Name: Meten van enzymatische stabiliteit door isothermische titratie calorimetrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Leer enzymatische stabiliteit meten door isothermische titratiecalorimetrie. Deze methode biedt directe inzichten in thermische stabiliteit van enzymactiviteit en vereist minder manuren dan traditionele assays.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. voorbereiding van de monsters
<ol><li>
1000 mL 0,1 M natrium acetaat buffer met een pH van 4.6
	<ol>
<li>800 mL gedestilleerd water in een bekerglas van 1000 mL studeerde af te meten.</li>
		<li>Weeg 8,2 g watervrij natriumacetaat en toe te voegen aan het bekerglas.</li>
		<li>Plaats het bekerglas op een bord roer, breng een roer in het bekerglas, zet op het roer plaat en roer tot het volledig is opgelost.</li>
		<li>Wanneer de watervrije Natriumacetaat volledig is opgelost, wordt de pH van de oplossing met een gekalibreerde pH-meter.</li>
		<li>Voeg 1 M HCl of NaOH dienovereenkomstig te verkrijgen van de gewenste pH 4.6.</li>
		<li>Voeg gedistilleerd water totdat het totale volume 1000 mL is.</li>
		<li>Bewaren bij kamertemperatuur tot gebruik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Enzym oplossing
	<ol>
<li>10 mL van de cilinder van de oplossing binnen het bereik van de 10-30 mg/mL door eerste meten 8 mL van de 0,1 M natrium acetaat buffer pH 4.6 in een 15 mL studeerde enzym voor te bereiden.</li>
		<li>Bufferoplossing toevoegen in een conische tube van 15 mL met enzym en schud krachtig totdat het enzym heeft opgelost.</li>
		<li>Voeg meer bufferoplossing totdat het totale volume 10 mL is.</li>
		<li>De enzym-oplossing bij 4 ° C bewaren tot gebruik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Substraat oplossing
	<ol>
<li>Ter voorbereiding van een substraat oplossing binnen het bereik van 300-600 mM, berekent het bedrag van substraat nodig om de gewenste concentratie in gram.</li>
		<li>Weeg af uit het substraat en breng in een bekerglas van 100 mL glas</li>
		<li>Meten van 20 mL van de bufferoplossing met behulp van een 25 mL studeerde aan de cilinder en vervolgens toevoegen aan het glas bekerglas.</li>
		<li>Plaats het bekerglas op een roer-plaat en breng een magnetische roer af in het bekerglas. Zet de warmte en de opzwepende snelheid dienovereenkomstig aan te passen.</li>
		<li>Toestaan om te blijven totdat het substraat is opgelost.</li>
		<li>Giet de substraat oplossing in een conische tube van 50 mL en Voeg 0,1 M natrium acetaat buffer pH 4.6 totdat het totale volume 45 mL is. Meng door schudden.</li>
		<li>Het substraat oplossing bij kamertemperatuur bewaren tot gebruik.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. uitvoeren van het experiment
<ol><li>Voorbereiding van het ITC-instrument<ol>
<li>Zorg ervoor dat de referentie cel is geladen met 350 ÂµL van gedistilleerd water. Voordat het enzym in de steekproef cel laden, controleert u of dat de steekproef-cel is schoongemaakt.</li>
		<li>Schoonmaak protocol-Fill de laden spuit met 500 µL van 2% reinigingsoplossing (Tabel of Materials), schuif voorzichtig de naald in de monster-cel, vult u de cel en Verwijder langzaam de vloeistof met behulp van de dezelfde spuit. Het afvoeren van de vloeistof in een bekerglas. Herhaal deze stap tweemaal met 2% reinigingsoplossing (Tabel of Materials), driemaal met 70% ethanol en vervolgens tien keer wassen met gedestilleerd water.</li>
		<li>Vul de spuit laden met 450 µL van enzym oplossing, zorgvuldig de naald helemaal naar de onderkant van het monster cel invoegen en druk op de zuiger naar de 100 µL regel langzaam om te voorkomen dat de vorming van luchtbellen.</li>
		<li>Spoel de injectiespuit 50 µL titratie met gedestilleerd water driemaal door het plaatsen van de naald-tip in water langzaam inneemt van het water in de spuit vervolgens, verstrekking van het water in een afvalcontainer.</li>
		<li>Verwijder Residuele water door te spoelen met substraat oplossing driemaal.</li>
		<li>Vul de spuit titratie met substraat oplossing door te tekenen van de oplossing tot de spuit volledig zonder eventuele luchtbellen is.</li>
		<li>Met de spuit nog steeds in het substraat oplossing, verwijder de zuiger en toestaan van ongeveer 2 µL van lucht voor het invoeren van de top van de spuit en opnieuw de plunjer.</li>
		<li>Verwijder het handvat van de buret van het ITC, plaatst u de spuit in de buret greep en schroef tot strak.</li>
		<li>Het puntje van de roerder met een pluisvrije weefsel, veeg dan zorgvuldig de buret greep plaats in de ITC-instrument en het vergrendelen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. het opzetten van ITCrun
<ol><li>Open ITCrun op de computer en klikt u op instellen.</li>
	<li>Klik onder roeren tarief en stel tot 350 tpm. Controleer de grootte van de spuit (µL) en controleer dat het bedraagt 50 µL.</li>
	<li>De temperatuur en druk op Update. Het wordt aanbevolen dat deze stap worden uitgevoerd ten minste 1 uur vóór de voorbereiding van het ITC. Dit laat voldoende tijd voor het instrument opwarmen of afkoelen zo nodig.</li>
	<li>Voor de instellingen van het experiment, selecteert u incrementele titratie.</li>
	<li>Klik op Invoegen om de opstelling van de injecties. Aanpassen van de interval van de injectie tot 5.400 s, geïnjecteerde volume (µL) tot 4 en aantal injecties tot en met 4. Druk op OK om de instellingen te bevestigen.</li>
	<li>Selecteer in het vak van de evenwichtsinstelling, Auto-equilibreer en Large verwacht heats. (Als de verwachte voorrondes klein zijn, een kleine kunt selecteren onder verwachte heats; maar dit zal de verhoging van de equilibratietijd.)</li>
	<li>De eerste basislijn ingesteld op 300 s.</li>
	<li>Om te beginnen met de uitvoering, klik het begin symbool naast roeren tarief en klikt u op Start naast de moersleutel symbool.</li>
	<li>Sla het bestand op en laat het instrument uit te voeren.</li>
</ol>4. het analyseren van gegevens
<ol><li>Open het bestand in NanoAnalyze. Klik op gegevens en selecteert u gegevenskolommen.</li>
	<li>Selecteer alle gegevens, kopieer en plak de gegevens in Microsoft Excel.</li>
	<li>Nul basislijn aanpassen door de waarde bij 300 vereist s te maken nul. Deze correctie toepassen op de hele kolom met warmte tarief waarden.</li>
	<li>Vindt u de waarde van de minimum- of maximumwaarde van het warmteverbruik voor elke injectie met behulp van de vergelijking: =MIN(cell:cell) of MAX(cell:cell). Elk gegevenspunt vertegenwoordigt de piek enzymatische activiteit van het enzym bij elke injectie.</li>
	<li>Plot de grafieken van de MIN of MAX waarden tegen de tijd waarop de waarde heeft plaatsgevonden tijdens de titratie.</li>
</ol>

<ol><li>Anastas, P., Eghbali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+chemistry%3A+principles+and+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Green chemistry: principles and practice.</a> Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).</li>
<li>Jin, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+Recombinant+Glucose+Isomerase+for+Efficient+Production+of+High+Fructose+Corn+Syrup%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biochemistry+Biotechnoiogy%22%5BJournal%5D)">Immobilization of Recombinant Glucose Isomerase for Efficient Production of High Fructose Corn Syrup.</a> Applied Biochemistry Biotechnoiogy. 183 (1), 293-306 (2017).</li>
<li>Budak, ŞÖ, Koçak, C., Bron, P. A., de Vries, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBudak%2C+%C5%9E%C3%96+%22Microbial+Cultures+and+Enzymes+Dairy+Technology%22">Microbial Cultures and Enzymes Dairy Technology</a>. , 182-203 (2018).</li>
<li>van Donkelaar, L. H. G., Mostert, J., Zisopoulos, F. K., Boom, R. M., van der Goot, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+enzymes+for+beer+brewing%3A+Thermodynamic+comparison+on+resource+use%5BTitle%5D)+AND+%22Energy%22%5BJournal%5D)">The use of enzymes for beer brewing: Thermodynamic comparison on resource use.</a> Energy. 115, 519-527 (2016).</li>
<li>Rodriguez-Colinas, B., Fernandez-Arrojo, L., Ballesteros, A. O., Plou, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galactooligosaccharides+formation+during+enzymatic+hydrolysis+of+lactose%3A+Towards+a+prebiotic-enriched+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Galactooligosaccharides formation during enzymatic hydrolysis of lactose: Towards a prebiotic-enriched milk.</a> Food Chemistry. 145, 388-394 (2014).</li>
<li>Lawrence, P. B., Price, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+PEGylation+influences+protein+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">How PEGylation influences protein conformational stability.</a> Current Opinions in Chemical Biology. 34, 88-94 (2016).</li>
<li>Bernal, C., Rodriguez, K., Martinez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+enzyme+immobilization+and+protein+engineering%3A+An+alternative+path+for+the+development+of+novel+and+improved+industrial+biocatalysts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Integrating enzyme immobilization and protein engineering: An alternative path for the development of novel and improved industrial biocatalysts.</a> Biotechnology Advances. 36 (5), 1470-1480 (2018).</li>
<li>Rigoldi, F., Donini, S., Redaelli, A., Parisini, E., Gautieri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Engineering+of+thermostable+enzymes+for+industrial+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Bioengeneering%22%5BJournal%5D)">Review: Engineering of thermostable enzymes for industrial applications.</a> Applied Bioengeneering. 2 (1), 011501(2018).</li>
<li>Johnson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+calorimetry+as+a+tool+for+protein+folding+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 531 (1), 100-109 (2013).</li>
<li>Chen, N. G., Gregory, K., Sun, Y., Golovlev, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+model+of+thermal+deactivation+of+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Transient model of thermal deactivation of enzymes.</a> Biochimica et biophysica acta. 1814 (10), 1318-1324 (2011).</li>
<li>Mason, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorimetric+Methods+for+Measuring+Stability+and+Reusability+of+Membrane+Immobilized+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Jounal+of+Food+Science%22%5BJournal%5D)">Calorimetric Methods for Measuring Stability and Reusability of Membrane Immobilized Enzymes.</a> Jounal of Food Science. , (2017).</li>
<li>Leksmono, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Lactase+Enzymatic+Activity+in+the+Teaching+Lab%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab.</a> Journal of visualized experiments : Journal of Visual Experiments. (138), e54377(2018).</li>
</ol>

Een groot voordeel van de ITC enzym stabiliteit test hier beschreven is automatisering. Zodra alle passende buffers en oplossingen zijn gemaakt, is de tijd van de set-up voor elke assay ongeveer 15 min. voor de persoon die de test doet. In tegenstelling, de conventionele testen voor invertase en lactase-activiteit vereisen ongeveer 2 h met voortdurende betrokkenheid van de persoon die de test doet en veel enzymatische activiteit testen nemen aanzienlijk meer manuren. In een eerdere publicatie, hebben wij aangetoond hoe g...

Enzymen zijn eiwitten staat een breed scala aan organische reacties te katalyseren. De meeste enzymen functie in waterige oplossing bij in de buurt van neutrale pH dus het vermijden van het gebruik van agressieve oplosmiddelen. Vanwege hun hoge selectiviteit, enzym-gekatalyseerde reacties produceren minder (in sommige gevallen geen bijproducten) bijproducten dan niet-selectieve katalysatoren zoals zuren en basen1. Dit is vooral relevant in de voedingsmiddelen verwerkende waar alle chemische reacties moeten gebeuren zodat het uiteindelijke product veilig voor menselijke consumptie is. Op dit moment worden enzymen gebruikt voor het produceren van hoge fructose corn siroop2, kaas3, bier4, lactose-vrij melk5en andere belangrijke voedingsmiddelen. Hoewel dit document richt zich op enzym gebruik in de voedingsindustrie, zijn er vele andere toepassingen voor enzymen waaronder in groene chemie en drug synthese.
Het nut van enzymen wordt beperkt door de stabiliteit van de enzymactiviteit, die afhangt van het behoud van de driedimensionale structuur van het enzym. De structuur van het enzym kan worden gestabiliseerd door wijzigingen zoals PEGylation6, immobilisatie op een stevige steun7, genetische modificaties8en formuleringen. Momenteel, enzym stabiliteit wordt meestal gemeten door differentiële scanning calorimetrie (DSC) en eindpunt enzymactiviteit testen9. DSC meet de temperatuur waarbij een enzym ontvouwt; Hoe hoger de temperatuur, hoe meer stabiele de structuur. Verlies van activiteit treedt echter vaak op bij een lagere temperatuur dan nodig te ontvouwen de enzym of domeinen binnen de enzym-10. DSC is daarom niet voldoende om te bepalen of een wijziging van het enzym de stabiliteit van de enzymactiviteit verhoogt. Eindpunt enzym testen zijn meestal tijd intensieve, vereisen meerdere monsters, en vaak een gekoppelde colorimetrische reactie die geldt niet voor zeer gekleurd of ondoorzichtig oplossingen of schorsingen te betrekken.
Dit werk wordt een methode voor rechtstreekse meting van de stabiliteit van de enzymactiviteit gedemonstreerd door isothermische titratie calorimetrie (ITC). ITC meet de snelheid hitte vrijgegeven of geabsorbeerd in de loop van een reactie. Aangezien bijna alle reacties produceren of warmte absorberen, kan ITC worden gebruikt voor de meeste enzym-gekatalyseerde reacties, met inbegrip van de reacties die niet over een gekoppelde reactie of optreden in ondoorzichtige media zoals melk. ITC is gebruikt voor vele decennia voor het meten van chemische kinetische parameters voor vele soorten reacties, maar het protocol hier gepresenteerd richt zich op het gebruik van ITC voor het meten van het warmteverbruik van de piek van enzym-gekatalyseerde reacties en toont aan dat de enzymactiviteit lineair is gecorreleerd met de pieksnelheid voor warmte. ITC metingen van piek warmte tarieven zijn meestal autonome en weinig personeel tijd nodig om te installeren en te analyseren.

<table><tbody><tr><td>a-Lactose</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>onbekend (te oud)</td><td>500g</td></tr><tr><td>Sodium Acetaat, Watervrij 99% min</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13184-30</td><td>250g</td></tr><tr><td>Lactase&nbsp;</td><td>MP Bio</td><td>100780</td><td>5g</td></tr><tr><td>Hydrochloorzuur Oplossing, 1N&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>SA48-500</td><td>500mL</td></tr><tr><td>Benchtop Meter- pH</td><td>VWR</td><td>89231-622</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 70%</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP8231GAL</td><td>1gallon</td></tr><tr><td>Micro-90</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>NC024628</td><td>1L (reinigingsoplossing)</td></tr></tbody></table>

meten van enzymatische stabiliteit door isothermische titratie calorimetrie

Measuring Enzymatic Stability by Isothermal Titration Calorimetry

Dit werk toont een nieuwe methode voor het meten van de stabiliteit van de enzymactiviteit door isothermische titratie calorimetrie (ITC). De piek warmteverbruik waargenomen na een enkele injectie van het substraat oplossing in een oplossing van het enzym is gecorreleerd met enzymactiviteit. Meerdere injecties van het substraat in dezelfde enzym oplossing na verloop van tijd weergeven het verlies van de enzymactiviteit De bepaling is autonoom, waarvoor weinig personeel tijd, en is van toepassing op de meeste media en enzymen.

De representatieve resultaten in Figuur 1 en Figuur 5 worden gegevens uit twee enzymen, lactase en invertase verschijnen. Lactase en invertase katalyseren de hydrolyse van een disaccharide in twee monosacchariden, endothermically en exotherm, respectievelijk. Beide enzymatische reacties werden uitgevoerd bij concentraties die uitgesloten van de verzadiging van het enzym.
De lactase gegevens aantonen hoe ITC gegevens kunnen worden gebr...

De thermische stabiliteit van enzymactiviteit is gemakkelijk gemeten door isothermische titratie calorimetrie (ITC). Meeste proteïne stabiliteit testen momenteel gebruikt maatregel eiwit ontvouwen, maar geven geen informatie over enzymatische activiteit. ITC kan directe bepaling van het effect van wijzigingen van het enzym op de stabiliteit van de enzymactiviteit.

Meten van enzymatische stabiliteit door isothermische titratie calorimetrie

This work demonstrates a new method for measuring the stability of enzyme activity by isothermal titration calorimetry (ITC). The peak heat rate observed ...

Het gebruik van enzymen als katalysatoren in reacties kan de hoeveelheid energie die nodig is voor de reactie verminderen en toxische bijproducten verminderen. Het gebruik van enzymen in de industrie is echter beperkt, omdat enzymen niet stabiel zijn en duur kunnen zijn. Dit protocol kan de hoeveelheid tijd die nodig is om te bepalen of de omstandigheden schadelijk zijn voor enzymactiviteit verminderen, of dat wijzigingen in het enzym de stabiliteit ervan hebben verhoogd.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het minder manuren vereist dan traditionele enzymstabiliteitstesten. Bovendien kan dit protocol worden gebruikt met een breed scala van enzymen, omdat het kan worden gebruikt met elke reactie die releases of absorbeert warmte. Om te beginnen, bereid 0,1 molaire natriumacetaat buffer.Meet 800 milliliter gedestilleerd water in een 1.000 milliliter afgestudeerd beker. Weeg vervolgens 8,2 gram watervrije natriumacetaat en voeg het toe aan het bekerglas. Leg het bekerglas op een roerplaat.Plaats een roerstaaf in het bekerglas, en zet de roerplaat om het te roeren totdat volledig opgelost. Wanneer het watervrije natriumacetaat volledig is opgelost, gebruikt u een gekalibreerde pH-meter om de pH van de oplossing te meten. Gebruik een pipet om 1 molaire zoutzuur of natriumhydroxide dienovereenkomstig toe te voegen om de gewenste pH bij 4.6 te verkrijgen.Voeg gedestilleerd water toe in het bekerglas tot het totale volume 1.000 milliliter bereikt. Om de enzymoplossing voor te bereiden, meet u in een 15 milliliter gegradueerde cilinder 8 milliliter van de 0,1 molaire natriumacetaatbuffer. Voeg vervolgens de bufferoplossing toe in een conische buis van 15 milliliter met enzym en schud krachtig totdat het enzym is opgelost.Voeg meer buffer oplossing tot het totale volume bereikt 10 milliliter. Bewaar de enzymoplossing op 4 graden Celsius tot gebruik. Om de substraatoplossing voor te bereiden, weegt u het substraat af en plaatst u het in een glazen bekerglas van 100 milliliter.Gebruik een gegradueerde cilinder om 20 milliliter van de bufferoplossing te meten en voeg deze vervolgens toe aan de glazen beker. Plaats het bekerglas op een roerplaat en plaats een magnetische roerstaaf in het bekerglas. Zet het vuur aan en pas de roersnelheid daarop aan.Laat het roeren doorgaan totdat het substraat is opgelost. Giet de substraatoplossing in een conische buis van 15 milliliter en voeg de eerder bereide natriumacetaatbuffer toe, totdat het totale volume 45 milliliter is. Schud de buis te mengen.Bewaar de substraatoplossing bij kamertemperatuur tot gebruik. Open ITC Run op de computer en klik op setup. Klik op roersnelheid en stel in op 350 rpm.Controleer de spuit grootte is op 50 microliter. Stel de temperatuur in op 55 graden Celsius en druk op update. Wacht ten minste een uur voordat u verder gaat, zodat het ITC-instrument voldoende tijd heeft om op te warmen of af te koelen als dat nodig is.Zorg er voor het laden van het enzym voor dat de referentiecel wordt geladen met 350 microliter gedestilleerd water. Om de monstercel schoon te maken, vult u de laadspuit met 500 microliter van 2 procent reinigingsoplossing. Steek de naald voorzichtig in de monstercel, vul de cel en verwijder de vloeistof langzaam met dezelfde spuit.Gooi de vloeistof in een beker. Herhaal deze stap twee keer met 2 procent reinigingsoplossing, drie keer met 70 procent ethanol, en was dan tien keer met gedestilleerd water. Vul na het reinigen van de monstercel de laadspuit met 450 microliter enzymoplossing.Steek de naald voorzichtig helemaal naar de bodem van de monstercel en druk de zuiger langzaam naar de 100 microliterlijn om vorming van luchtbellen te voorkomen. Was vervolgens de 50 microliter titratiespuit drie keer met gedestilleerd water door de naaldpunt in het water te plaatsen om het water langzaam in de spuit op te nemen en vervolgens het water in een afvalcontainer te doen. Spoel met de substraatoplossing drie keer af om restwater te verwijderen.Vul daarna de titratiespuit met substraatoplossing door de oplossing op te tekenen tot de spuit vol is zonder luchtbellen. Met de spuit nog in het substraat oplossing, verwijder de zuiger, en laat ongeveer 2 microliter lucht naar de top van de spuit in te voeren, en de zuiger opnieuw in te voeren. Verwijder de burettehandgreep van de ITC, plaats de spuit in de burettehandgreep en schroef tot ze strak zitten.Veeg de punt van de titratiespuit af met een pluisvrij weefsel en plaats de burettegreep voorzichtig in het ITC-instrument en sluit deze op zijn plaats. Selecteer incrementele titratie voor de instelling van het experiment. Klik op invoegen om de injecties in te stellen.Pas het injectieinterval aan op 5, 400 seconden, injectievolume op 4 microliter en aantal injecties op vier. Druk op OK om de instellingen te bevestigen. Selecteer in het equilibratievak automatische equilibrate en grote verwachte heats.Stel de initiële basislijn in op 300 seconden. Als u de run wilt starten, klikt u op het startsymbool naast de roersnelheid en klikt u vervolgens op Start, dat zich naast het moersleutelsymbool bevindt. Sla het bestand op en laat het instrument uitvoeren.Als u gegevens wilt analyseren, opent u het bestand in Nano Analyze. Klik op gegevens en selecteer gegevenskolommen. Selecteer alle gegevens, kopieer en plak de gegevens in Microsoft Excel.Pas 0 basislijn aan door de waarde toe te voegen die nodig is op 300 seconden om er 0 te maken. Pas deze correctie toe op de gehele kolom met warmtewaarden. Zet vervolgens grafieken van de minimum- of maximumwaarden in kaart van het tijdstip waarop de waarde zich tijdens de titratie heeft voorgedaan.In dit protocol worden ITC-gegevenssporen van lactaseactiviteit weergegeven met vier opeenvolgende injecties lactose in een lactaseoplossing in pH 4,6-buffer bij 55 graden Celsius, 45 graden Celsius, 35 graden Celsius en 25 graden Celsius. Een geen enzym controle werd uitgevoerd op 55 graden Celsius voor de hitte van het mengen. Voor elke injectie van enzym, is er een eerste exotherm warmte van het mengen, en vervolgens, de lactase gekatalyseerde endotherm hydrolyse van lactose optreedt totdat de reactie is voltooid, en de warmtesnelheid keert terug naar de uitgangswaarde.Het endotherm piekminimum na elke injectie is iets minder dan de vorige injectie vanwege de afname van enzymatische activiteit. Zoals verwacht neemt de enzymstabiliteit voor elke injectie af bij een stijgende temperatuur. Het controle-experiment toont lactase activiteit bij 25 graden Celsius had een 8 procent daling van de enzymactiviteit, als gevolg van verdunning na vier injecties.Gezien de vierde injectie toont een 73 procent daling van de test, het werkelijke verlies van enzymactiviteit was daarom 65 procent. Zo was de verdunning van de lactase het gevolg van elke injectie, had een relatief klein effect van 11 procent op enzymactiviteit. Het is belangrijk dat de buffer die wordt gebruikt om het enzym en substraat oplossingen te maken zo nauw mogelijk worden afgestemd.Mismatch van pH of concentratie kan resulteren in een grotere warmte van het mengen die de reactie warmte kan maskeren. U dit protocol toepassen om enzymen te bestuderen en hun stabiliteit te bepalen door de snelheid van warmte die vrijkomt of geabsorbeerd wordt tijdens een reactie te meten.

measuring-enzymatic-stability-by-isothermal-titration-calorimetry

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

ITC is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de binding van een ligand aan zijn gastheer. In complexe systemen kan echter verschillende modellen passen bij de gegevens even goed. De hier beschreven methode is een middel om de passende bindende model voor complexe systemen te helderen en pak de bijbehorende thermodynamische parameters.

Het verzamelen van variabele concentratie Isothermische Titration Calorimetrie Datasets om Binding mechanismen bepalen

Een algemeen protocol voor het gebruik van isotherme titratie calorimetrie de bindende thermodynamica voor biologische systemen te volgen met matige bindingsaffiniteiten wordt gepresenteerd.

Isotherme Titratie Calorimetrie voor het meten van macromolecuul-ligand Affiniteit

Take serial dilutions of a bacterial culture and add aliquots into calorimetric vials containing growth medium.Load the sealed vials into the multi-well plate of an isothermal microcalorimeter to measure metabolic heat production.The device is held at a constant temperature to ensure the detected heat originates solely from bacterial metabolism.As bacteria metabolize nutrients and proliferate, they release heat that sensors detect in real time.In parallel, incubate identical vials in an...

Isothermal Microcalorimetry to Monitor Metabolic Activity in Bacteria

Tijd cursussen voor de glycosylase activiteit van 8-oxoguanine DNA glycosylase zijn bifasisch vertonen een uitbarsting van de productie, en een lineaire steady-state fase. Met behulp quench-waardeberekening, de burst en steady-state prijs kan worden gemeten, die overeenkomen met excisie van 8-oxoguanine en afgifte van de glycosylase uit het product DNA, respectievelijk.

Steady-state, Pre-steady-state, en Single-omzet Kinetic Meting voor DNA Glycosylase Activiteit

Isothermische titratiecalorimetrie maatregelen warmtestroom vrijgelaten of geabsorbeerd in chemische reacties. Deze methode kan worden gebruikt voor enzym-katalyse kwantificeren. In deze paper, het protocol voor instrumentale setup, experiment loopt, en data-analyse wordt in het algemeen beschreven en toegepast op de karakterisering van enzymatische hydrolyse van ureum door jack bean urease.

Hot Biologische Katalyse: Isothermisch titratiecalorimetrie om enzymatische reacties karakteriseren

We beschrijven een basisprotocol voor het kwantificeren van in vitro ATPase-activiteit. Dit protocol kan worden geoptimaliseerd op basis van het activiteitsniveau en de vereisten voor een bepaalde gezuiverde ATPase.

Meten<em&gt; In Vitro</em&gt; ATPase activiteit voor enzymatische Karakterisatie

Differentiële scanning calorimetrie meet de thermische overgangstemperatuur (s) en de totale warmte-energie nodig is om een ​​eiwit te denatureren. De resultaten worden gebruikt om de thermische stabiliteit van eiwitantigenen beoordelen vaccinformuleringen.

Differentiecalorimetrie - Een methode voor het beoordelen van de thermische stabiliteit en conformatie van eiwitantigeen

Een protocol is bedoeld om te snel testen van de thermische stabiliteit van eiwitten in een verscheidenheid van voorwaarden door middel van thermische shift testen en nano differentiële scanning van fluorimetrie. Buffer systemen, zouten en additieven, samen zijn bestaande uit drie unieke stabiliteit schermen, vehiculumcontrolegroep met eiwitten om te identificeren van geschikte buffers voor functionele en structurele studies.

Hoe te stabiliseren van eiwit: stabiliteit schermen voor thermische verschuiven Assays en Nano Differential Scanning fluorimetrie in het Virus-X-Project

Het huidige protocol beschrijft het gebruik van isotherme titratiecalorimetrie (ITC) om de associatie en dissociatiekinetiek van de binding tussen een DNA-aptamer en tetracycline te analyseren, inclusief monstervoorbereiding, lopende normen en monsters, en het interpreteren van de resulterende gegevens.

Het bepalen van de thermodynamische en kinetische associatie van een DNA-aptamer en tetracycline met behulp van isothermische titratiecalorimetrie

In planta meting van nutriënten en toxische stroom is essentieel voor de studie van plantenvoeding en toxiciteit. Hier bespreken we protocollen met radiotracers voor de bepaling van influx en efflux in intacte plantenwortels, met behulp van kalium (K+) en ammoniak/ammonium (NH3/NH4+) stromen als voorbeelden. De voordelen en beperkingen van dergelijke technieken worden besproken.

Het meten van stromen van minerale nutriënten en toxische stoffen in planten met radioactieve tracers

Leer enzymatische stabiliteit meten door isothermische titratiecalorimetrie. Deze methode biedt directe inzichten in thermische stabiliteit van enzymactiviteit en vereist minder manuren dan traditionele assays.

Meten van enzymatische stabiliteit door isothermische titratie calorimetrie

Meer video's verkennen