Snelle lipide Droplet isolatie Protocol met behulp van een gerenommeerd organel isolatie Kit

Onderzoek naar lipide druppelbiologie is belemmerd door de moeilijkheid van de zuivering. Bovendien, het bestuderen van cellulaire lipide flux vereist gelijktijdige zuivering van meerdere organellen, en geen eenvoudige protocollen waren momenteel beschikbaar. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is om lipide druppelzuivering toegankelijker te maken.

We hebben een commercieel verkrijgbare kit aangepast om tegelijkertijd lipidedruppels, endoplasmisch reticulum en lysosomen uit één monster te isoleren. Leverlipide druppelaccumulatie predisponeert zwaarlijvige en alcoholische patiënten aan progressieve leverziekte. Dit heeft het zicht van lipidedruppels verschoven van inerte opbergvakken naar dynamische biologisch belangrijke organellen.

Gebruik om te beginnen steriele tangen en dissectieschaar om de huid en spierlagen van de buik van de geëuthanaseerde muis op de achterste voorste as te snijden, waardoor de lever wordt blootgesteld. Snijd de ligamenten die de lever verbinden met de darm. Met behulp van tangen, trek de darm uit de buurt van de lever, naar het achterste.

Snijd het ligament dat de lever verbindt met het middenrif. Vervolgens, gesneden tussen de lever en de dorsale ribbenkast, verplaatsen van voorste naar achterste, totdat de lever is bevrijd. Breng de lever naar een koude petrischaal van vijf centimeter met 10 milliliter koude 1x PBS en was de lever twee keer op een schommelplatform in 10 milliliter koude 1x PBS gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.

Na de laatste wasbeurt giet u de 1x PBS af en gebruik een maat-10 steriel chirurgisch mes om de lever in drie tot vijf millimeter stukjes in de schaal te dobbelen. Was vervolgens de in blokjes gesneden lever twee keer met 10 milliliter koude 1x PBS gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Decanteer de 1x PBS en breng de in blokjes gesneden leverstukken over naar een koude Dounce-homogenisator van 45 milliliter, zodat alle stukken onderaan liggen.

Voeg zeven milliliter koude 1x IE buffer toe. Homogenize op ijs door het verplaatsen van de stamper op en neer 20 keer, ervoor te zorgen dat de stamper gaat naar de bodem van de homogenisator tijdens elke beroerte. Breng het homogenaat over op een koude centrifugebuis van 15 milliliter.

Spoel de homogenisator met een milliliter koude 1x IE buffer, en voeg het toe aan de rest van het homogenaat. Om kernen te verwijderen, centrifugeer het homogenaat in een centrifuge met hoge capaciteit op 1.000 keer g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Zorg ervoor dat elke lipide verzameld aan de bovenkant van de 15-milliliter buis wordt geresuspended om LD verlies te voorkomen.

Zorg ervoor dat de nucleaire pellet aan de onderkant van de buis is ongestoord, breng de lipide-bevattende post-nucleaire supernatant naar een verse koude 50-milliliter centrifuge buis. Breng een 100-microliter aliquot van de post-nucleaire supernatant over naar een koude microcentrifugebuis van 1,7 milliliter op ijs voor latere zuiverheidsanalyse. Om mitochondriën te verwijderen, centrifugeren de post-nucleaire supernatant monster in een gekoelde high-speed centrifuge op 12.000 keer g gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius.

Zorg ervoor dat elke lipide verzameld aan de bovenkant van de buis opnieuw wordt opgetrokken om LD-verlies te voorkomen, en breng vervolgens de post-mitochondriale supernatant over naar een 13-milliliter ultracentrifugebuis. Breng een 100-microliter aliquot van de post-mitochondriale supernatant over naar een koude 1,7-milliliter microcentrifugebuis op ijs voor latere zuiverheidsanalyse. Vul de ultracentrifugebuis met post-mitochondriale supernatant tot de rand met koude 1x IE buffer, om te voorkomen dat het instorten tijdens ultracentrifugatie.

Balanceer de monsters, en dan centrifugeren in een ultracentrifuge op 100,000 keer g gedurende 60 minuten op vier graden Celsius. Om de LD-laag te verwijderen, kantel je de buis onder een hoek van 45 graden en aanzuigen met een glazen pipet. Na het overbrengen van de pellet naar een koude 1,7-milliliter microcentrifuge buis, verzamel 100 microliter van de post-ER supernatant onder de lipide laag voor zuiverheidsanalyse.

Om celpuin te pelleteren, centrifuge in een microcentrifuge op topsnelheid gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Verwarm vervolgens de buis voorzichtig met de handen om de LD-laag opnieuw op te sluiten en breng de supernatant, inclusief de lipidelaag, over op een nieuwe microcentrifugebuis van 1,7 milliliter. Herhaal deze wasstappen, opwarming van de buis twee tot drie keer, totdat de pellet niet meer zichtbaar is.

Voeg vervolgens 1x PBS toe aan een eindvolume van 1,5 milliliter en centrifuge vijf minuten op topsnelheid in een microcentrifuge bij topsnelheid bij vier graden Celsius. Gebruik een glazen pipet om een milliliter 1x PBS te verwijderen, die zich onder de lipidelaag bevindt, zonder de lipidelaag te verstoren. Herhaal LD wassen vier tot vijf keer, totdat de 1x PBS visueel transparant is zonder troebelheid.

Gebruik vervolgens een glazen pipet om alle 1x PBS onder de lipidelaag te verwijderen en gebruik de resulterende zuivere LD-fractie voor downstream-analyse. Wanneer representatieve 20x fluorescerende en brightfield LD-beelden werden genomen uit zowel de ER kit LD isolatie en de sucrose LD isolatie methoden, ze bleek soortgelijke niveaus van fijnstof, wat suggereert soortgelijke zuiverheid met behulp van twee verschillende protocollen. Na zuivering werden LD triglyceride en eiwitniveaus gemeten met behulp van colorimetrische tests, en de gegevens werden genormaliseerd tot levergewicht, waaruit bleek dat wanneer het uitgangsmateriaal werd genormaliseerd, LD triglyceride en eiwitopbrengsten vergelijkbaar waren met behulp van de ER-kit en de sacharosemethode.

LD-diameters werden gekwantificeerd met behulp van beeldanalysesoftware, waaruit bleek dat de ER kit LD-isolatie en sucrose LD-isolatie ID's van vergelijkbare grootte opleverde. Om de zuiverheid van LD te beoordelen, werden monsters onderzocht door immunoblotting, waaruit bleek dat de LDs afgeleid van de ER kit LD isolatie en de sacharose gradiënt protocol beide gelijke zuiverheid hadden. PLIN2, een LD-marker, werd gedetecteerd in alle monsters, behalve voor de ER kit LD isolatie PER en de sucrose PNS.

Zuiverheidsanalyse van een ER-fractie met immunoblots toont aan dat ze vrij waren van LD-marker PLIN2, maar significante niveaus van het ER SEC61A-eiwit hadden. Zuiverheid van een lysosomale fractie na verdere zuivering van lysosomen met behulp van de lyssome verrijking kit werd ook beoordeeld. Discovery is momenteel de meest nuttige toepassing van ons protocol.

We voeren lipidomics uit in gezuiverde organellen, en toonde lipotoxinen worden specifiek verhoogd in lipidedruppels bij alcoholische leverziekte.