Hybride duidelijke/blauwe inheemse elektroforese voor de scheiding en de analyse van mitochondrial Ademhalingsketen supercomplexen

Supercomplexen zijn supramoleculaire samenstellingen gevormd door ademhalingsketencomplexen in het binnen-mitochondriale membraan. De vorming van deze supercomplexen wordt verondersteld om verscheidene structurele en functionele voordelen te verlenen, die verminderde productie van reactieve zuurstofsoorten, stabilisatie en efficiëntere assemblage van individuele ademhalingskettingcomplexen, de regeling van de ademhalingskettingactiviteit, en preventie van eiwitaggregatie in de eiwitrijke milieu van het binnenmembraan omvatten. Veranderingen in de assemblage en samenstelling van supercomplexen zijn dynamisch en blijken steeds meer ten grondslag te liggen aan veranderingen in de mitochondriale functie die tijdens fysiologische aanpassing worden waargenomen, evenals een verscheidenheid aan genetische en verworven ziekten.

Deze video presenteert een hybride helder /blauw native PAGE-protocol om supercomplexen op een nauwkeurige en tijdsrenorde op te lossen en te analyseren. Het belangrijkste voordeel van deze hybride heldere / blauwe native PAGE methode is dat het optimaal combineert verschillende aspecten van traditionele blauwe en duidelijke native PAGE protocollen, die het mogelijk maakt om de blootstelling aan detergentia en anionische verbindingen te verminderen tot een minimum in vergelijking met gepubliceerde protocollen. Optimale scheiding en analyse van supercomplexen wordt bereikt op grote gradiëntgels.

Deze procedure omvat een aantal delicate stappen die handmatige vaardigheden en zorgvuldige uitvoering vereisen. Visuele ondersteuning van het geschreven protocol geeft belangrijke tips die de implementatie van de techniek vergemakkelijken. Demonstreren van de procedure is Alexandrië, een promovendus uit mijn laboratorium.

Om te beginnen, centrifugeren de mitochondriën geïsoleerd uit het dierlijke weefsel in een 1,5-milliliter buis op 16, 000-keer-G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Gooi de supernatant weg en voeg het berekende volume van de ijskoude extractiebuffer met digitonin toe aan de buis om de mitochondriale pellet opnieuw op te zetten. Plaats buizen op een mini buis rotator en incubeer gedurende 30 minuten op vier graden Celsius bij een gemiddelde rotatiesnelheid.

Centrifugemonsters op 20, 400 keer-G gedurende 45 minuten bij vier graden Celsius om onoplosbare fragmenten te verwijderen. Breng de supernatant in een nieuwe buis op ijs. Als elektroforese niet op dezelfde dag wordt uitgevoerd, bewaar monsters bij min 80 graden Celsius.

Open de gietkamer. Plaats een 20 centimeter keer 22 centimeter buiten glasplaat in de kamer. Plaats een set van 1,5 milliliter afstandhouders met behulp van de uitlijningskaart om ervoor te zorgen dat ze stevig tegen de zijkant en hoeken van de kamer zitten.

Plaats een binnenglasplaat op de ruimters om de gel sandwich te vormen, en leg een plastic scheidingsplaat op de top van de glasplaat. Schik nog drie gel sandwich assemblage. Voeg meer acrylblokken of glasplaten toe indien nodig om de resterende ruimte in de kamer in te nemen.

Plaats een strook van parafilm in de groef alvorens de pakking stevig in de pakkinginkt te plaatsen. Plaats de plafondplaat op de kamer en draai alle zes schroeven aan. Ga door de gietkamer.

Plaats gradiënt eerst op een roerplaat met een magnetische roerder in de lichtmengkamer. Sluit de slang van de gietkamer aan op de gradiënt eerstgenoemde en bevestig de slang in de cassette van de peristaltische pomp. Zorg ervoor dat de stopcock van het verloop eerstgenoemde gesloten is.

Om vier gels te werpen, bereid 60 milliliter van 4% en 60 milliliter van 12% geloplossingen in twee Erlenmeyer-kolven en draai grondig om te mengen. Giet de 4%gel oplossing in de licht mengkamer, en de 12%in de zware reservoirkamer van de gradiënt voormalige. Stel de roersnelheid van de roerplaat in op 350 tpm.

Open vervolgens de stopcock en zet de pomp aan bij 35 rpm. Zodra het oplossingsniveau van de lichtfractie lager is dan de zware fractie, pauzeer de pomp en open de klepsteel tussen lichte en zware reservoirs. Laat breuken volume equilibrate en start de pomp opnieuw.

Zorg ervoor dat er geen bellen in het systeem en vast komen te zitten tussen glasplaten. Zodra de gradiënt gel volledig is gegoten, stop de pomp en overlay een milliliter water op elke gel sandwich om te voorkomen dat het drogen van de gel. Laat het twee uur polymeriseren.

Bereid 25 milliliter stapelen gel in Erlenmeyer kolf en wervel om grondig te mengen. Delicaat omkeren van de montage om water te verwijderen, en voeg 15-well kammen in elke gel sandwich. Giet stapelen gel en laat het polymeriseren voor twee uur.

Daarna steek je gel en sandwichklemmen in en verwijder je de kam. Met de korte glasplaat naar beneden, steek de gel sandwich in de koelkern. Herhaal aan de andere kant en plaats de kern in de elektroforese tank.

Giet 300 milliliter blauwe kathodebuffer in de binnenkamer van de elektroforesetank. Met een pipet en laadtips laad je 75 tot 175 microgram eiwit per put. In koude ruimte op vier graden Celsius, sluit de elektroden in de voeding en zet het op 150 volt, en lopen gel voor anderhalf uur, of totdat monsters zijn allemaal in de gradiënt gel.

Laadrepliceert van het monster in afzonderlijke putten om parallelle bepaling van in-gel activiteiten en immunoblot analyse van OXPHOS complexen mogelijk te maken. Verwijder blauwe kathodebuffer met pipet. Vervang door 300 milliliter Coomassie blauwe gratis kathode buffer, en lopen gel op 200 volt 's nachts in de koude kamer.

Bereid voor het einde van elektroforese in-gel activiteitsbuffers volgens het manuscript en bewaar ze in het donker bij kamertemperatuur. Stop met elektroforese en haal gel op. Snijd de plastic zak, zodat het kan worden geopend als een boek.

Snijd rijstroken door en breng gelbanen over in plastic zakken. Gebruik een warmteafdichter om twee van de drie zijden te verzegelen. Als er negatieve controle-experimenten worden uitgevoerd, voegt u remmers toe aan de testbuffers.

Voor drie experimentele monsters, voeg 20 milliliter in-gel activiteit buffer. Verwijder bubbels en verzegel de vierde kant van plastic zak. Incubeer gel lanes op 37 graden Celsius in het donker en controleer elke 15 minuten.

De incubatietijd varieert afhankelijk van de hoeveelheid eiwitten en complexen. Na incubatie, spoel gel rijstroken in water om reactie te stoppen, en beeld op een witte achtergrond voor complexe I, complex II, complex IV, of zwarte achtergrond voor complexe V.Voor dit voorbeeld werd een complexe IV in-gel activiteit uitgevoerd om supercomplexen geïsoleerd van verse muis lever mitochondriën visualiseren. De optimale hoeveelheid digitonin voor dit monster is vier gram per gram, omdat het een goede resolutie van monomeercomplex IV en supercomplexen met een hoog moleculair gewicht biedt.

Bij een lagere verhouding zijn banden niet duidelijk en verdwijnen ze in een uitstrijkje tijdens elektroforese, terwijl het gebruik van een hogere verhouding van digitonin leidt tot verstoring van supercomplexen met een hoog moleculair gewicht. Lever mitochondriën geïsoleerd van een muis werden behandeld met de optimale hoeveelheid digitonine om ademhalingssupercomplexen te extraheren. De elektrofororetische mobiliteit van OXPHOS complexen wordt iets verminderd wanneer eiwitten worden gescheiden met behulp van hybride clear / blue native PAGE voorwaarden, in vergelijking met standaard native PAGE, als gevolg van verminderde hoeveelheid Coomassie blauw.

Deze mobiliteitsverschuiving is groter voor complexe IV monomeren, gevolgd door complexe V monomeren, en complexe I.The blauwe achtergrond is lager in de hybride clear native / blue native PAGE in vergelijking met blue native PAGE. Hoge achtergrondniveaus na blauwe native PAGE maskeert de in-gel activiteitskleuring voor complex II volledig en verbetert het achtergrondgeluid dat gepaard gaat met de activiteit van complexe IV-dimers. Voor dit protocol is titratie van de monsters van belang met verschillende hoeveelheden digitonine van cruciaal belang om de omstandigheden te identificeren die een optimale oplosking mogelijk maken, met behoud van enzymactiviteit en fysiologische eiwitinteracties.

Alle stappen met betrekking tot de gelgietsel moeten zorgvuldig worden uitgevoerd om een optimale helling voor een goede monsterscheiding te vormen. Er moet ook uiterste zorg worden genomen voor de manipulatie van deze grote en fragiele gels. Houd ze altijd met meerdere vingers met behulp van het hoge percentage van de gel.

Met deze hybride clear/blue native PAGE-methode worden monsters slechts kort blootgesteld aan de anionische kleurstof Coomassie blauw aan het begin van elektroforese zonder blootstelling aan andere detergentia. Dit maakt het mogelijk om supercomplexen net zo effectief te scheiden en op te lossen als met traditionele blue native PAGE-methoden, terwijl het negatieve effect van hoge Coomassie-blauwe niveaus op in-gel-activiteitstesten en labiele eiwit-eiwitinteracties binnen supercomplexen worden vermeden. Met dit protocol is het daarom mogelijk om nauwkeurige en snelle in-gel activiteitsmetingen te combineren met analytische technieken met 2D-elektroforese, immunodetection en/of proteomics-analyse van supercomplexen.