Name: Snelle lipide Droplet isolatie Protocol met behulp van een gerenommeerd organel isolatie Kit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Leer een snelle methode voor lipide druppel isolatie uit muizenlever met een aangepaste ER-kit. Deze techniek maakt gelijktijdige zuivering van meerdere organellen mogelijk voor onderzoek naar metabole ziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de Abramson familie Cancer Research Institute. Dit werk wordt ondersteund door de volgende subsidies: NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, Robert Wood Johnson Foundation Harold Amos medische faculteit Development Award, 7158, IDOM DRC Pilot Award P30 DK019525 (R.C.M.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (J.C.). Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de NIH P30-DK050306 en de faciliteiten van de kern (moleculaire pathologie en Imaging Core, moleculaire biologie/gen expressie Core en cel cultuur Core) en haar piloot verlenen programma. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

Alle experimenten werden uitgevoerd op een laboratorium bankje met persoonlijke beschermingsmiddelen die geschikt is voor bioveiligheidsniveau 1, met inbegrip van een lab-jas, handschoenen en veiligheidsbril. Experimenten werden uitgevoerd volgens de protocollen die zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Pennsylvania. Alle inspanningen werden gedaan om het dier ongemak te minimaliseren, en de dieren werden behandeld met humane zorg.
1. LD isolatie met behulp van een ER isolatie kit
<ol><li>
Voorbereiding Opmerking: De genoemde bedragen zijn geschikt voor een enkele 1 g muis lever.<ol>
<li>10 mL 1 x isotone extractie buffer (IE buffer, uit de ER isolatie kit) voor te bereiden door 2 mL 5 x IE buffer met 8 mL ultrazuiver water verdunnen. Koel de buffer door deze te plaatsen op het ijs.</li>
		<li>100 mL, 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) voor te bereiden door 10 mL 10 x PBS in 90 mL ultrazuiver water verdunnen. Koel het door deze te plaatsen op het ijs.</li>
		<li>10 mL 5% polyethyleenglycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-fenyl ether (PGPE) bereid door verdunnen 500 µL van PGPE in 9.5 mL ultrazuiver water. Gebruik een 1 mL spuit om te meten uit PGPE aangezien het viskeus. Koel het door deze te plaatsen op het ijs.</li>
		<li>Alle buizen cool door ze te plaatsen op het ijs: 1,7 mL microcentrifuge buizen, centrifuge buizen van 15 mL en 50 mL high-speed centrifuge buizen 13 mL ultracentrifuge buizen.</li>
		<li>Cool alle vereiste centrifuges tot en met 4 ° C: een microcentrifuge, een hoge capaciteit centrifuge voor 15 mL tubes, een snelle centrifuge voor 50 mL buizen en een ultracentrifuge.</li>
		<li>Pincet en dissectie schaar in autoclaaf steriliseren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Weefsel voorbereiding
	<ol>
<li>De muis door deze te plaatsen in een kamer gevuld met 100% CO2 voor 10 min. bevestigen euthanasie door het uitvoeren van cervicale dislocatie euthanaseren.</li>
		<li>Met behulp van steriele pincet en dissectie schaar, snijden de lagen van de huid en spieren van de buik op de achterste/anterior as bloot van de lever.</li>
		<li>Snijd de ligamenten die de lever verbinden met het middenrif en de darm. Gebruik pincet te trekken van de darm uit de buurt van de lever, richting de posterior, bloot de ligamenten.</li>
		<li>Gesneden tussen de lever en de dorsale ribbenkast, verplaatsen van anterior to posterior totdat de lever is bevrijd.</li>
		<li>De lever overbrengen in een koude 5 cm petrischaal met 10 mL koude 1 x PBS.</li>
		<li>Wassen van de lever 2 x op een rockende platform in 10 mL koude 1 x PBS voor 5 min bij 4 ° C in de 5 cm petrischaal. Giet af 1 x PBS na de laatste wasbeurt.</li>
		<li>Gebruik een steriele chirurgische mes grootte-10 (Zie de Tabel van materialen) aan de lever dobbelstenen in 3 – 5 mm stukken in de 5 cm petrischaal (figuur 1A).</li>
		<li>Wassen van de blokjes lever 2 x met 10 mL koude 1 x PBS voor 5 min bij 4 ° C in de 5 cm petrischaal. Opmerking: Voor lysosoom isolatie, 0,5 g lever overbrengen in een schone 45 mL homogenizer en volg de aanwijzingen geleverd door het lysosoom extractie kit (Zie de Tabel van de materialen).</li>
		<li>1 x PBS decanteren en breng de blokjes lever stukken naar de koude 45 mL Dounce homogenizer. Zorgen dat alle stukken Ga naar de onderkant van de homogenizer.</li>
		<li>Voeg 7 mL koude 1 x IE buffer (uit de ER isolatie kit) en meng op ijs door het bewegen van de stamper op en neer 20 x. Zorg ervoor dat de stamper naar de onderkant van de homogenizer tijdens elke streek gaat.</li>
		<li>Het homogenaat (figuur 1B) overbrengen in een centrifugebuis koude 15 mL.</li>
		<li>Spoel de homogenizer met 1 mL koude 1 x IE buffer (uit de ER isolatie kit) en voeg dit toe aan de rest van het homogenaat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
LD isolatie
	<ol>
<li>Verwijder de kernen door centrifugering van het homogenaat in een centrifuge van de hoge capaciteit bij 1.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C (Figuur 1 c).</li>
		<li>Het postnuclear supernatant (PNS) overbrengen in een centrifugebuis nieuwe, koude 50 mL. LD om verlies te voorkomen, ervoor zorgen dat elke lipide verzamelden zich bij de bovenkant van de tube van 15 mL is geresuspendeerde vóór de overbrenging van de PNS.</li>
		<li>Neem een 100 µL aliquoot van de PNS zuiverheid p.a. en plaats het in een koude 1,7 mL microcentrifuge buis. Zet het opzij op het ijs.</li>
		<li>Als u wilt verwijderen van mitochondriën, Centrifugeer het PNS monster, niet het afgepipetteerde deel, in een gekoelde snelle centrifuge op 12.000 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C.<ol>
<li>Optioneel: voor ruwe LD (CLD) isolaten (met cytosol en celmembraan besmetting), de bovenste lipide-laag met behulp van een precisiepipet glas verzamelen en overbrengen naar een tube van 1,7 mL microcentrifuge. Blijven sectie 1.4.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Het postmitochondrial supernatant (PMS) overbrengen in een buis van de ultracentrifuge. LD om verlies te voorkomen, ervoor zorgen dat elke lipide verzameld aan de bovenkant is geresuspendeerde vóór de overbrenging van het PMS.</li>
		<li>Neem een 100 µL aliquoot van de PMS zuiverheid p.a. en plaats het in een koude 1,7 mL microcentrifuge buis. Zet het opzij op het ijs.</li>
		<li>Vul een ultracentrifuge buis aan de rand met koude 1 x IE buffer om te voorkomen dat de buis bezwijken tijdens ultracentrifugatie.</li>
		<li>Evenwicht van de monsters en centrifugeer ze in een ultracentrifuge bij 100.000 x g gedurende 60 min bij 4 ° C (Figuur 1 d).</li>
		<li>Als u wilt verwijderen van de LD-laag, kantelen van de buis onder een hoek van 45° en gecombineerd met een glazen pipet. De pellet overbrengen in een koude 1,7 mL microcentrifuge buis. Opmerking: De pellet bevat geïsoleerde ER. Gebruik dit gedeelte stroomafwaarts om ER te isoleren.</li>
		<li>Het verzamelen van 100 µL van het supernatans dat post-ER (PER) onder de lipide-laag voor zuiverheid analyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
LD wassen
	<ol>
<li>1 x PBS op de breuk van de LD verzameld in een 1.7 microcentrifuge buis, tot een totaal volume van 1.3 mL toevoegen.</li>
		<li>Vortex het monster.</li>
		<li>Centrifugeer in een microcentrifuge op topsnelheid gedurende 5 minuten bij 4 ° C tot elke cel puin pellet. Warm de tube zachtjes met de handen om te helpen resuspendeer de LD-laag. Overdracht van de bovendrijvende substantie, met inbegrip van de lipide laag, een nieuwe 1,7 mL microcentrifuge buis.</li>
		<li>Herhaal stappen 1.4.1–1.4.3 2 x-3 x, totdat de pellet is niet meer zichtbaar.</li>
		<li>1 x PBS aan de pellet-vrije LD supernatant tot een eindvolume van 1,5 mL toevoegen. Wassen van de lipide breuk door centrifugeren in een microcentrifuge op topsnelheid gedurende 5 minuten bij 4 ° C.</li>
		<li>Verwijder 1 mL 1 x PBS (onder de lipid layer) met een glazen pipet zonder verstoring van de lipide-laag.</li>
		<li>Herhaal stap 1.4.5 en 1.4.6 4 x-5 x, totdat de 1 x PBS is visueel transparant met geen turbiditeit.</li>
		<li>Verwijder alle PBS van de 1 x onder de lipide-laag, met behulp van een glazen pipet (figuur 1E).</li>
		<li>Het resultaat, een zuivere LD Fractie, stroomafwaarts p.a. gebruiken</li>
	</ol>
</li>
	<li>
LD eiwit kwantificatie door zure test van bicinchoninic Opmerking: Gebruik geen een bicinchoninic zuur assay (BCA) als LD morfologie worden beoordeeld.<ol>
<li>Resuspendeer de LD in 500 μL van 5% PGPE.</li>
		<li>Kook de monsters gedurende 5 minuten bij 95 ° C, vortex, en broeden van de monsters bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten afkoelen.</li>
		<li>Herhaal stap 1.5.2 een extra 2 x.</li>
		<li>Bewerk ultrasone trillingen ten de monsters gedurende 5 minuten met een 30 s in- / uitschakelen cyclus, bij een gemiddelde intensiteit.</li>
		<li>Normaliseren de monsters door het meten van de eiwitconcentratie in alle zuiverheid analyse monsters en in de LD-fractie door BCA assay.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. LD isolatie met behulp van sacharose dichtheid verloop
<ol><li>
Voorbereiding
	<ol>
<li>Breng 200 mL TE buffer (10 mM Tris-HCl [pH 7.4], 1 mM EDTA [pH 8,0]). Koel het door deze te plaatsen op het ijs.</li>
		<li>100 mL van 60% (m/v) sacharoseoplossing in buffer TE maken door ontbinding van 60 g van sacharose in TE buffer, het eindvolume te brengen tot 100 mL. Koel het door deze te plaatsen op het ijs.</li>
		<li>6 mL sacharoseoplossing 40% (m/v) door toevoeging van 4 mL van 60% sucrose aan 2 mL buffer TE maken. Koel het door deze te plaatsen op het ijs.</li>
		<li>6 mL sacharoseoplossing 25% (m/v) door toevoeging van 2.5 mL van 60% sucrose aan 3,5 mL buffer TE maken. Koel het door deze te plaatsen op het ijs.</li>
		<li>4 mL 10% (m/v) sacharoseoplossing door toevoeging van 0,7 mL van 60% sucrose 3,3 ml buffer TE maken. Koel het door deze te plaatsen op het ijs.</li>
		<li>10 mL protease en phosphatase remmer oplossing door toevoeging van een tablet van zowel protease en phosphatase inhibitors tot 10 mL van de buffer TE maken.</li>
		<li>Bereiden weefsel homogenaat buffer door toevoeging van 4 mL protease en phosphatase remmer oplossing aan 50 mL stockoplossing van 60% sucrose. Koel het door deze te plaatsen op het ijs.</li>
		<li>Overlay buffer door toevoeging van 2 mL van protease en phosphatase remmer oplossing aan 50 mL buffer TE bereiden. Koel het door deze te plaatsen op het ijs.</li>
		<li>100 mL 1 x PBS bereid door verdunning van 10 mL 10 x PBS in 90 mL ultrazuiver water. Koel het door deze te plaatsen op het ijs.</li>
		<li>Bereiden van 10 mL 5% PGPE door verdunnen 500 µL van PGPE in 9.5 mL ultrazuiver water. Gebruik een 1 mL spuit om te meten uit PGPE aangezien het viskeus. Koel het door deze te plaatsen op het ijs.</li>
		<li>De volgende centrifuge buizen cool door ze te plaatsen op het ijs: 1,7 mL microcentrifuge buizen, centrifuge buizen van 15 mL en 50 mL high-speed centrifuge buizen 13 mL ultracentrifuge buizen.</li>
		<li>Koel de vereiste centrifuges tot en met 4 ° C: een microcentrifuge, een hoge capaciteit centrifuge (voor 15 mL tubes), een snelle centrifuge (voor 50 mL tubes) en een ultracentrifuge.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Weefsel voorbereiding
	<ol>
<li>Gebruik de stappen 1.2.1–1.2.9 voor te bereiden op het weefsel homogenisering.</li>
		<li>Voeg 7 mL koude weefsel homogenaat buffer en meng het op ijs door het bewegen van de stamper op en neer 20 x. Tijdens de eerste vijf lijnen, waarborgen dat de stamper gaat naar de onderkant van de homogenizer.</li>
		<li>Het homogenaat overbrengen in een centrifugebuis koude 15 mL.</li>
		<li>Spoel de homogenizer met 1 mL koude weefsel homogenaat buffer en het overbrengen van de centrifugebuis eerder gebruikte 15 mL.</li>
		<li>Breng het volume van het homogenaat tot 10 mL met weefsel homogenaat buffer.</li>
		<li>Centrifugeer het monster in een centrifuge van de hoge capaciteit bij 1.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.</li>
		<li>8 mL van het supernatans overbrengen in een centrifugebuis 50 mL.</li>
		<li>Overdragen 100 µL van de resterende bovendrijvende substantie als PNS ingewogen analysemateriaal zuiverheid.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sacharose verloop
	<ol>
<li>De 50 mL centrifugebuis waarin de 8 mL PNS in een hoek van 45° te kantelen. Voeg voorzichtig 6 mL 40% sacharoseoplossing, ervoor te zorgen dat de twee fasen gescheiden blijven.</li>
		<li>Op een gelijkaardige manier, Voeg langzaam 6 mL 25% sacharoseoplossing; Voeg vervolgens 4 mL 10% sacharoseoplossing; Ten slotte voeg 8 mL overlay buffer.</li>
		<li>Centrifugeer het monster in een high-speed centrifuge bij 30.000 x g bij 4 ° C gedurende 30 minuten.</li>
		<li>Overdracht van de bovenste laag met de LDs tot een koker van 1,7 mL microcentrifuge.</li>
		<li>Voor het wassen van de LD, volg de stappen in sectie 1.4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Lipid+Droplets+from+Cells+by+Density+Gradient+Centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation.</a> Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+lipid+droplets+from+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolating lipid droplets from multiple species.</a> Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).</li>
<li>Gao, Q., Goodman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+droplet-a+well-connected+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The lipid droplet-a well-connected organelle.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49(2015).</li>
<li>Correnti, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+and+C2+ceramide+activate+fatty+acid+oxidation+in+human+hepatoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12923(2018).</li>
<li>Williams, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+ceramide+synthase+6+in+mouse+and+human+alcoholic+steatosis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis.</a> FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).</li>
<li>Carr, R. M., Ahima, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+lipid+droplet+proteins+in+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases.</a> Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).</li>
<li>Carr, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perilipin+Staining+Distinguishes+Between+Steatosis+and+Nonalcoholic%5BTitle%5D)+AND+%22Steatohepatitis+in+Adults+and+Children.+Clinical+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic.</a> Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).</li>
<li>Carr, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+TIP47+improves+hepatic+steatosis+and+glucose+homeostasis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Regulatory%2C+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).</li>
<li>Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+perilipin+2+prevents+hepatic+steatosis%2C+glucose+intolerance+and+ceramide+accumulation+in+alcohol-fed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice.</a> PLoS One. 9 (5), e97118(2014).</li>
<li>Tsai, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+constitutive+lipid+droplet+protein+PLIN2+regulates+autophagy+in+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver.</a> Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).</li>
<li>Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).</li>
<li>Liu, K., Czaja, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lipid+stores+and+metabolism+by+lipophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy.</a> Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).</li>
<li>Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cellular+lipid+droplets%3A+two+purification+techniques+starting+from+yeast+cells+and+human+placentas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e509814(2014).</li>
<li>Sato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+lipid+droplet+proteins+in+hepatoma+cell+lines+expressing+hepatitis+C+virus+core+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein.</a> Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).</li>
<li>Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R. 3rd, McManaman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+reveal+a+link+between+the+endoplasmic+reticulum+and+lipid+secretory+mechanisms+in+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells.</a> Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologically+and+Functionally+Distinct+Lipid+Droplet+Subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations.</a> Scientific Reports. 6, 29539(2016).</li>
</ol>

Dr. Carr krijgt ondersteuning van het onderzoek van farmaceutica van de onderscheppen.

Hepatische LD biologie wordt steeds meer erkend als een belangrijke regulator van hepatocellulaire fysiologie in zowel de volksgezondheid als de ziekte. Als bonafide organellen, LDs zijn dynamische interactie met andere cellulaire structuren en bevatten binnen hen bioactieve componenten betrokken bij zowel lipide en glucose homeostase. Het verloop van sacharose wordt routinematig gebruikt voor LD isolatie en kan onderzoekers bestuderen LD structuur, maar het vereist hen om talrijke buffers. We hebben aangetoond dat het g...

LDs zijn bioactieve organellen gevonden in het cytosol meest eukaryotische cellen en sommige prokaryotische cellen1,2,3. De LD-kern bestaat uit neutrale lipiden zoals triglyceriden (TG) en cholesterol esters. Ze bevatten ook Ceramiden, bioactieve lipiden die betrokken zijn bij cellulaire signalering trajecten4,5. LDs zijn omgeven door een fosfolipide enkelgelaagde en bekleed met eiwitten, met inbegrip van de perilipin eiwitten perilipin 2 (PLIN2) en 3 (PLIN3)1,5,6. Ook aanwezig zijn lipogenic enzymen, lipasen en mensenhandel membraaneiwitten die zijn gekoppeld aan verschillende hepatische steatotic ziekten, met inbegrip van vette leverziekte en alcoholische leverziekte hepatitis C3,5 ,6,7,8,9,10.
LDs worden verondersteld om te vormen van de buitenmembraan van de ER en nieuw samengestelde TG afkomstig uit vrije vetzuren ER afkomstige11bevatten. Het blijft echter onbekend of de gepoolde lipiden bud, verbonden blijven, of worden weggesneden uit het ER6,11, waardoor het isolement van LDs vrij van ER technisch uitdagende. Vrije vetzuren kunnen worden bevrijd uit LDs door de inwerking van oppervlakte lipasen energieproductie of membraan synthese te voorzien. Bovendien kunnen de LDs via lipophagy worden afgebroken als een regelgevende mechanisme en voor de productie van vrije vetzuren12.
Naast de ER en lysosomen, zijn er andere organellen — zoals mitochondriën, Endosomen, peroxisomen en het plasma membraan — die zijn te vinden in nauwe samenwerking van LDS-11. Deze strakke polygamie maakt het moeilijk om uit te voeren van een zuivere LD-extractie. Echter, neutrale lipiden aangeboren lage dichtheid kan worden benut via centrifugeren5.
Traditioneel, zijn LDs geïsoleerd met behulp van een sacharose dichtheid kleurovergang1,5,,13. Deze methoden zijn echter niet ontworpen om te isoleren van andere organellen. Bovendien vereisen ze de tijdrovende voorbereiding van reagentia. Dit protocol past een verkrijgbare ER isolatie kit (Zie de Tabel van materialen) om LD isolatie voorzien. We gebruiken de buffer van de extractie geboden door de kit, een LD isolatie stap toe te voegen. Bovendien kan het protocol ook worden gebruikt om ER en lysosomale isolatie met behulp van de dezelfde monsters, waardoor een vollediger beeld van de hele levenscyclus van LDs. Voor het valideren van deze nieuwe methode, assay wij LD opbrengst, de morfologie, de grootte en de zuiverheid. We vergelijken de resultaten die hier gepresenteerd die verkregen met een gebruikte protocol met behulp van een kleurovergang van sacharose voor LD isolatie.
We gebruikten een 10 - tot 12-weken oude, 20 g vrouwelijke C57BL/6 muis gevast voor 16 h (voedsel verwijdering op 17.00 uur voor een 9.00 LD isolatie keer) met gratis toegang tot water. De typische opbrengst voor TG is 0,6 mg/g lever, en voor LD eiwit, het is 0,25 mg/g lever. Dit biedt genoeg materiaal voor 10 ~ immunoblots door SDS-PAGE. Het protocol hieronder details de gebruikte reagentia en een protocol geschikt voor een enkele 1 g lever. Het protocol van de kleurovergang isolatie sacharose is aangepast van Sato14 en Wu15.

<table><tbody><tr><td>BioExpress Vortex Mixer</td><td>GeneMate</td><td>S-3200-1</td><td>Vortex Mixer</td></tr><tr><td>Centrifuge 54242 R</td><td>Eppendorf</td><td>54242 R</td><td>Gekoelde Microcentrifuge Rotor: FA-45-24-11</td></tr><tr><td>Centrifuge Sorvall RC6 +</td><td>Thermo Scientific</td><td>RC6+</td><td>Gekoelde Hoge Snelheid Centrifuge Rotor: F21S-8x50y</td></tr><tr><td>Centrifuge Sorvall Legend RT+</td><td>Thermo Scientific</td><td>Legend RT+</td><td>Gekoelde Hoge Capaciteit Centrifuge Rotor: 75006445 Bucket: 75006441</td></tr><tr><td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma Aldrich</td><td>04 693 116 001</td><td>Protease Inhibitor Tablets</td></tr><tr><td>Diagenode Bioruptur UCD-200</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200</td><td>Sonicatie Systeem</td></tr><tr><td>Dounce Tissue Grinder (45 mL)</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td>Gebruik Losse stamper</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x)</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>Endoplasmic Reticulum Isolation Kit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ER0100</td><td>Voor ER kit Extractie: Bevat: Isotone Extractie Buffer 5X 100 mL Hypotone Extractie Buffer 10 mL Calcium chloride, 2.5 M oplossing 5 mL OptiPrep Dichtheidsgradiënt Medium 100 mL Botsnaald met ronde neus 1 st.</td></tr><tr><td>Externe lichtbron voor fluorescente excitatie</td><td>Leica</td><td>Leica EL6000</td><td></td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1758</td><td>Zoutzuur</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Beeldanalyse Software</td></tr><tr><td>Omgekeerde Modulerende Contrast Microscoop</td><td>Leica</td><td>Leica DM IRB</td><td></td></tr><tr><td>Lysosome Enrichment Kit voor Weefsels en Gekweekte Cellen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89839</td><td>Voor Lysosoom Isolati</td></tr><tr><td>Microscoop Camera</td><td>Qimaging</td><td>QICAM fast 1394</td><td></td></tr><tr><td>Optima XL-100K Ultracentrifuge</td><td>Beckman-Coulter</td><td>XL-100K</td><td>Ultracentrifuge Rotor: SW41Ti</td></tr><tr><td>Pasteur Pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-042817</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal 5 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>04 906 845 001</td><td>Fosfatase Inhibitor Tablets</td></tr><tr><td>Steriele Chirurgische Blad #10</td><td>Pioneer</td><td>S2646</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td>Kristallijn/Gecertificeerd ACS</td></tr><tr><td>Triglyceride Liquicolor Kit</td><td>Stanbio&nbsp;</td><td>2200-225</td><td>Colorimetrische Triglyceride kit</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Voor TE buffer</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151-100</td><td>5%, Polyethyleenglycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-fenylether, Proteïne Lysis Reagens</td></tr><tr><td>UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-038</td><td>Voor TE buffer</td></tr></tbody></table>

snelle lipide droplet isolatie protocol met behulp van een gerenommeerd organel isolatie kit

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Lipide druppels (LDs) zijn bioactieve organellen binnen het cytosol van de meeste eukaryotische en sommige prokaryote cellen gevonden. LDs bestaan uit neutrale lipiden ingekapseld door een monolayer van fosfolipiden en eiwitten. Hepatische LD lipiden, zoals Ceramiden en eiwitten zijn betrokken bij verschillende ziekten die leiden hepatische steatosis tot. Hoewel vorige methoden zijn vastgesteld voor LD isolatie, ze vereisen een tijdrovende voorbereiding van reagentia en zijn niet bedoeld voor de isolatie van meerdere subcellular compartimenten. We geprobeerd om een nieuw protocol zodat het isolement van de LDs, endoplasmatisch reticulum (ER) en lysosomen uit de lever van een simpele muisklik.
Verder alle reagentia gebruikt in het protocol hier gepresenteerd zijn commercieel verkrijgbaar en vereisen minimaal reagens voorbereiding zonder in te boeten LD zuiverheid. Hier presenteren we gegevens vergelijken van dit nieuwe protocol aan een standaard sacharose kleurovergang protocol, vergelijkbare zuiverheid, morfologie en opbrengst demonstreren. Bovendien, kunnen we isoleren ER en lysosomen met behulp van hetzelfde monster, gedetailleerde inzicht bijbrengen in de vorming en de intracellulaire flux van lipiden en hun geassocieerde eiwitten.

Wij hebben de LD-isolatie met de kit ER uitgevoerd op ongeveer 30 muizen en vergeleken de resultaten met degenen die het protocol van de isolatie van sacharose volgen op ongeveer 40 muizen. De gerapporteerde bevindingen zijn typisch voor beide protocollen. Muizen werden 's nachts met gratis toegang tot water, te verhogen van het rendement van de LD gevast. LD isolatie met een verloop van sacharose is uitgevoerd in parallel met de kit ER LD isolatie protocol. Monsters van PNS, PMS, PER, CL...

Dit protocol voorziet een nieuwe methode van lipide druppel isolatie en zuivering van muis levers, met behulp van een gevestigde endoplasmatisch reticulum isolatie kit.

Snelle lipide Droplet isolatie Protocol met behulp van een gerenommeerd organel isolatie Kit

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

Onderzoek naar lipide druppelbiologie is belemmerd door de moeilijkheid van de zuivering. Bovendien, het bestuderen van cellulaire lipide flux vereist gelijktijdige zuivering van meerdere organellen, en geen eenvoudige protocollen waren momenteel beschikbaar. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is om lipide druppelzuivering toegankelijker te maken.We hebben een commercieel verkrijgbare kit aangepast om tegelijkertijd lipidedruppels, endoplasmisch reticulum en lysosomen uit één monster te isoleren. Leverlipide druppelaccumulatie predisponeert zwaarlijvige en alcoholische patiënten aan progressieve leverziekte. Dit heeft het zicht van lipidedruppels verschoven van inerte opbergvakken naar dynamische biologisch belangrijke organellen.Gebruik om te beginnen steriele tangen en dissectieschaar om de huid en spierlagen van de buik van de geëuthanaseerde muis op de achterste voorste as te snijden, waardoor de lever wordt blootgesteld. Snijd de ligamenten die de lever verbinden met de darm. Met behulp van tangen, trek de darm uit de buurt van de lever, naar het achterste.Snijd het ligament dat de lever verbindt met het middenrif. Vervolgens, gesneden tussen de lever en de dorsale ribbenkast, verplaatsen van voorste naar achterste, totdat de lever is bevrijd. Breng de lever naar een koude petrischaal van vijf centimeter met 10 milliliter koude 1x PBS en was de lever twee keer op een schommelplatform in 10 milliliter koude 1x PBS gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.Na de laatste wasbeurt giet u de 1x PBS af en gebruik een maat-10 steriel chirurgisch mes om de lever in drie tot vijf millimeter stukjes in de schaal te dobbelen. Was vervolgens de in blokjes gesneden lever twee keer met 10 milliliter koude 1x PBS gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Decanteer de 1x PBS en breng de in blokjes gesneden leverstukken over naar een koude Dounce-homogenisator van 45 milliliter, zodat alle stukken onderaan liggen.Voeg zeven milliliter koude 1x IE buffer toe. Homogenize op ijs door het verplaatsen van de stamper op en neer 20 keer, ervoor te zorgen dat de stamper gaat naar de bodem van de homogenisator tijdens elke beroerte. Breng het homogenaat over op een koude centrifugebuis van 15 milliliter.Spoel de homogenisator met een milliliter koude 1x IE buffer, en voeg het toe aan de rest van het homogenaat. Om kernen te verwijderen, centrifugeer het homogenaat in een centrifuge met hoge capaciteit op 1.000 keer g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Zorg ervoor dat elke lipide verzameld aan de bovenkant van de 15-milliliter buis wordt geresuspended om LD verlies te voorkomen.Zorg ervoor dat de nucleaire pellet aan de onderkant van de buis is ongestoord, breng de lipide-bevattende post-nucleaire supernatant naar een verse koude 50-milliliter centrifuge buis. Breng een 100-microliter aliquot van de post-nucleaire supernatant over naar een koude microcentrifugebuis van 1,7 milliliter op ijs voor latere zuiverheidsanalyse. Om mitochondriën te verwijderen, centrifugeren de post-nucleaire supernatant monster in een gekoelde high-speed centrifuge op 12.000 keer g gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius.Zorg ervoor dat elke lipide verzameld aan de bovenkant van de buis opnieuw wordt opgetrokken om LD-verlies te voorkomen, en breng vervolgens de post-mitochondriale supernatant over naar een 13-milliliter ultracentrifugebuis. Breng een 100-microliter aliquot van de post-mitochondriale supernatant over naar een koude 1,7-milliliter microcentrifugebuis op ijs voor latere zuiverheidsanalyse. Vul de ultracentrifugebuis met post-mitochondriale supernatant tot de rand met koude 1x IE buffer, om te voorkomen dat het instorten tijdens ultracentrifugatie.Balanceer de monsters, en dan centrifugeren in een ultracentrifuge op 100,000 keer g gedurende 60 minuten op vier graden Celsius. Om de LD-laag te verwijderen, kantel je de buis onder een hoek van 45 graden en aanzuigen met een glazen pipet. Na het overbrengen van de pellet naar een koude 1,7-milliliter microcentrifuge buis, verzamel 100 microliter van de post-ER supernatant onder de lipide laag voor zuiverheidsanalyse.Om celpuin te pelleteren, centrifuge in een microcentrifuge op topsnelheid gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Verwarm vervolgens de buis voorzichtig met de handen om de LD-laag opnieuw op te sluiten en breng de supernatant, inclusief de lipidelaag, over op een nieuwe microcentrifugebuis van 1,7 milliliter. Herhaal deze wasstappen, opwarming van de buis twee tot drie keer, totdat de pellet niet meer zichtbaar is.Voeg vervolgens 1x PBS toe aan een eindvolume van 1,5 milliliter en centrifuge vijf minuten op topsnelheid in een microcentrifuge bij topsnelheid bij vier graden Celsius. Gebruik een glazen pipet om een milliliter 1x PBS te verwijderen, die zich onder de lipidelaag bevindt, zonder de lipidelaag te verstoren. Herhaal LD wassen vier tot vijf keer, totdat de 1x PBS visueel transparant is zonder troebelheid.Gebruik vervolgens een glazen pipet om alle 1x PBS onder de lipidelaag te verwijderen en gebruik de resulterende zuivere LD-fractie voor downstream-analyse. Wanneer representatieve 20x fluorescerende en brightfield LD-beelden werden genomen uit zowel de ER kit LD isolatie en de sucrose LD isolatie methoden, ze bleek soortgelijke niveaus van fijnstof, wat suggereert soortgelijke zuiverheid met behulp van twee verschillende protocollen. Na zuivering werden LD triglyceride en eiwitniveaus gemeten met behulp van colorimetrische tests, en de gegevens werden genormaliseerd tot levergewicht, waaruit bleek dat wanneer het uitgangsmateriaal werd genormaliseerd, LD triglyceride en eiwitopbrengsten vergelijkbaar waren met behulp van de ER-kit en de sacharosemethode.LD-diameters werden gekwantificeerd met behulp van beeldanalysesoftware, waaruit bleek dat de ER kit LD-isolatie en sucrose LD-isolatie ID's van vergelijkbare grootte opleverde. Om de zuiverheid van LD te beoordelen, werden monsters onderzocht door immunoblotting, waaruit bleek dat de LDs afgeleid van de ER kit LD isolatie en de sacharose gradiënt protocol beide gelijke zuiverheid hadden. PLIN2, een LD-marker, werd gedetecteerd in alle monsters, behalve voor de ER kit LD isolatie PER en de sucrose PNS.Zuiverheidsanalyse van een ER-fractie met immunoblots toont aan dat ze vrij waren van LD-marker PLIN2, maar significante niveaus van het ER SEC61A-eiwit hadden. Zuiverheid van een lysosomale fractie na verdere zuivering van lysosomen met behulp van de lyssome verrijking kit werd ook beoordeeld. Discovery is momenteel de meest nuttige toepassing van ons protocol.We voeren lipidomics uit in gezuiverde organellen, en toonde lipotoxinen worden specifiek verhoogd in lipidedruppels bij alcoholische leverziekte.

rapid-lipid-droplet-isolation-protocol-using-well-established

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video demonstrates a technique for visualizing the formation of the immunological synapse in natural killer (NK) cells on a supported lipid bilayer (SLB). The SLB is first labeled with a fluorophore-tagged NK cell activating receptor ligand, followed by incubation with NK cells. Subsequently, the cells are stained for polymerized actin and perforin-positive lytic granules. This approach enables the visualization of synapse formation using stimulated emission depletion (STED) microscopy.

Super-Resolution Imaging of NK Cell Immunological Synapse Formation on a Supported Lipid Bilayer

Reconstructie van functionele membraaneiwitten in gigantische liposomen van gedefinieerde samenstelling is een krachtige aanpak in combinatie met patch-clamp elektrofysiologie. Echter, kunnen conventionele reus liposoom productie onverenigbaar met eiwitstabiliteit. We beschrijven protocollen voor het produceren gigantische liposomen uit pure lipiden of kleine liposomen die ionkanalen.

Giant liposoombereiding for Imaging en patch-clamp elektrofysiologie

Twee technieken voor het isoleren van cellulaire lipide druppeltjes uit 1) gistcellen en 2) humane placenta worden gepresenteerd. De kern van beide procedures is dichtheidsgradiëntcentrifugatie, waar de resulterende drijvende laag met de druppeltjes gemakkelijk kan worden gevisualiseerd door oog, gewonnen, en gekwantificeerd door Western Blot analyse voor zuiverheid.

Isolatie van Cellulaire lipidedruppeltjes: Twee zuiveringstechnieken Vanaf gistcellen en Human placenta

MicroRNAs spelen een belangrijke regulerende rol en zijn in opkomst als nieuwe therapeutische doelen voor verschillende ziekten bij de mens. Het is aangetoond dat miRNAs worden vervoerd in high density lipoproteïnen. Wij hebben een eenvoudige methode om gezuiverd HDL geschikt voor miRNA analyse uit menselijk plasma snel isoleren ontwikkeld.

Snelle en vereenvoudigde methode voor High Through-put Isolatie van miRNA uit Highly Purified high density lipoproteïne

Hier presenteren we een protocol om enkele, SNARE-bemiddelde fusie gebeurtenissen tussen liposomen en ondersteund dubbellagen in microfluïdische kanalen met gepolariseerde TIRFM, met 'single molecule gevoeligheid en ~ 15 msec tijdsresolutie te detecteren. Lipide en oplosbare lading afgifte kan gelijktijdig worden gedetecteerd. Liposoom grootte, lipide diffusie, en fusie porie eigenschappen worden gemeten.

SNARE-gemedieerde Fusie van Single proteoliposomen met Tethered Ondersteund dubbellagen in een microfluïdische Flow Cell gecontroleerd door gepolariseerde TIRF Microscopie

Dit protocol beschrijft de isolatie en kwantificering van kleine RNA's met hoge dichtheidslipoproteïnen.

Isolatie van lipoproteïnen met hoge dichtheid voor niet-coderende RNA kwantificering Klein

Vetdruppels belangrijke organellen voor de replicatie van verschillende pathogenen, waaronder het hepatitis C virus (HCV). We beschrijven een methode om lipidedruppeltjes voor de kwantitatieve massaspectrometrie van geassocieerde eiwitten te isoleren; kan worden gebruikt onder verschillende omstandigheden, zoals virusinfectie, omgevingsstress of geneesmiddelbehandeling.

Lipide Druppeltje Isolatie kwantitatieve massaspectrometrie Analyse

Een snel en efficiënt protocol wordt gepresenteerd voor de isolatie van plastoglobule lipidedruppels geassocieerd met verschillende fotosynthetische organismen. De succesvolle bereiding van geïsoleerde plastoglobulen is een cruciale eerste stap die voorafgaat aan gedetailleerde moleculaire onderzoeken zoals proteomische en lipidomische analyses.

Plastoglobule Lipid Droplet Isolation van plantaardig bladweefsel en cyanobacteriën

We presenteren een protocol voor het reconstitueren van membraaneiwitten en het inkapselen van enzymen en andere in water oplosbare componenten in lipideblaasjes van submicrometer en micrometer grootte.

Constructie van metabolische netwerken uit evenwicht in blaasjes ter grootte van nano- en micrometer

Lipofagie is een selectieve vorm van autofagie waarbij lipidedruppeltjes worden afgebroken. Disfuncties in dit proces worden in verband gebracht met de ontwikkeling van kanker. De precieze mechanismen zijn echter nog niet volledig begrepen. Dit protocol beschrijft kwantitatieve beeldvormingsbenaderingen om de wisselwerking tussen autofagie, lipidenmetabolisme en kankerprogressie beter te begrijpen.

Onderzoek naar de regulatie van katabolisme van lipidendruppels door middel van lipofagie

Leer een snelle methode voor lipide druppel isolatie uit muizenlever met een aangepaste ER-kit. Deze techniek maakt gelijktijdige zuivering van meerdere organellen mogelijk voor onderzoek naar metabole ziekten.

Snelle lipide Droplet isolatie Protocol met behulp van een gerenommeerd organel isolatie Kit

Meer video's verkennen