Name: Zuivering van de dendritische Filopodia-rijke Fractie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Leer een methode voor zuivering van dendritische filopodia-rijke fracties uit gekweekte hippocampale neuronen met behulp van TLCN-vitronectine-affiniteit. Deze techniek helpt onderzoekers eiwitten in onrijpe synapsen te identificeren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We bedanken Shigeo Okabe en Hitomi Matsuno voor de lage-densiteit cultuur van hippocampal neuronen, Masayoshi Mishina voor TLCN-deficiënte muizen, Sachiko Mitsui en Momoko Shiozaki voor technische assistentie, en leden van het Yoshihara laboratorium voor nuttige discussies . Dit werk werd gesteund door JSPS KAKENHI Grant NOS. JP20700307, JP22700354 en JP24500392 en MEXT KAKENHI Grant NOS. JP23123525 naar YF en JP20022046, JP18H04683, en JP18H05146 naar YY.

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van RIKEN WAKO.
1. cultuur van Hippocampal neuronen
<ol><li>Bereiding van kweekmedium
	<ol>
<li>Bereiding van 200x vitamine mengsel. Los 100 mg van D-Pantotheenzuur hemicalcium zout, 100 mg choline chloride, 100 mg foliumzuur, 180 mg i-inositol, 100 mg niacinamide, 100 mg pyridoxal HCl, en 100 mg thiamine HCl in 500 mL ultrapuur water met behulp van een magnetische roerder. De oplossing is niet volledig opgelost. Voorzichtig mengen, ALIQUOT in 50 mL tubes en bewaren bij-20 °C.</li>
		<li>Bereiding van riboflavine oplossing. Los 100 mg riboflavine op in 500 mL ultrapuur water met behulp van een magnetische roerder. De oplossing is niet volledig opgelost. Voorzichtig mengen, ALIQUOT in 50 mL tubes en bewaren bij-20 °C.</li>
		<li>Bereiding van 1 M CaCl2. Los 7,35 g CaCl2· 2H2O op in 50 ml ultrapuur water met behulp van een magneetroerder.</li>
		<li>Voorbereiding van het minimale essentiële medium (MEM). Los 400 mg KCl op, 6800 mg NaCl, 2.200 mg NaHCO3, 158 mg Nah2po4· 2H2O, 7000 mg D-glucose, en 200 mg MgSO4-7h2O in 950 ml ultrapuur water met behulp van een magnetische roerder.</li>
		<li>Ticaat 1,8 mL van 1 M CaCl2 op de mem in een druppel-voor-druppel manier met een pipet van 1 ml met een constante opwinding op een magneetroerder. Stel de pH van de MEM in op pH 7,25 met 1 mol/L HCl.</li>
		<li>Voeg 5 mL 200x vitamine mengsel en 200 μL riboflavine oplossing toe aan de MEM. Stel het volume van de oplossing in op 1.000 mL met ultrapuur water. Filter de oplossing met een 0,22 μm filtersysteem en bewaar deze op 4 °C.</li>
		<li>Voorbereiding van 10x DNase-I stockoplossingen. Los 100 mg DNase-I op in 12,5 mL van de uitgebalanceerde zoutoplossing van Hanks (HBSS), filtreer door een 0,22 μm filter, ALIQUOT in 1,5 mL buisjes en bewaar de buisjes bij-20 °C.</li>
		<li>Bereiding van Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) stockoplossing. Los 25 mg Ara-C op in 8,93 mL ultrapuur water (eindconcentratie van 10 mM), filtreer door een 0,22 μm filter, ALIQUOT in 1,5 mL buizen en bewaar bij-20 °C</li>
		<li>Bereiding van het beplating medium. Meng 1 mL-aminozuur oplossing van MEM, 750 μL van 1 M HEPES, 1 mL B27, 125 μL 200 mM glutamine, 250 μL van penicillaire/streptomycine, 2,5 mL foetaal runderserum (FBS) en 44,375 mL MEM in een 50 mL Tube.</li>
		<li>Voorbereiding van stop medium. Meng 1 mL-aminozuur oplossing van MEM, 750 μL van 1 M HEPES, 5 mL FBS (Final 10%) en 43,25 mL MEM in een buis van 50 mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding van gerechten met poly-L-lysine coating
	<ol>
<li>Jas 35 mm kunststof celkweek gerechten met 0,2 mg/mL poly-L-lysine hydrobromide voor 1 dag bij 25 °C. Opmerking: Poly-L-lysine mag niet worden gebruikt in plaats van poly-L-lysine-hydrobromide.</li>
		<li>Was 3 keer de afwas met 2 mL ultrapuur water. Incuberen de afwas met 1,5 mL stop medium bij 25 °C tot het gebruik.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissectie van hippocampal neuronen van muis embryo
	<ol>
<li>Weefsel bron van hippocampal neuronen. Dissect de hippocampus van wild-type en TLCN-deficiënte C57BL6/J muizen op de embryonale dagen 16-17 volgens de methode van Lu et al.19.</li>
		<li>Inincuberen van de ontleed hippocampi in 0,25% trypsine en 1x DNaseI in HBSS met 15 mM HEPES, pH 7,2 gedurende 15 min bij 37 °C met roeren om de 3 min. Verwijder de oplossing. Inbroed de hippocampi in 10 mL STOP medium om trypsine gedurende 5 minuten te deactiveren bij 4 °C.</li>
		<li>Breng de hippocampi in 10 mL vers STOP medium en inbroed bij 4 °C gedurende 5 min. Verplaats de hippocampi in 10 mL vers STOP medium en inbroed bij 4 °C nog eens 5 min. Beweeg de hippocampi in een STOP medium van 900 μL en 100 μL DNaseI in een 15 mL buis. Dissociate de hippocampi in geïsoleerde neuronen door pipetteren 20 keer met behulp van een 1 mL pipet. Opmerking: De punt van de 1 mL pipet licht raakt de onderkant van de 15 mL buis tijdens dissociatie van de hippocampi.</li>
		<li>Voeg 9 mL beplating medium toe en filtreer door een celzeef van 70 μm in een buis van 50 mL. Tel het aantal cellen met behulp van een hemocytometer en aanpassen aan 3,5 x 104 cellen/ml in plating medium.</li>
		<li>Aspirate STOP medium van poly-L-lysine-gecoate gerechten. Plaat de cellen op poly-L-lysine-gecoate gerechten op 7 x 104 cellen/schotel (2 ml/schotel).</li>
		<li>Na 60-64 h incubatie onder 5% CO2 bij 37 °c, voeg 2 μL Ara-C Stock Solution (Final 10 μM) toe aan de neuronen en schud het gerecht langzaam. Houd de cultuur gerechten in een bevoficeerde doos zonder het kweekmedium te veranderen onder 5% CO2 bij 37 °c.</li>
	</ol></li>
</ol>2. zuivering van dendritische Filopodia-rijke Fractie
<ol><li>Voeg na 13 dagen in vitro (DIV) magnetische polystyreen microbeads (3 x 106 deeltjes/schotel) toe aan 20 gerechten die de gekweekte neuronen bevatten. Was na 1 dag de neuronen in 1 mL PBS met roeren 3 keer om de medium en ongebonden microbeads te verwijderen. Na het verwijderen van PBS, Lyse de neuronen met 500 μL/schotel van lysisbuffer (PBS met 0,01% Triton X-100, EDTA-vrije proteaseremmer cocktail en cocktail van de fosfatase remmer).</li>
	<li>Verzamel het lysaat met een celscraper en verplaats het lysaat naar lage eiwit bindende microbuisjes (10 tubes). Zet de buizen op een Magneet separator en wacht 1 minuut. Verzamel het supernatant en gebruik het als de ongebonden fractie voor zilver kleuring en Western Blot-analyse.</li>
	<li>Breng de parels over naar een nieuwe, eiwit bindende micro buis die op een magnetische separator is gezet en verwijder het supernatant volledig. Voeg 500 μL lysisbuffer toe en was de parels met een Vortex-mixer voor 15 sec. Zet de buis op een Magneet separator, wacht 1 minuut, verwijder het supernatant en voeg 500 μL lysisbuffer toe. Herhaal het wassen van de kralen 10 keer en verwijder het supernatant.</li>
	<li>Elute eiwitten gebonden aan de parels (de gebonden Fractie) door de toevoeging van 50 μL van 1x SDS monster buffer (62,5 mM tris HCl, pH 6,8, 2,5% SDS, en 10% glycerol) en kook de buis bij 98 °C gedurende 5 min. Centrifugeer de buis op 860 x g voor 10 s en stel de buis op een magnetische separator voor 1 min. Verzamel het supernatant en gebruik het als de gebonden breuk. Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken.</li>
	<li>Meet de eiwit concentraties van de ongebonden en gebonden fracties door de BCA-eiwit test. Visualiseer eiwit oplossingen met broomfenolblauw en stel de concentratie in op 5 ng/μL voor SDS-page.</li>
</ol>3. zilver kleuring en westerse Blot-analyse
<ol><li>Scheid de gebonden en ongebonden fracties (50 ng) per SDS-PAGE met een 5-20% gradiënt gel. Zilver vlek de gel.</li>
	<li>Western Blot met anti-TLCN-C (1/3000), anti-bovine vitronectine (1/5000), anti-actin (1/1000), en anti-α-tubuline (1/1000) als primaire antilichamen en HRP-geconjugeerde geit anti-konijn IgG (1/5000) als secundair antilichaam. Visualiseer de antigenen met chemiluminescerende Western blotting Detection-reagens en een chemiluminescentie Imager.</li>
</ol>

<ol><li>Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptogenesis+via+dendritic+filopodia+in+developing+hippocampal+area+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1.</a> Journal of Neuroscience. 18 (21), 8900-8911 (1998).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-regulated+dynamic+behavior+of+early+dendritic+protrusions%3A+evidence+for+different+types+of+dendritic+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia.</a> Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).</li>
<li>Ziv, N. E., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+role+of+dendritic+filopodia+in+synaptogenesis+and+spine+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation.</a> Neuron. 17 (1), 91-102 (1996).</li>
<li>Lohmann, C., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+local+calcium+signaling+in+rapid+synaptic+partner+selection+by+dendritic+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia.</a> Neuron. 59 (2), 253-260 (2008).</li>
<li>Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+formation+and+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine formation and stabilization.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19 (2), 146-153 (2009).</li>
<li>Bayes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+human+and+mouse+postsynaptic+proteomes+finds+high+compositional+conservation+and+abundance+differences+for+key+synaptic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative study of human and mouse postsynaptic proteomes finds high compositional conservation and abundance differences for key synaptic proteins.</a> PLoS One. 7 (10), e46683(2012).</li>
<li>Bayes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+proteome%2C+diseases+and+evolution+of+the+human+postsynaptic+density%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Characterization of the proteome, diseases and evolution of the human postsynaptic density.</a> Nature Neuroscience. 14 (1), 19-21 (2011).</li>
<li>Furutani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+telencephalin+and+ERM+family+proteins+mediates+dendritic+filopodia+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Interaction between telencephalin and ERM family proteins mediates dendritic filopodia formation.</a> Journal of Neuroscience. 27 (33), 8866-8876 (2007).</li>
<li>Mao, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodia+Conduct+Target+Selection+in+Cortical+Neurons+Using+Differences+in+Signal+Kinetics+of+a+Single+Kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Filopodia Conduct Target Selection in Cortical Neurons Using Differences in Signal Kinetics of a Single Kinase.</a> Neuron. 98 (4), 767-782 (2018).</li>
<li>Matsuno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telencephalin+slows+spine+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Telencephalin slows spine maturation.</a> Journal of Neuroscience. 26 (6), 1776-1786 (2006).</li>
<li>Raemaekers, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARF6-mediated+endosomal+transport+of+Telencephalin+affects+dendritic+filopodia-to-spine+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation.</a> The EMBO Journal. 31 (15), 3252-3269 (2012).</li>
<li>Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telencephalon-specific+antigen+identified+by+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (11), 3921-3925 (1987).</li>
<li>Yoshihara, Y., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telencephalin%3A+a+neuronal+area+code+molecule%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Telencephalin: a neuronal area code molecule?</a> Neuroscience Research. 21 (2), 119-124 (1994).</li>
<li>Annaert, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+telencephalin+and+the+amyloid+precursor+protein+predicts+a+ring+structure+for+presenilins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins.</a> Neuron. 32 (4), 579-589 (2001).</li>
<li>Furutani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitronectin+induces+phosphorylation+of+ezrin%2Fradixin%2Fmoesin+actin-binding+proteins+through+binding+to+its+novel+neuronal+receptor+telencephalin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 39041-39049 (2012).</li>
<li>Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Actinin-dependent+cytoskeletal+anchorage+is+important+for+ICAM-5-mediated+neuritic+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth.</a> Journal of Cell Biology. 119 (Pt 15), 3057-3066 (2006).</li>
<li>Esselens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilin+1+mediates+the+turnover+of+telencephalin+in+hippocampal+neurons+via+an+autophagic+degradative+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway.</a> Journal of Cell Biology. 166 (7), 1041-1054 (2004).</li>
<li>Furutani, Y., Yoshihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Analysis+of+Dendritic+Filopodia-Rich+Fraction+Isolated+by+Telencephalin+and+Vitronectin+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Synaptic+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27(2018).</li>
<li>Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified+Method+for+Ultra-Low+Density%2C+Long-Term+Primary+Hippocampal+Neuron+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).</li>
<li>Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+the+C-terminal+domain+regulates+cell+surface+expression+of+the+NMDA+receptor+NR1+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (18), 7781-7792 (1999).</li>
<li>Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+synaptogenesis+of+hippocampal+neurons+without+NMDA+receptor+function+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture.</a> European Journal of Neuroscience. 10 (6), 2192-2198 (1998).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We ontwikkelden een zuiveringsmethode voor de dendritische filopodia-rijke fractie met behulp van affiniteit tussen de celadhesie molecule TLCN en het extracellulaire matrix eiwit vitronectine. Vergeleken met de PSD-Fractie, kan het mogelijk zijn om de synaptische eiwitten te identificeren die op de onrijpe Synapse van de dendritische filopodia-rijke fractie optreden. De bestanddelen van de dendritische filopodia-Rich fractie verschillen dus van die van de PSD-fractie met 74%. Anders dan PSD-Fractie, gebruikten we gekwee...

Dendritische filopodia wordt beschouwd als voorlopers van stekels. Actin filamenten in de dendritische filopodia reguleren hun verlenging en terugtrekking1,2,3. Na contact met een axon beginnen geselecteerde dendritische filopodia hun rijping in stekels en wordt een synaps gevormd op4,5. Componenten van stekels zijn vastgesteld aan de hand van een uitgebreide analyse van postsynaptische dichtheids fracties6,7, terwijl de componenten van dendritische filopodia grotendeels onbekend blijven. Het is aangetoond dat telencephalin (tlcn), ERM, syngap, ras, PI3 kinase, Akt, mtor, Polo-achtige kinase 2, camkii, syndecan-2, paralemin-1, ARF6, en ephb reguleren dendritische filopodia vorming5,8,9 ,10,11, terwijl een methode niet is ontwikkeld voor de uitgebreide analyse van moleculen die in de dendritische filopodia aanwezig zijn.
Tlcn (ICAM-5) wordt specifiek uitgedrukt door stekelige neuronen in het meest rostrale migratoire hersen segment, de telencephalon12. TLCN heeft 9 Ig-achtige domeinen in de extracellulaire regio, een transmembraan regio, en een cytoplasmische staart13. Tlcn bindt aan vitronectine (VN) en LFA-1 integrine in zijn extracellulaire regio, aan presenilin in zijn transmembraan regio, en aan fosho-ERM en α-actinine in de cytoplasmische regio5,8,14,15 ,16. Tlcn bindt aan de actine cytoskelet via fosho-ERM op de uiteinden van dendritische filopodia en α-actinine in stekels en dendritische assen8,16.
We toonden aan dat overexpressie van tlcn verbeterde dendritische filopodia-formatie en de reversie van stekels veroorzaakte tot filopodia10. De constitutieve actieve vorm van Ezrin gebonden aan de TLCN cytoplasmatische regio en verbeterde dendritische filopodia formatie8. Zo reguleert TLCN de vorming van dendritische filopodia door middel van actin-bindende eiwitten. Esselens et al. heeft aangetoond dat microbeads de accumulatie van TLCN op gekweekte neuronen17induceerde. We toonden aan dat de fagocytische beker structuren werden gevormd op neuronale dendrites rond VN-gecoate microbeads in een TLCN-afhankelijke manier15. Bestanddelen van dendritische filopodia lijken op die van de phagocytische beker. Het is moeilijk om dendritische filopodia te verzamelen, maar het is relatief gemakkelijker om de phagocytische beker te verzamelen met behulp van magnetische microbeads. Zo ontwikkelden we een methode om de fagocytische beker te zuiveren in plaats van dendritische filopodia18. Hier beschrijven we de zuiveringsmethode voor de dendritische filopodia-rijke Fractie.

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mLl Low Binding MCT</td><td>Sorenson BioScience</td><td>39640T</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>2530149</td><td></td></tr><tr><td>35 mm plastic cell culture dishes</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Anti-actin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5060</td><td></td></tr><tr><td>Anti-alpha-Actinin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5044</td><td></td></tr><tr><td>Anti-alpha-tubulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9026</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ezrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>clone3C12, SAB4200806</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Galphaq</td><td>Santacruz</td><td>sc-393</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MAP2</td><td>Chemicon</td><td>clone AP20, MAB3418</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Moesin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>clone 38/87, M7060</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PLCbeta1</td><td>Santacuz</td><td>sc-5291</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PSD95</td><td>MA2</td><td>ABR</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Spectrin beta</td><td>Chemicon</td><td>MAB1622</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>0080085SA</td><td></td></tr><tr><td>BCA protein assay kit</td><td>Thermo</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Merck</td><td>1.08122.0005</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chrolide, hydrous</td><td>Wako</td><td>038-19735</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>Falcon</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Choline chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7527</td><td></td></tr><tr><td>Complete EDTA free protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Cytosine beta-D-arabinofuranoside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-6645</td><td></td></tr><tr><td>DNase-I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN-25</td><td></td></tr><tr><td>D-Pantothenic acid hemicalcium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5155</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Thermo</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td><td>GE</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel</td><td>ATTO</td><td>E-T520L</td><td></td></tr><tr><td>Folic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8758</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>HRP-conjugated anti-rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-035-144</td><td></td></tr><tr><td>i-Inositol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7508</td><td></td></tr><tr><td>LAS-1000 mini</td><td>Fuji Film</td><td>LAS-1000 mini</td><td>Voor detectie van luminiscentie van WB-membraan</td></tr><tr><td>Magnetic polystyrene microbeads</td><td>Sperotech</td><td>PM-20-10</td><td></td></tr><tr><td>MEM amino acid solution</td><td>Gibco</td><td>11130-051</td><td>30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine</td></tr><tr><td>Mini-slab size electrophoresis system</td><td>ATTO</td><td>AE-6530</td><td></td></tr><tr><td>Niacinamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin / Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>4906845001</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine hydrobromide</td><td>Nacali</td><td>28360-14</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxal HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6155</td><td></td></tr><tr><td>Riboflavin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9504</td><td></td></tr><tr><td>Silver Stain 2 Kit wako</td><td>Wako</td><td>291-5031</td><td></td></tr><tr><td>Thiamine HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1270</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td><td>Bio-rad</td><td>1703940JA</td><td></td></tr><tr><td>Ultra pure water</td><td>MilliQ</td><td></td><td>Voor productie van ultra zuiver water</td></tr></tbody></table>

zuivering van de dendritische filopodia-rijke fractie

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Dendritische filopodia zijn dunne en lange uitsteeksels op basis van de actine filament, en ze verlengen en intrekken alsof ze zoeken naar een doel-axon. Wanneer de dendritische filopodia contact leggen met een doel-axon, beginnen ze te rijpen in stekels, wat leidt tot de vorming van een synaps. Telencephalin (TLCN) is overvloedig gelokaliseerd in dendritische filopodia en wordt geleidelijk uitgesloten van stekels. Overexpressie van TLCN in gekweekte hippocampal neuronen induceert dendritische filopodia vorming. We toonden aan dat telencephalin sterk bindt aan een extracellulair matrix molecuul, vitronectine. Vitronectin-gecoate microbeads geïnduceerde fagocytische beker vorming op neuronale dendrieten. In de fagocytische beker worden TLCN, TLCN-bindende eiwitten zoals gefosforyleerd Ezrin/Radixin/Moesin (phospho-ERM) en F-actin verzameld, wat suggereert dat componenten van de phagocytische beker vergelijkbaar zijn met die van dendritische filopodia. Zo ontwikkelden we een methode voor het zuiveren van de fagocytische beker in plaats van dendritische filopodia. Magnetische polystyreen kralen werden bekleed met vitronectine, die overvloedig aanwezig is in het cultuurmedium van hippocampal neuronen en die fagocytische beker vorming op neuronale dendrieten induceert. Na 24 uur incubatie werden de fagocytische bekers mild gesolubiliseerd met wasmiddel en verzameld met behulp van een Magneet separator. Na het wassen van de kralen werden de bindende eiwitten geeluteerd en geanalyseerd door zilver kleuring en Western blotting. In de bindende fractie waren TLCN en actine overvloedig aanwezig. Bovendien werden veel eiwitten die uit de Fractie werden geïdentificeerd, gelokaliseerd in de dendritische filopodia; zo noemden we de bindende fractie als de dendritische filopodia-rijke Fractie. Dit artikel beschrijft de details met betrekking tot de zuiveringsmethode voor de dendritische filopodia-Rich Fractie.

In gekweekte hippocampal neuronen, TLCN was overvloedig gelokaliseerd aan de dendritische filopodia, schacht, en Soma en cogelokaliseerd met F-actin (Figuur 1a, B). Wanneer polystyreen microbeads werden toegevoegd aan gekweekte hippocampal neuronen, werden de parels automatisch bekleed met vitronectine (VN) afgeleid van foetaal runderserum (FBS) in het kweekmedium; ze waren voornamelijk gebonden aan dendrites, en ze veroorzaakte de vorming va...

In dit protocol introduceren we een methode voor het zuiveren van de dendritische filopodia-rijke Fractie van de phagocytische beker-achtige uitsteeksel structuur op gekweekte hippocampal neuronen door gebruik te maken van de specifieke en sterke affiniteit tussen een dendritische filopodial adhesie molecuul, TLCN, en een extracellulaire matrix molecuul, vitronectine.

Zuivering van de dendritische Filopodia-rijke Fractie

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

In vergelijking met psd-fractie kan het mogelijk zijn om het synaptische eiwit te identificeren dat werkt op de onrijpe synaps rond de dendritische filopodia-rijke fractie. We gebruikten levend neuron om fagocytische cap vorming te induceren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat actief eiwit in kunstmatige ontstaan kan worden geïdentificeerd uit de dendritische filopodia rijke fractie.Om te beginnen, bereid 200x vitamine mix door het oplossen van 100 mg vitamine B5, 100 mg Choline Chloride, 100 mg foliumzuur, 180 mg I-inositol, 100 mg vitamine B3, 100 mg vitamine B6chloride hydro, en 100 mg thiaminechloride in 500 ml ultrazuiver water met behulp van een magnetische roerder. Meng aliquot voorzichtig in buizen van 50 ml en bewaar het op 20 graden Celsius. Voor het bereiden van riboflavine oplossing, los 100 mg riboflavine in 500 mg ultrazuiver water met behulp van een magnetische roerder.Meng aliquot voorzichtig in buizen van 50 ml en bewaar op 20 graden Celsius. Voor te bereiden een molaire calciumdichloride oplossen 7,35 gram calciumchloride dihydraat in 50 ml ultrazuiver water met behulp van een magnetische roerder. Los voor minimum essential medium preparaat 400 mg

purification-of-the-dendritic-filopodia-rich-fraction

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In deze video-artikel stellen we een methode voor de isolatie en zuivering...

Isolatie en zuivering van Drosophila Perifere neuronen door Magnetic Bead sorteren

Dit is een protocol om actief volle lengte Kinesine isoleren...

Isolatie en zuivering van kinesine uit Drosophila Embryo&#39;s

De generatie, zuivering en celinvasie van intracellulaire, cytoplasmatische volledige lengte DISC1 eiwit aggresomes van celculturen en van een label, multimeer recombinant DISC1 eiwitfragment...

Generation, Zuivering en karakterisering van Cell-invasieve DISC1 Protein Soorten

Heterologe expressie en zuivering van het cystische fibrose transmembraan geleiding regulator (CFTR) zijn belangrijke uitdagingen en beperkende factoren in de ontwikkeling van geneesmiddelen therapieën voor cystic fibrosis. Dit protocol beschrijft twee werkwijzen voor de isolatie van milligram hoeveelheden CFTR voor functionele en structurele studies.

Zuivering van het Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator eiwit dat tot expressie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Wij rapporteren een protocol met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering met plasmacytoïde dendritische cellen (PDC) met hoge zuiverheid uit het beenmerg van lupus-muizen gevoelig voor functionele studies pDC isoleren.

Fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Zuivering van plasmacytoïde dendritische cellen van de muis Bone Marrow

Een procedure wordt gepresenteerd voor het uiteinde van de dCACHE periplasmische ligand bindend domein van Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 van integratie-organen en de zuivering aan opbrengst milligram hoeveelheden eiwit.

Methode voor het efficiënt uiteinde en zuivering van de Chemoreceptor-Ligand bindend domein

Hier presenteren we een cel dissociatie protocol voor het efficiënt isoleren van cellen aanwezig bij lage overvloed binnen het visuele systeem van Drosophila door fluorescentie geactiveerd cell sorting (FACS).

Zuivering van Low-overvloedig cellen in het visuele systeem van Drosophila

Dit fractioneringsprotocol stelt onderzoekers in staat om cytoplasmatische, nucleaire, mitochondriale en membraaneiwitten uit zoogdiercellen te isoleren. De laatste twee subcellulaire fracties worden verder gezuiverd via isopycnic dichtheidsgradiënt.

Celfractionering van U937-cellen door isopycnic density gradient purification

Op basis van het assemblagemechanisme van het INAD-eiwitcomplex werd in dit protocol een aangepaste affiniteitszuivering plus concurrentiestrategie ontwikkeld om het endogene Drosophila TRP-kanaal te zuiveren.

Zuivering van endogene Drosophila Transient Receptor Potential Channels

In vitro reconstitutie van cytoskeletale eiwitten is een essentieel hulpmiddel om de fundamentele functionele eigenschappen van deze eiwitten te begrijpen. Het huidige artikel beschrijft een protocol om de kwaliteit van recombinante septinecomplexen, die een centrale rol spelen bij celdeling en migratie, te zuiveren en te beoordelen.

Zuivering en kwaliteitscontrole van recombinante septinecomplexen voor celvrije reconstitutie

Leer een methode voor zuivering van dendritische filopodia-rijke fracties uit gekweekte hippocampale neuronen met behulp van TLCN-vitronectine-affiniteit. Deze techniek helpt onderzoekers eiwitten in onrijpe synapsen te identificeren.

Zuivering van de dendritische Filopodia-rijke Fractie

Meer video's verkennen