Dissectie van de Drosophila pop netvlies voor Immunohistochemistry, westelijke analyse en RNA isolatie

Dit protocol is belangrijk omdat dit een efficiënte methode is voor de isolatie van Drosophila popweefsel voor meerdere downstream toepassingen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de snelle dissectie van een groot aantal poppenogen mogelijk maakt zonder het weefsel te beschadigen. Dissectie van de Drosophila popal netvlies zal een uitdaging zijn voor beginners.

Het beoefenen van de techniek is de beste manier om de snelheid van de dissecties en de kwaliteit van de resultaten te verbeteren. Na het plaatsen van de Drosophila pop op een zwart ontleden schotel, leg een vers stuk van dubbelzijdige tape op de ontleden schotel, uit de buurt van de pop, en gebruik een paar tangen om zorgvuldig plaats de poppen dorsale kant op de tape. Plaats de schotel onder een stereomicroscoop, en gebruik tangen om het operculum van elke pop te verwijderen.

Gebruik microdissection schaar om elke pop geval snijden, waardoor het open worden geflapt om het hoofd, thorax, en voorste buiksegment onthullen, en zet de randen van de pop geval aan de dubbelzijdige tape. Doorboor de buik van elke pop met scherpe tangen en verwijder de pop uit zijn popgeval. Plaats de pop op de dissectie schotel, uit de buurt van de tape, en bedek de pop met 400 microliters van ijskoude PBS.

Gebruik tangen om elk een greep door de buik, en gebruik de microdissection schaar om een schone dwarsdoorsnede incisie te maken door de thorax, het snijden van de poppen in de helft. Met behulp van twee paar fijne tangen, pak de snijkanten van elk thoraxeptheel en scheur geleidelijk de thorax en hoofdcapsule open, waardoor het ooghersenencomplex en het omliggende vetweefsel worden blootgedeeld. Dan, zonder het weefsel te grijpen, gebruik tangen om elke doorschijnende, off-white, halter-vormige oog-hersenen complex, weg van de overblijfselen van het hoofd capsule gids.

Na het ontleden van zes tot 10 poppen, snijd een micropipet tip met een schoon scheermesje tot een diameter van ongeveer een millimeter, en smeer de tip met een mengsel van PBS en vet. Gebruik de gesmeerde pipettip om de ooghersencomplexen over te brengen naar een put van een negen-goed glazen schotel met 400 microliter PBS op ijs, en breng het weefsel vervolgens in 20 microliter pbs over in ten minste 250 microliter fixatief voor een 35-minuten durende incubatie op ijs. Gebruik aan het einde van de fixatie dezelfde pipettip om het weefsel gedurende vijf tot tien minuten op ijs over te brengen naar een derde put met 400 microliter verse PBS.

Om een niet-specifieke antilichaam binding te blokkeren, breng de ooghersencomplexen over in 400 microliter van PBS plus Triton X voor een incubatie van 10 tot 60 minuten op ijs. Aan het einde van de incubatie, aliquot 10 microliters van de primaire antilichaam oplossing in het noodzakelijke aantal putten van een 72-well microwell plaat, en gebruik een P10 luchtverdringende micropipet met een gemodificeerde 0,5-millimeter tip gesmeerd met PBS plus Triton X om niet meer dan vijf oog-hersenen complexen en niet meer dan drie microliter pbs overbrengen in elk goed van antilichaam oplossing. Na een nachtelijke incubatie bij vier graden Celsius, was de monsters twee keer in 400 microliters van PBS plus Triton X in een put van een negen-goed glazen schotel gedurende vijf tot 10 minuten per wasbeurt.

Breng na de derde wasbeurt het weefsel gedurende twee uur bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht, na drie wasbeurten van vijf tot tien minuten in 400 microliter PBS plus Triton X en één wasbeurt in PBS, gedurende twee uur over in 100 microliter van PBS. Vervolgens, equilibrate de monsters in 200 microliter van montage medium voor een tot twee uur. Breng aan het einde van de incubatie de monsters over naar een microscoopdia en gebruik een stevige wolfraamnaald om een ooghersenencomplex vast te pinnen op de dia onder een ontledenmicroscoop.

Gebruik vervolgens een fijne wolfraamnaald om elk oog weg te snijden van de bijbehorende optische kwab en om elk oog naar het oppervlak van de microscoopdia te manoeuvreren, zodat het basale oppervlak van het oog naast de glijbaan grenst. Breng vervolgens een schone coverlip over de monsters aan en sluit de coverslip af met nagellak. Om pupal oogweefsel voor te bereiden op westerse vlekanalyse, ontleed je eerst 10 tot 16 poppen zoals eerder aangetoond in twee batches, 10 tot 15 minuten uit elkaar in PBS aangevuld met protease en fosfataseremmers.

Na het kort spoelen van de geïsoleerde ooghersencomplexen twee keer in individuele putten van een negen-goed glazen schotel op ijs in 400 microliters van PBS plus remmers, breng alle van de oog-hersenen complexen in 400 microliters van ijskoude PBS plus remmers gedecanteerd op een schone zwarte ontleden schotel. Gebruik onder een schone ontledenmicroscoop een stevige wolfraamnaald en een fijn scheermesje om elk oog van de optische kwab netjes te snijden en gebruik een gesmeerd puntje om de ooghersencomplexen over te brengen in vijf microliter pbs plus remmers in een 500-microliter microcentrifugebuis op ijs. Voeg vervolgens vijf microliters westerse weefsellysebuffer en 10 microliter 2x geconcentreerde eiwitmonsterbuffer toe aan de buis.

Om de ooghersencomplexen te verwerken voor RNA-extractie, het dragen van handschoenen, het schoonmaken van het benchtopblad, microscoop, ontleedgereedschappen en zwarte ontleedschotels met 70% ethanol en RNase ontsmettingsreagens. Na het toestaan van het gebied te drogen, ontleden een totaal van 30 tot 40 poppen in partijen van zes tot acht. Na elke partij van oog-hersenen complexen zijn ontleed, de overdracht van de oog-hersenen complexen van de negen-goed schotel in 400 microliters van verse, ijskoude, nuclease-vrije PBS op een schone ontleden schotel, en gebruik een stevige wolfraam naald en een fijn scheermesje om schoon te snijden elk oog van de optische kwab.

Wanneer alle ogen voor een partij zijn verwijderd, breng ze dan over in een steriele, RNase-vrije microcentrifugebuis en flash-freeze de monsters in vloeibare stikstof voordat u doorgaat naar de volgende partij. Het verpoppende oog is een gemakkelijk toegankelijk weefsel dat dient als een uitstekend model voor het onderzoeken van ontwikkelingsprocessen, waaronder die welke morfogenese stimuleren. Ongeveer 40 uur na de vorming van puparium wordt de uiteindelijke opstelling van cellen bereikt.

Dit is een ideale leeftijd om de gevolgen van een genetische mutatie of gemodificeerde genexpressie te beoordelen. Bijvoorbeeld, na ectopische expressie van Diap1, een kernremmer van apoptose, de daaruit voortvloeiende toename van het aantal roostercellen kan worden vergeleken met die waargenomen in een controle netvlies. Apoptose kan ook directer worden beoordeeld door antilichamen te gebruiken om een dood caspase-1 te activeren of door andere benaderingen te gebruiken voor het opsporen van stervende cellen.

Westerse vlekkenanalyses van ooglysaten kunnen worden gebruikt om de aanwezigheid of relatieve expressie van proteïnen van belang te bepalen of om eiwitexpressie op verschillende ontwikkelingstijdpunten te vergelijken. Het is belangrijk op te merken dat het ontleden van meer dan 60 ogen per genotype of experimentele conditie optimaal is voor het isoleren van voldoende RNA van hoge kwaliteit. Het belangrijkste om te onthouden is dat de pupal retina is zeer kwetsbaar, en grote zorg moet worden genomen tijdens de dissectie om de integriteit ervan te waarborgen.