Het bestuderen van normale weefsel straling effecten met behulp van extracellulaire matrix hydrogels

Dit protocol toont aan dat straling extracellulaire matrix eigenschappen van vetweefsel in het murine borstvetpad beïnvloedt. De toevoeging van straling in een decellularisatiemodel is nog niet eerder gedaan. Deze techniek maakt gebruik van verschillende wasstappen die elk een uniek chemisch doel dienen in het decellularisatieproces.

Specificiteit van deze techniek zorgt voor zachtere chemische wasbeurten, om de weefseleigenschappen beter te behouden. Borstkanker terugval treedt op na de therapie, vooral in driedubbele negatieve gevallen. Evalueren hoe de bestraalde extracellulaire matrix het gedrag van tumorcellen verandert, zal leiden tot belangrijke ontdekkingen over recidiefmechanismen.

Na het bestralen van monsters, met behulp van een cesiumbron, breng je de bestraalde MFP's en complete RPMI-media over in een bioveiligheidskast. Vul 6 centimeter of 10 centimeter schotels met genoeg media om de MFP's onder te dompelen. Incubeer bij 37 graden Celsius, met 5%kooldioxide, gedurende twee dagen.

Plaats eerst de MFP's in schotels van zes centimeter met vijf milliliter Trypsin-EDTA oplossing. Spray en veeg de gerechten met 70% ethanol en incubeer op 37 graden Celsius gedurende een uur. Gebruik 0,7 milliliter strainers om de MFP's te wassen met gedeïsized water, door het gieten van water over het weefsel drie keer.

Gebruik tangen om het weefsel tussen de wasbeurten handmatig te masseren. Vervolgens, kort droog het weefsel op een delicate taak veeg en weeg het. Leg de gedroogde weefsels in een voorautoclaved bekerglas, met een geschikte formaat roerstaaf en bedek de weefsels met 60 milliliter van 3%t-octylfenoxypolyethoxyethanol per gram weefsel.

Roer een uur op kamertemperatuur. Dump dan de inhoud van de beker in een zeef. Spoel het bekerglas met gedeïoniseerd water en giet dit op de weefsels.

Herhaal dit spoelproces nog twee keer, zorg ervoor dat tangen gebruiken om het weefsel handmatig te masseren tussen de spoelingen door. Daarna, kort droog het weefsel op een delicate taak af te vegen en te wegen. Plaats de weefsels en de roerrepen terug in dezelfde bekers en bedek ze met 60 milliliter van 4% deoxycholic zuur per gram weefsel.

Roer een uur op kamertemperatuur. Dump vervolgens de inhoud van de beker in een mesh-zeef, spoel het bekerglas met gedeïoniseerd water en giet dit op de weefsels. Herhaal dit spoelproces nog twee keer, zorg ervoor dat tangen gebruiken om het weefsel handmatig te masseren tussen de spoelingen door.

Droog het gespoelde weefsel kort op een delicate taak af te vegen en te wegen. Plaats de gedroogde weefsels in hetzelfde bekerglas, samen met vers gedeïioneerd water, aangevuld met 1%penicilline-streptomycine. Bedek de beker strak met paraffine film en laat op 4 graden Celsius 's nachts.

De volgende dag giet de bekerinhoud in een zeef, droog het weefsel kort op een delicate taak af te vegen en te wegen. Plaats vervolgens de MFP's in hetzelfde bekerglas met een passende formaat roerbalk. Bedek het weefsel met 60 milliliter van een oplossing die 4%ethanol en 0,1% perazijnzuur per gram weefsel bevat.

Roer twee uur op kamertemperatuur. Dump de inhoud van de beker in een 0,7 millimeter zeef. Gebruik tangen om het weefsel handmatig te masseren en de inhoud terug in het bekerglas te plaatsen.

Was het weefsel door het te bedekken met 60 milliliter 1X PBS per gram weefsel. Roer 15 minuten op kamertemperatuur. Herhaal dit hele wasproces nog een keer.

Dump vervolgens de inhoud van de beker in een 0,7 millimeter zeef. Met behulp van tangen, handmatig masseren het weefsel en plaats de inhoud terug in het bekerglas. Was het weefsel door het te bedekken met 60 milliliter gedeïsized water per gram weefsel.

Roer 15 minuten op kamertemperatuur. Herhaal dit hele wasproces nog een keer. Droog het gewassen weefsel kort op een delicate taak af te vegen en te wegen.

Dump het weefsel en de inhoud in een zeef en gebruik tangen om het weefsel handmatig te masseren. Plaats de inhoud terug in het bekerglas en bedek de weefsels met 60 milliliter van 100%n-propanol per gram weefsel. Roer een uur op kamertemperatuur.

Droog vervolgens kort het weefsel op een delicate taak af te vegen en te wegen. Dump het weefsel en de inhoud in een 0,7 millimeter zeef en gebruik tangen om het weefsel handmatig te masseren. Plaats de inhoud terug in het bekerglas en was het weefsel door het te bedekken met 60 milliliter gedeïïstiseerd water per gram weefsel.

Roer 15 minuten op kamertemperatuur. Herhaal dit wasproces drie keer. Daarna, kort droog het weefsel op een delicate taak veeg en weeg het.

Breng het weefsel naar een gelabelde 15 milliliter buis en bevriezen bij negatieve 80 graden Celsius 's nachts. Vul eerst een ondiepe container met vloeibare stikstof. Haal de monsters uit de vriezer en weeg elke gelyofiele MFP.

Plaats een monster in de mortel, gebruik een cryogene handschoen om de mortel in de vloeibare stikstof te houden. Gebruik vervolgens een stamper, bevestigd aan een handoefening, om het monster te frezen. Maal in een minuut intervallen om de voortgang te controleren en verwijder de gehandschoende hand uit de vloeibare stikstof.

Herhaal dit freesproces voor alle monsters, zorg ervoor dat de mortel en stamper met ethanol tussen elk monster spuiten en afvegen. Bewaar de monsters in poedervorm in 15 milliliter buizen op negatieve 80 graden Celsius tot klaar voor gebruik. Verwijder om te beginnen de monsters uit de vriezer en ontdooi bij kamertemperatuur.

Terwijl de monsters ontdooien, meng pepsine in zoutzuur om een Pepsine-HCL oplossing te vormen. Voeg vervolgens monsterpoeder en de Pepsin-HCL-oplossing toe aan een buis van 15 milliliter, voeg een kleine roerstaaf toe en roer gedurende 48 uur. Daarna, plaats de buizen op ijs voor vijf minuten.

Voeg 10X PBS toe aan elk monster, zodat de uiteindelijke oplossing een concentratie van 1X PBS heeft. Voeg vervolgens 10% volume/volume, 0,1 molaire natriumhydroxide toe aan elke oplossing, om pH 7.4 te bereiken, met pH-papier om elke oplossing afzonderlijk te testen. Met behulp van een pH 7.4 gel oplossing, resuspend de pelleted GFP en luciferase gelabeld 4T1 cellen tot een concentratie van 500, 000 of 1, 000, 000 cellen per milliliter gel oplossing.

Voeg 16 microliter gelceloplossing toe aan elke put van een 16-put kamerplaat en broed gedurende 30 minuten uit bij 37 graden Celsius. Voeg hierna 100 microliters van complete RPMI-media toe aan elke put. Blijf 48 uur lang uitbroeden bij 37 graden Celsius.

Gebruik vervolgens een fluorescentiemicroscoop om de cellen te observeren op een excitatiegolflengte van 519 nanometer en een emissiegolflengte van 618 nanometer. In deze studie worden normale weefselstralingseffecten bestudeerd, met behulp van extracellulaire matrixhydrogels. Hematoxyline en eosine kleuring wordt gebruikt om decellularisatie te bevestigen, door het verlies van kernen en andere sporen van DNA.

Terwijl Oil Red O kleuring wordt gebruikt om lipide inhoud te evalueren en het behoud van een dipasite morfologie te bevestigen. De rheologische eigenschappen van de ECM hydrogels worden beoordeeld op 37 graden Celsius. De opslagmodulus is hoger dan het verlies modulus voor alle omstandigheden, het aantonen van stabiele hydrogel vorming.

GFP en luciferase gelabeld 4T1 borstcarcinoom cellen worden vervolgens ingekapseld in de hydrogels. Celproliferatie wordt onderzocht door fluorescentiemicroscopie, door analfaescentiemetingen en levensvatbaarheidsvlekken, 48 uur na inkapseling. Bestraalde hydrogels vertonen een stijgende trend in de verspreiding van tumorcellen.

Phalloidin conjugaat wordt gebruikt om F-Actin te visualiseren in de ingekapselde cellen. Vergeet niet om de mortel te koelen voordat u het weefsel in de molen plaatst, een warme mortel kan leiden tot onvolledig frezen. Wees voorzichtig bij het hanteren van n-propanal en pepsine, alleen open n-propanal en andere decellularisatiemiddelen onder een chemische kap.

Weeg indien mogelijk de pepsine onder een chemische kap, omdat er gevaar is voor inademing. Veranderingen in de ecm-samenstelling na bestraling en decellularisatie kunnen worden geëvalueerd met behulp van massaspectrometrie en Raman-spectroscopie. Bovendien kan de vezelstructuur van de ECM hydrogels worden geanalyseerd door elektronenmicroscopie te scannen.

Deze methode heeft het potentieel om te worden uitgebreid om de effecten van straling op te onderzoeken, niet alleen tumorcellen, maar ook immuuncellen, evenals weefsels die stralingsschade ervaren, als gevolg van therapie. Deze decellularisatie techniek zal onderzoekers in staat stellen om de extracellulaire matrix eigenschappen van het weefsel na straling te evalueren, dat is een belangrijke behandeling optie in de meeste vormen van kanker.