo twee-foton calcium beeldvorming is de enige methode die het mogelijk maakt een op te nemen van de activiteit van een dichte neuronale populatie met single-cell resolutie.

In vivo 2-Photon Imaging Calcium in Layer 2 / 3 van Muizen

Microiontophoresis betekent verplaatsing van ionen uit een micropipet in reactie op een verschil in elektrische potentiaal tussen de binnen-en buitenkant van de micropipet. Biologisch actieve moleculen worden daarbij geleverd in verhouding tot elektrische stroom. We illustreren acetylcholine microiontophoresis in combinatie met micromanipulatie tot endotheel-afhankelijke vasodilatatie studie in de microcirculatie.

Microiontophoresis en Micromanipulatie voor intravitale Fluorescentie Imaging van de microcirculatie

In dit artikel presenteren we een methode om tumor bloedvaten analyseren in vivo met behulp van dynamische contrast-verbeterde fluorescentie videomicroscopie. Twee kwantitatieve parameters werden overgenomen: functionele capillaire dichtheid als gevolg van de doorbloeding van de tumor, en de index lekkage als gevolg van de lekkage van de endotheliale wand.

In vivo beeldvorming van tumorale angiogenese met behulp van fluorescentie confocale videomicroscopie

Vasculaire celfunctie is afhankelijk van de activiteit van intracellulaire boodschappers. Hier wordt een ex vivo twee-foton beeldvormingsmethode beschreven die de meting van intracellulaire calcium- en stikstofmonoxideniveaus mogelijk maakt in reactie op fysiologische en farmacologische stimuli in individuele endotheel- en gladde spiercellen van een geïsoleerde aorta.

Twee-foton Imaging van intracellulaire Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Behandeling en stikstofoxide productie in endotheelcellen en gladde spiercellen van een geïsoleerd Rat Aorta

Primaire humane umbilicale veneuze endotheelcellen (HUVEC's) werden gekweekt tot confluentie binnen een microfluïdisch netwerkapparaat. De endotheliale celverbinding en F-actine-verdelingen werden geïllustreerd en de veranderingen in intracellulaire calciumconcentratie en stikstofmonoxideproductie als reactie op adenosinetrifosfaat (ATP) werden gequantificeerd in real-time op individueel cellniveau.

Ontwikkeling en karakterisering van<em&gt; In Vitro</em&gt; Microvaatje Netwerk- en kwantitatieve metingen van endotheliale [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; En productie van stikstofoxide

Dit protocol beschrijft het gebruik van multiphoton microscopie tot uitgebreide time-lapse beeldvorming van meercellige interacties uit te voeren in real time, in vivo bij enkele resolutie cel.

Extended Time-lapse intravitale Imaging van Real-time Meercellige Dynamiek in de tumor micro

Dit protocol beschrijft de intravital beeldvorming van transgene muizen uiting van cel-specifieke fluorescente markeringen. Intravital imaging biedt een niet-invasieve methode voor hoge resolutie waarnemingen in levende dieren met behulp van implanteerbare windows waardoor de microscopische visualisatie van de processen mogelijk is. Deze methode is vooral handig om longitudinale processen te bestuderen.

Intravital microscopie van Tumor-geassocieerde therapieën met behulp van geavanceerde dorsale huidplooien venster Chambers op transgene fluorescerende muizen

Microglia, de resident immuuncellen van de hersenen, reageren snel met de morfologische veranderingen voor wijzigingen van hun omgeving. Dit protocol wordt beschreven hoe u twee-foton microscopie te bestuderen van de aantrekkingskracht van microglial processen naar serotonine of ATP in acute hersenen plakjes van muizen.

Twee-foton beeldvorming van Microglial processen attractie naar ATP of serotonine in Acute hersenen plakjes

De rekrutering van leukocyten en bloedplaatjes vormt een essentieel onderdeel dat nodig is voor de effectieve groei van collaterale slagaders tijdens arteriogenese. Multifotonenmicroscopie is een efficiënt hulpmiddel voor het volgen van celdynamica met een hoge spatio-temporele resolutie in vivo en minder fototoxiciteit om leukocytenrekrutering en extravasatie tijdens arteriogenese te bestuderen.

Multifoton intravitale beeldvorming voor het monitoren van leukocytenrekrutering tijdens arteriogenese in een Murine Hindlimb-model

Dit protocol bevat een grondige beschrijving van een stapsgewijze aanpak voor een chronisch craniaal venster- en microvasculaire emboliemodel van een muismodel, geoptimaliseerd voor in vivo tweefotonmicroscopie met fluorescerende polystyreenmicrosferen.

Microvasculaire embolisme Muizenmodel voor in vivo tweefotonmicroscopie met fluorescerende polystyreenmicrosferen

Leer drie-dimensionale twee-fotonmicroscopie om vasculaire responsen in cerebrale capillairen te bestuderen via lokale ATP-ejectie. Deze methode simuleert synaptische activiteit en helpt onderzoekers neurovasculaire interacties in vivo begrijpen.

In vivo drie-dimensionale twee-Fotonmicroscopie om uitgevoerde vasculaire responsen te bestuderen door lokale ATP-ejectie met behulp van een glazen micro pipet (Video) | JoVE Journal

In vivo drie-dimensionale twee-Fotonmicroscopie om uitgevoerde vasculaire responsen te bestuderen door lokale ATP-ejectie met behulp van een glazen micro pipet

Meer video's verkennen