Studeren oxidatieve Stress veroorzaakt door de streptokokken groep Mitis in Caenorhabditis elegans

In dit protocol laten we zien hoe je een vrije leefmethode c. elegans gebruiken om de pathogeniteit te verduidelijken die wordt veroorzaakt door waterstofperoxide geproduceerd via Streptococci van de Mitis Group. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we pathogeniteit en de activering van stressreacties in de worm kunnen bestuderen met behulp van een duurzame biologische bron van reactieve zuurstofsoorten in tegenstelling tot chemische bronnen Voor een liter media voeg 30 g Todd Hewitt poeder, 2g gistextract en 20g ager toe aan een 2 liter Erlin Myer-kolf.

Voeg 970 ml gedeïsized water toe aan de inhoud van de kolf en doe er een roerstaaf in. Gebruik aluminiumfolie om de opening te dekken. Autoclave de media in de kolf bij een temperatuur van 121 graden Celsius en druk van 15 pond per vierkante inch gedurende 30 minuten.

Zet daarna de kolf op een roerplaat om af te koelen met zacht roeren. Onder een laminaire kap, giet de media in de juiste grootte, steriele petrischaaltjes. Laat de media 2 uur drogen.

Bewaar daarna de platen op 4 graden Celsius voor maximaal 1 maand. Verwarm vóór de bereiding van Mitis Group streptococci de THY agar platen in een couveuse tot 37 graden Celsius. Daarna gebruik maken van een steriele lus te strepen uit de gewenste stammen van strepticocci op de plaatsen.

Zet vervolgens de platen in een kaarsenpot en broed de pot op 37 graden Celsius 's nachts voor ongeveer 18 uur om een microerofiele omgeving te bieden. De volgende dag, verwijder de platen uit de kaars pot en gebruik een steriele lus te plukken geïsoleerde kolonies. Inenting 15 ml steriele conische buizen met 2 ml THY bouillon.

Sluit de doppen strak en broed de buizen bij 37 graden Celsius onder statische omstandigheden. Pre-warme THY platen in een couveuse tot 37 graden Celsius voeg 50 microliter oplossing met 1000 eenheden catalase op de THY-plaat. Gebruik een steriele spreader om de catalase oplossing te verspreiden en laat de platen drogen op de laminaire stroomkap gedurende 30 minuten.

Om de platen met de streptococcusstammen te zaaien, gebruik een pipet om 80 microliters van 's nachts gekweekte culturen aan de plaat toe te voegen en een steriele spreader te gebruiken om de bacteriën volledig over het agaroppervlak te verspreiden. Incubeer de platen op 37 graden Celsius in een kaarsenpot 's nachts. Als een controle, op twee NGM platen, voeg 80 microliters van 's nachts geteelde culturen van E.coli OP-50 voor zaaien.

Incubeer de platen op 37 graden Celsius 's nachts. De volgende dag, verwijder de platen uit de kaars pot en laat de platen afkoelen tot kamertemperatuur. Met behulp van een steriele worm pick, breng 30 L4 larven van de NGM voederplaten naar de streptokokken gezaaide THY platen.

Broed de platen uit op 25 graden Celsius. Tel onder een ontledenmicroscoop het aantal levende en dode L4-larven op elke plaat op verschillende tijdstippen. Gebruik de steriele worm pick om voorzichtig prikken de wormen en bepalen of ze dood of levend zijn.

In eerste instantie, score de wormen als dood of leven elke 30 minuten. Wanneer wormen snel beginnen te sterven, score ze op 15 minuten intervallen. De test duurt 5 tot 6 uur.

Herhaal het experiment daarna nog twee keer. Om het agarosepad voor te bereiden, plak labtape in de lengte langs twee glazen platen. Dit zal de dikte van de agarose pads bepalen.

Plaats een schone glazen schuif tussen de twee afgeplakte dia's. Los agarose op in gedeïsteerd water om 2 gewichtsvolume procent te maken en verwarm de oplossing in een magnetron. Gebruik een pipet om 100 microliters gesmolten agarose op het midden van de schone glijbaan te plaatsen.

Plaats onmiddellijk een andere schone glazen glijbaan op de top van de gesmolten agarose en druk zachtjes naar beneden om een pad te maken. Laat de agarose stollen en verwijder vervolgens de bovenste dia. De agarose pad is klaar voor gebruik.

Verwarm THY-platen tot 37 graden Celsius. Zaad de platen met een streptokokken stammen zoals eerder gedaan in de overlevingstesten. Zaad 3 NGM platen met E-coli OP-50 als controle en incubaal op 37 graden Celsius 's nachts.

De volgende dag, koel de platen op kamertemperatuur. Gebruik M9W buffer om L4 larven van NGM of NGM RNAi voerplaten te wassen in 15 ml conische buizen. Draai de buizen op 450 keer g, gedurende een minuut in een centrifuge.

Decanteer de supernatant en voeg 10 ml M9W toe aan elke buis. Herhaal de centrifugaal stap nog drie keer. Stel de wormen opnieuw op in 250 microliter M9W en plaats drie 5 microliter druppels van de wormsuspensie op een schoon petrischaaldeksel.

Schat onder een ontledenmicroscoop het aantal wormen per microliter. Voeg met behulp van een pipet ongeveer 100 L4-larven toe aan elke THY streptokokken ingezaaide en NGM E.coli gezaaide platen. Gebruik drie platen per stam van bacteriën.

Incubeer de platen voor 2 tot 3 uur bij 25 graden Celsius. Verwijder vervolgens de platen uit de couveuse. Was ze met M9W en verzamel de wormen in 15ml conische buizen.

Was de wormen drie keer zoals eerder gedaan in de centrifugale stap. Verwijder het grootste deel van de M9W door aspiratie. En voeg 500 microliter M9W met 2 millimolar natriumajaide of tetramisole hydrochloride toe aan de wormpellet voor anesthesie.

Incubeer de buis met wormkorrels bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Laat vervolgens 15 microliter van de wormsuspensie op een voorbereid agorosepad vallen. Visualiseer onder een fluorescerende microscoop de lokalisatie van skn-1 met behulp van Fitzy en Dappy filters.

Beeldwormen bij 10 keer en 20 keer vergrotingen. Scoor de wormen op basis van drie niveaus van lokalisatie;lage lokalisatie, waar geen nucleaire lokalisatie wordt waargenomen, medium lokalisatie, met SKN 1 BCGFP in het voorste of achterste van de worm, en hoge lokalisatie, waar nucleaire lokalisatie van skn-1 BCGFP wordt waargenomen in alle darmcellen. In dit experiment doodden leden van de Mitis Group de wormen snel, in tegenstelling tot S.mutans, S.salivarius en niet-pathogene E.coli OP-50.

Toen catalase werd aangevuld met THY ager, werd het doden van de wormen afgeschaft. De dood van de wormen werd niet waargenomen op de delta spxB mutant stam in vergelijking met de wilde-type en compliment stammen. Deze gegevens suggereren dat de waterstofperoxide geproduceerd door de Mitis Group bemiddelt het doden van de wormen.

Een significante afname van de overleving van de skn-1 knockdown wormen werd waargenomen in vergelijking met de vector controle behandeld wormen. Een soortgelijk dodend fenotype werd waargenomen met de skn-1 mutant stam en de N2 wild-type wormen. Dit toont aan dat skn-1 de overleving van de wormen op de Mitis Groep beïnvloedt.

Lokalisatie van skn-1 BCGFP werd waargenomen bij wormen die werden blootgesteld aan de wild-type N-compliment stammen en niet in reactie op de Delta spxB mutant stam van de S cordonae. Nadat onderdelen van de P38-kaart kinase-pad waren afgebroken, werd de verminderde lokalisatie van skn-1 BCGFP en knockdown behandelde wormen, ten opzichte van de met vectorcontrole behandelde wormen, waargenomen. Door het gebruik van de streptococci c.

elegans systeem, de effecten van waterstofperoxide op endoplasmische verticulaire stress, mitochondriale schade, mitophogie, en tophogy kan verder worden bestudeerd. Verder kunnen mechanismen worden geïdentificeerd waarmee waterstofperoxide fungeert als een virilescentiefactor om immuunreacties uit te lokken door de kernprocessen van de cel te verstoren.