Name: Materiaal vorming van recombinant spin Silks door waterige oplosmiddel met behulp van warmte en druk (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Leer een waterige methode voor het oplossen van recombinant spinnenzijde zonder agressieve organische oplosmiddelen. Dit eenvoudige proces behoudt de unieke eigenschappen van het eiwit en opent nieuwe toepassingen in biotechnologie en materiaalwetenschap.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen dankbaar te erkennen financiering van de Utah Science and Technology Research (USTAR) initiatief.

1. recombinant spin zijde mengsel voorbereiding van gelyofiliseerde eiwit voorraden
<ol><li>Bepaal de noodzakelijke formulering en het volume dat nodig is voor de beoogde materiële formaties. De typische formuleringen variëren van 3% (w/v) tot 15% (w/v). Met deze selectie berekent u de juiste rSSp, concentraties en ratio's.<ol>
<li>Gebruik de volgende respectieve formuleringen om elk materiaal voor te bereiden dat in dit protocol wordt beschreven: hydrogels/sponzen/lyogels% (w/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; films/coatings, 5% (w/v) 80:20 MaSp1: MaSp2; kleefstoffen, 12% (w/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; vezels, 12,5% (w/v) 80:20 MaSp1: MaSp2. Opmerking: Hoewel de meeste formuleringen zijn beter uitgerust voor specifieke vormen en materialen, is er een breed scala van formuleringen die vaak kunnen overlappen. Daarnaast kunnen de definitieve rSSp materialen ook worden afgestemd tijdens de vorming en verwerking om de gewenste eigenschappen te produceren. Over het algemeen, zal elk eiwit onderzoek naar aangewezen of nuttige parameters vereisen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selecteer een schone en nieuwe 8 mL autoclaveerbaar borosilicaatglas glas cultuur flacon met een rubberen bekleed schroefstop.</li>
	<li>Verwijder de dop en plaats de lege flacon op een analytische balans. Tarra de massa van de lege flacon, zodat het saldo nul massa leest.</li>
	<li>Voeg het gewenste gelyofiliseerde rSSp poeder toe aan de lege flacon voor elk specifiek materiaal.<ol>
<li>Gebruik deze specifieke massa's van elk eiwit type voor elk materiaal, bij de voorbereiding van een 2 mL oplossing: hydrogels/sponzen/lyogels, 60 mg MaSp1 en 60 mg MaSp2; films/coatings, 80 mg MaSp1 en 20 mg MaSp2; kleefstoffen, 120 mg MaSp1 en 120 mg MaSp2; vezels, 200 mg MaSp1 en 50 mg MaSp2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voeg de gewenste hoeveelheid ultrapuur water, ten minste 2 mL, toe aan de flacon die al de gewogen rSSp poeders bevat. Opmerking: voor alle oplos procedures wordt een minimaal volume van 2 mL aanbevolen.</li>
	<li>Seal de flacon dop en levendig Vortex de inhoud van een verspreide, en homogene, rSSp mengsel dat nu klaar is voor de solvation procedure te creëren. Extra homogenisering benaderingen zoals sonication of waaier mengen kan worden gebruikt met, of in aanvulling, de Vortex mengen.</li>
</ol>2. recombinant spin zijde solvation
Let op: tijdens de oplos procedure worden hoge warmte en druk opgewekt. Goede persoonlijke beschermingsmiddelen, met name Goggles, lange mouwen, en hittebestendig handschoenen zijn vereist voor dit proces.
<ol><li>Voer een laatste controle van de flacon, of het schip, dop om ervoor te zorgen dat het stevig en stevig aangespannen. Breng vervolgens het gesuspendeerde rSSp mengsel over naar een conventionele microgolfoven. Nota: de microgolf eenheden binnen de machts waaier van 700 tot 1.500 Watts, die kleinere interne kamer capaciteiten bezitten, en roterende platforms worden geadviseerd om betere solving voorwaarden te verstrekken.</li>
	<li>Start de werking van de magnetron met 5 s uitbarstingen op volle kracht. Na elke burst kort open de deur en zorgvuldig mix/Swirl de flacon om de afwikkeling te voorkomen en onderhouden van de opgeschorte mengsel.</li>
	<li>Herhaal dit microgolf proces tot het mengsel en/of de oplossing een temperatuur van minstens 130 °C heeft verkregen, wanneer gemeten met een infrarode thermometer direct tegen de oplossing die gedeelten van de flacon bevat. Herhaal dit proces totdat alle vaste deeltjes volledig zijn opgelost en niet meer zichtbaar zijn. Opmerking: er wordt voorgesteld om de flacon en de oplossing af en toe af te koelen, vooral als de formulering heeft een hoge concentratie van rSSp aanwezig. Temperaturen van meer dan 200 °C verhogen het risico op flacon Seal failure. Speciale aandacht moet ook worden gegeven om te voorkomen dat de oververhitte mengsel/oplossing van het aanraken van het zegel, die ook zal resulteren in flacon insluiting falen.</li>
	<li>Na het succesvol solvating van de rSSp mengsel in een oplossing mogelijk de temperatuur van de oplossing en de flacon dop te koelen onder 100 ° c (kookpunt) voor het openen.</li>
</ol>3. hydrogels
<ol><li>Bereid een hydrogel van de oplossing na het verwijderen van het uit de magnetron en waardoor het af te koelen en in te stellen. Giet de hydrogel in specifieke geometrieën alvorens deze volledig af te koelen. Nota: de verschillende rSSps zullen gevarieerde hoeveelheden tijden aan overgang aan een hydrogel vereisen. Bijvoorbeeld, MaSp2-achtige sequenties de neiging om hydrogels sneller vorm in vergelijking met MaSp1-achtige sequenties. Eiwit concentraties, zoutgehalte, en pH ook rechtstreeks van invloed op de snelheid van de overgang naar een hydrogel.</li>
</ol>4. sponzen
<ol><li>Bereid een rSSp sponzen door eerst waardoor de primaire solvated oplossing om een hydrogel te vormen.</li>
	<li>Plaats de hydrogel in een waterbad, plaats dit bad in de vriezer bij-20 °C, en wacht tot het bad volledig wordt bevroren.</li>
	<li>Voltooi de spons vorming door het verwijderen van de bevroren hydrogel en het waterbad van de vriezer en ontdooien bij 25 ° c. De resulterende spons kan nu uit het ontdooide water worden verwijderd.</li>
</ol>5. Lyogel
<ol><li>Bereid een rSSp lyogel door een gevormde hydrogel direct te bevriezen, met of zonder waterbad, en de overbrenging van het bevroren hydrogel monster naar een lyophilizer (vriesdroger).</li>
	<li>Verwijder de laatste gelyofiliseerde gel materiaal van het schip dat de vocht sublimatie opgetreden in.</li>
</ol>6. films en coatings
<ol><li>Gebruik een van de drie volgende methoden: oplossing gieten, oplossing spuiten, of dip coating om films of coatings van rSSp te produceren.<ol>
<li>Giet de solubilized zijde oplossing in/op PDMS vormen van de gewenste vorm.</li>
		<li>Giet en spreid 200 µ L van de film oplossing uit en laat dit drogen alvorens hen van het PDMS substraat voor het testen of behandeling af te pellen.</li>
		<li>Na het toestaan van deze te drogen, verwijder de gevormde films voor mechanische testen of post-Treat de films om de mechanische eigenschappen te verbeteren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ter voorbereiding van een coating, of een film die niet kan worden verwijderd uit het substraat, gebruik ofwel spray of dip coating om een dunne laag film te produceren. Opmerking: om te spuiten jas, dit protocol heeft gevonden succes met een Master airbrush model Paint sprayer.<ol>
<li>Vorm een dip-coating door simpelweg onderdompelen het substraat van de keuze in de solubilized rSSp en herhaal na het drogen om de gewenste dikte te bereiken.</li>
		<li>Voer een eerste spray jas voor het aanbrengen van een dip jas om de consistentie en effectiviteit van de uiteindelijke coating te verhogen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. lijmen
Nota: de vorming van kleefstoffen wordt bereikt door één van de volgende methodes.
<ol><li>Voeg direct de solubilized rSSp op een substraat toe en breng vervolgens een tweede substraat over de bovenkant van de oplossing. Klem de stukken stevig vast en droog vervolgens de monsters in een oven met een minimale temperatuur van 25 °C gedurende ten minste 16 uur.</li>
	<li>Als alternatief, spray de twee substraat oppervlakken met een spray coating en vervolgens klem de substraten samen.</li>
	<li>De toepassing van de rSSp door de DIP methode van coating de substraten en plakken van de substraten kan ook worden gebruikt voor te bereiden en lijm.</li>
</ol>8. nat-gesponnen vezels
<ol><li>Laad de solubilized dope oplossing in een concentrische spuit met Luer-Lok Tip door een 19 G Glide naald. Uitwerpen luchtbellen en laat de dope zitten op de Luer-Lok einde van de spuit.</li>
	<li>Plaats ten minste 25 mm van PEEK tubing, interne diameter 0,01 inch, in het een stuk vinger van de PEEK tubing fittingen voor 1/16 inch OD en 10/32 kegel. Bevestig deze fitting aan een PEEK tubing op Luer-Lok Female adapter.<ol>
<li>Vervang de 19 gauge naald met deze set-up op de geladen spuit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vul een lang, helder glas bad met 99% zuiver isopropanol te gebruiken voor coagulatie bad.<ol>
<li>Vul de stretch Baden, gelegen onder de stretch GODETS. Deze zullen 80:20 isopropanol: gedistilleerd water in de eerste stretch bad, en 20:80 isopropanol: gedistilleerd water in de tweede stretch bad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stel de godin stretch systeem zodanig dat de eerste godin na het coagulatie bad en de eerste godin in de eerste stretch Bad draaien met dezelfde snelheid.<ol>
<li>Begin het eerste stuk door de snelheden van de uiteindelijke godin in stretch Bath 1, de middelste boven godin, en de eerste godin in stretch Bath 2 tot dezelfde snelheid aan te passen. Deze snelheid zal 2x zo snel als de eerste vezel verwijdering snelheid.</li>
		<li>Initiëren van de tweede Stretch door het aanpassen van de snelheden van de uiteindelijke godin in stretch Bath 2, de laatste bovenste godint, en de Winder om dezelfde snelheid. Deze snelheid zal 2x zo snel als de snelheid die wordt gebruikt voor de eerste stretch of 4x de eerste vezels verwijderen snelheid.</li>
		<li>Plaats nitril handschoenen aan de buitenkant van de tussenliggende GODETS om de vezel te houden van uitglijden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Start om langzaam extruderen de oplossing in de coagulatie bad. In een geautomatiseerd systeem Stel de extrusie-tarief overeenkomen met een verwijderings snelheid van 10 mm/s.<ol>
<li>Laat Fiber extrusie uniform worden voor het trekken van de vezels uit het bad met behulp van een dun metalen haak of Tang. Controleer het verwijderen van de vezel uit het bad creëerde een lus tussen de PEEK tubing Tip en het pad van de vezel het verlaten van het bad het bad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Leidraad voor de teruggewonnen vezel door de reeks van GODETS zodanig dat de vezel wordt ondergedompeld in de stretch Baden, maar drogen in de lucht tussen de stretch Baden en voordat je op een spoel. Dit drogen wordt bereikt door de hoger geplaatste midden GODETS. Nota: het tarief van de vezel verwijdering en/of het uitdrijvings tarief zullen moeten worden aangepast gebaseerd op de eiwitconcentratie, additieven, en het eiwit type om ruime coagulatie tijd zonder het bundelen van vezels op de bodem van het coagulatie Bad toe te staan.</li>
	<li>Bevestig de volledig uitgerekte vezels aan de spoel op de Winder mechanisme met behulp van tape.</li>
</ol>

<ol><li>Huemmerich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Structure+Elements+of+Spider+Dragline+Silks+and+Their+Contribution+to+Protein+Solubility%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Primary Structure Elements of Spider Dragline Silks and Their Contribution to Protein Solubility.</a> Biochemistry. 43 (42), 13604-13612 (2004).</li>
<li>Schacht, K., Scheibel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+Hydrogel+Formation+of+a+Recombinant+Spider+Silk+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Controlled Hydrogel Formation of a Recombinant Spider Silk Protein.</a> Biomacromolecules. 12 (7), 2488-2495 (2011).</li>
<li>Jones, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+Than+Just+Fibers%3A+An+Aqueous+Method+for+the+Production+of+Innovative+Recombinant+Spider+Silk+Protein+Materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">More Than Just Fibers: An Aqueous Method for the Production of Innovative Recombinant Spider Silk Protein Materials.</a> Biomacromolecules. 16 (4), 1418-1425 (2015).</li>
<li>Tucker, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+and+Physical+Properties+of+Recombinant+Spider+Silk+Films+Using+Organic+and+Aqueous+Solvents%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Mechanical and Physical Properties of Recombinant Spider Silk Films Using Organic and Aqueous Solvents.</a> Biomacromolecules. 15 (8), 3158-3170 (2014).</li>
<li>Harris, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sticky+Situation%3A+An+Investigation+of+Robust+Aqueous-Based+Recombinant+Spider+Silk+Protein+Coatings+and+Adhesives%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">A Sticky Situation: An Investigation of Robust Aqueous-Based Recombinant Spider Silk Protein Coatings and Adhesives.</a> Biomacromolecules. 17 (11), 3761-3772 (2016).</li>
<li>Jones, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+Heat+and+Pressure+for+Solubilization+of+Recombinant+Spider+Silk+Proteins+in+Aqueous+Solution%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Importance of Heat and Pressure for Solubilization of Recombinant Spider Silk Proteins in Aqueous Solution.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (11), 1955(2016).</li>
<li>Copeland, C. G., Bell, B. E., Christensen, C. D., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Process+for+the+Spinning+of+Synthetic+Spider+Silk%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Development of a Process for the Spinning of Synthetic Spider Silk.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 1 (7), 557-584 (2015).</li>
<li>Arcidiacono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+Processing+and+Fiber+Spinning+of+Recombinant+Spider+Silks%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Aqueous Processing and Fiber Spinning of Recombinant Spider Silks.</a> Macromolecules. 35 (4), 1262-1266 (2002).</li>
<li>Work, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Major+Ampullate+Silk+Fiber+Formation+by+Orb-Web-Spinning+Spiders%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+American+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Major Ampullate Silk Fiber Formation by Orb-Web-Spinning Spiders.</a> Transactions of the American Microscopical Society. 96 (2), 170-189 (1977).</li>
<li>Decker, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+Destruction+of+Endotoxin+in+Synthetic+Spider+Silk+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Method for the Destruction of Endotoxin in Synthetic Spider Silk Proteins.</a> Scientific Reports. 8 (12166), 1-6 (2018).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.

Na recombinant spin zijde eiwitten worden gezuiverd moeten ze dan worden voorbereid in een oplossing die kan worden gebruikt voor de materiële vorming. Door het mengen van gelyofiliseerde Spider Silk Protein met water en het blootstellen van dit mengsel aan magnetron bestraling, om warmte en druk te genereren, het mogelijk om een rSSp oplossing te bereiden. Een grote verscheidenheid van materiële vormen kan worden geproduceerd uit deze eenvoudige en efficiënte methode van rSSp oplosbaar maken. Elk materiaal moet uniek wo...

Spider Silks hebben garnered het belang van materiële wetenschappers voor hun indrukwekkende combinatie van kracht, elasticiteit, en biocompatibiliteit. Recreëren van vezels is van oudsher de stuwkracht van het onderzoek. Deze inspanning werd belemmerd door de recombinante spin zijde proteïne (rSSp) onoplosbaarheid in water evenals het onvermogen van traditionele solvation technieken (chaotropic agenten en detergentia) om waterige oplosbaarheid te bereiken. Verder, technieken die zijn ontwikkeld voor solvating versies van rSSp werken niet op alle rSSp varianten en vereisen ook aanzienlijke manipulatie en tijd die vaak resulteert in eiwitverlies1,2. Dit heeft grotendeels geresulteerd in het gebied gebruik te maken van 1, 1, 1, 3, 3, 3-hexafluoroisopropanol (HFIP) als een oplosmiddel van waaruit vezels te vormen, en andere beperkte materiële vormen. Het voordeel is dat alle bekende rSSp oplosbaar zijn in HFIP, waardoor de gegevens uniformiteit tussen elke onderzoeksgroep wordt verschaft. Het nadeel is dat HFIP is een giftig oplosmiddel dat is duur en onpraktisch om de schaal als gevolg van gezondheidsproblemen en milieu-overwegingen.
Een nieuwe benadering van rSSp solvation werd ontwikkeld die de technologische kloof overbrugde tussen de harde organische oplosmiddel HFIP en andere technieken die selectief werkte voor rSSp solvation. De combinatie van specifieke warmte en druk werd toegepast op suspensies van rSSp en water. De resultaten waren dichtbij 100% solvation en terugwinning van rSSp, evenals hoge eiwit concentraties; een verscheidenheid van materialen vormen werden bepaald om van deze formuleringen mogelijk te zijn die niet allen haalbaar waren gebruikend HFIP of andere organische oplosmiddelen3,4,5,6. Het doel van deze aanpak is om efficiënt en gemakkelijk solubilize gezuiverde en gedroogde recombinante spin-eiwitten in een waterige oplossing die vervolgens kan worden gebruikt voor de productie van een verscheidenheid van materiële vormen.
Vezels, films, coatings, lijmen, hydrogels, lyogels, microsferen, en spons materialen zijn allemaal gemakkelijk te verwezenlijken uit dezelfde waterige rSSp oplossing met behulp van deze methode. De verdere evolutie van deze methode, niet alleen met extra rSSp maar met andere proteïnen, kon tot nieuwe materiële vormen en alternatieve EiwitReiniging en oplosbaar maken wegen leiden.

<table><tbody><tr><td>3 mL Syringe with Luer-Lok Tip</td><td>BD</td><td>309657</td><td>Andere maat spuiten kunnen worden gebruikt, maar om de tips vast te houden, wordt aangeraden om luer-lok tips te gebruiken</td></tr><tr><td>4 mL kweekflesje, helder met rubberen binnendop</td><td>Wheaton</td><td>225142</td><td>Minimale dope-volume is 1mL, maximaal is 2mL</td></tr><tr><td>8 mL kweekflesje, helder met rubberen binnendop</td><td>Wheaton</td><td>225144</td><td>Minimale dope-volume is 2mL, maximaal is 4mL</td></tr><tr><td>99% Isopropyl Alcohol, Reagent ACS/USP Grade</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>231000099</td><td></td></tr><tr><td>Freezone 4.5 Plus</td><td>Labconco</td><td>7386030</td><td>Vriesdroger</td></tr><tr><td>Luer Adapter Female Luer x 10-32 Female, Tefzel (ETFE)</td><td>IDEX</td><td>P-629</td><td></td></tr><tr><td>Microgolfoven</td><td>Magic Chef</td><td>HMD1110B</td><td>120V, 60Hz AC; 1000 watt; 1,1 kubieke voet capaciteit; met glazen draaitafel</td></tr><tr><td>One-Piece Fingertight 10-32 Coned, voor 1/16" OD</td><td>IDEX</td><td>F-120X</td><td></td></tr><tr><td>PEEK Buizen 1/16" OD x 0.010" ID</td><td>IDEX</td><td>1531B</td><td></td></tr><tr><td>Sprayer: Master Airbrush</td><td>Master Airbrush</td><td>TC-60</td><td></td></tr></tbody></table>

materiaal vorming van recombinant spin silks door waterige oplosmiddel met behulp van warmte en druk

Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure

Veel spinnen produceren zeven soorten Silks. Zes van de zijdes zijn vezel in vorm wanneer geproduceerd door de spinnen. Deze vezels zijn niet in water oplosbaar. Om de opmerkelijke mechanische eigenschappen van spin zijdes te reproduceren, moeten zij in heterologe gastheren worden geproduceerd aangezien de spinnen zowel territoriaal als kannibalistische zijn. De synthetische analogen van spin zijde ook de neiging om onoplosbaar zijn in waterige oplossingen. Zo, een groot percentage van het onderzoek in recombinant spin zijdes vertrouwen op organische oplosmiddelen die schadelijk zijn voor grootschalige productie van materialen. De methode van onze groep dwingt de Solvatie van deze recombinante spin zijdes in water. Opmerkelijk is, wanneer deze eiwitten zijn bereid met behulp van deze methode van warmte en druk, een breed scala van materiële vormen kunnen worden bereid uit dezelfde oplossing van recombinant Spider Silk eiwitten (rSSp), waaronder: films, vezels, spons, hydrogel, lyogel, en lijmen. Dit artikel toont de productie van solvated rSSp en materiële vormen op een manier die gemakkelijker dan van geschreven materialen en methodes alleen wordt begrepen.

Van de beschreven methode van oplosbaar maken van rSSp, kan een verscheidenheid van materiële vormen worden bereikt zoals gezien in Figuur 1. De methode van oplosbaar maken is het toepassen van warmte en druk, gegenereerd door een conventionele magnetron, tot een schorsing van rSSp en water. Wanneer kritieke temperaturen en druk worden bereikt, zal het eiwit solubilize. Van deze solubilized rSSp oplossing, worden de vereiste voorwaarden voorgesteld voor zeven...

Hier presenteren we een protocol voor de productie van water oplosbare recombinant Spider Silk Protein Solutions en de materiële vormen die kunnen worden gevormd uit deze oplossingen.

Materiaal vorming van recombinant spin Silks door waterige oplosmiddel met behulp van warmte en druk

Many spiders produce seven types of silks. Six of the silks are fiber in form when produced by the spiders. These fibers are not water soluble. In order ...

Deze methode van oplosbare recombinante spinrag produceert materiële vormen die niet mogelijk zijn met behulp van traditionele agressieve organische oplosmiddelen. Verder is het proces graan, wat resulteert in een eenvoudige eiwitoplossing in water. Door gebruik te maken van deze methode behouden de gevormde of geproduceerde materialen de gewenste kenmerken van spinrageiwitten.Deze oplostechniek voor recombinant spinrag zorgt voor de oplos van recombinante spinrag in een proces in één stap. Dit is wenselijk omdat deze notoir moeilijk te produceren eiwitten niet verloren gaan door uitgebreide verwerking. Verder, omdat de oplossingen zijn gewoon eiwit in water, andere biologisch actieve verbindingen kunnen worden toegevoegd als dat wenselijk is voor de toepassing.In het bijzonder, de eiwitstructuur functie relatie, dit systeem is memetisch hoe een spin maakt een vezel in dat het gebruik maakt van water en eiwitten in een hoge concentratie. Door gebruik te maken van deze oplosmethode en een daaropvolgende materiaalvorming, moet het mogelijk zijn om inzicht te krijgen in de materialen die worden gevormd, en de structuren die er verantwoordelijk voor zijn. Er wordt gedacht dat het kan zijn, we hebben deze techniek gebruikt voor het oplosen van synthetische peptiden die anders een alkalische of zure omgeving nodig zouden hebben om op te solvaten.Dat kan voordelig zijn in downstream toepassingen voor deze peptiden. Bovendien, een aantal bekende eiwitten wanneer synthetisch uitgedrukt hebben de neiging om te eindigen in de onoplosbare fractie. Resolubiliseren, en vervolgens het opnieuw vouwen van deze eiwitten is vaak een moeizaam proces dat resulteert in grote verliezen.Door gebruik te maken van deze techniek, zou het mogelijk zijn om de efficiëntie van herstelprocessen voor onoplosbare eiwitten te verhogen. Het plaatsen van een verzegelde flacon in een magnetron is een beetje ontmoedigend waardoor het risico van oververhitting en dus over het onder druk zetten van de flacon. Inzicht in de geënsceneerde aanpak van het toepassen van warmte en druk is van cruciaal belang.Ten tweede, voor de recombinant spin zijde in het bijzonder, met zout aanwezig zal niet toestaan dat de techniek te werken of te werken zo effectief, afhankelijk van hoeveel zout aanwezig is. Zoutverwijdering is de sleutel. Wees geduldig en voorzichtig, houd uw magnetrontijden en temperaturen in de flacon nauwlettend in de gaten.Het is van cruciaal belang omdat er een aantal bewegende delen in werking zijn die vaak moeilijk over te brengen zijn door middel van traditionele geschreven materialen en methodesecties. Gezien het feit dat er veel eiwitten zijn die oplosbaarheidsproblemen hebben die adequate studie voorkomen, kan deze methode worden toegepast in een verscheidenheid van eiwitruimten om analytische technieken en karakterisering te verbeteren of zelfs mogelijk te maken. Om te beginnen, selecteer een schone en nieuwe acht milliliter autoclaveable borosilicaat glas cultuur flacon met een rubberen gevoerde schroefdop, en plaats de lege flacon op een analytische balans.Scheur de massa van de lege flacon, zodat de balans leest nul massa. Voeg het gewenste lyophilized recombinant spider silk eiwitpoeder toe aan de lege flacon voor het specifieke materiaal. Voeg vervolgens de gewenste hoeveelheid ultra zuiver water, ten minste twee milliliter, toe aan de flacon.Sluit de flacon dop, en stevig vortex de inhoud om een verspreide en homogene recombinant spin zijde eiwit mengsel te creëren. Voer een laatste controle van de flacon dop uit om ervoor te zorgen dat deze stevig en stevig is aangedraaid. Breng vervolgens het zwevende recombinant spinrag-eiwitmengsel over naar een conventionele magnetron met een vermogensbereik van 700 tot 1500 watt.Begin de werking van de magnetron met vijf seconden uitbarstingen ingesteld volle kracht door handmatig in- en uitschakelen. Na elke uitbarsting, kort open de deur, en zorgvuldig meng de flacon om te voorkomen dat bezinking, en onderhouden van de hangende mengsel. Laat af en toe de flacon en oplossing afkoelen en voorkom dat de oververhitte oplossing de afdichting raakt.Gebruik een infraroodthermometer om de temperatuur van de oplossing met een deel van de flacon te meten. Herhaal het microgolfproces totdat de temperatuur ten minste 130 graden Celsius bereikt, en alle vaste deeltjes zijn volledig opgelost. Laat vervolgens de temperatuur van de oplossing en de flacon dop afkoelen tot onder de 100 graden Celsius.Voordat deze oplossing volledig wordt gekoeld, giet het van de flacon in specifieke geometrieën om een hydrogel te vormen. Nadat de hydrogel is gevormd, plaats het in een waterbad, en breng het naar de vriezer bij min 20 graden Celsius. Wacht tot het bad volledig bevroren is.Voltooi het sponsvormingsproces door de bevroren hydrogel en het waterbad uit de vriezer te halen en te ontdooien bij 25 graden Celsius. Verwijder vervolgens de resulterende spons uit het ontdooide water. Om een lyogel voor te bereiden, breng je een bevroren hydrogelmonster over aan een lyofielieer.Verwijder na 24 uur het laatste gelyofiele gelmateriaal uit het vat. Voor de productie van films van recombinant spin zijde eiwit, gegoten 200 microliters van de hete oplosbare recombinant spin zijde eiwit uit de flacon op een PDMS vorm van de gewenste vorm. Nadat het is gedroogd, pel het van het PDMS-substraat voor het testen of de behandeling.Om een coating te bereiden die niet uit het substraat kan worden verwijderd, gebruikt u een airbrushspuit om het opneembaar recombinant spinrageiwit aan te brengen om een eerste spuitcoating uit te voeren op het substraat naar keuze. Nadat het is gedroogd, dompel het gecoate substraat onder in het opneembaar recombinant spinrag-eiwit om een dipcoating te vormen. Herhaal de dipcoating om de gewenste dikte te bereiken.Om lijmen te vormen, gebruik een pipet om de oplosbare recombinant spin zijde eiwit toe te voegen aan een substraat, en breng vervolgens een tweede substraat over de bovenkant van de oplossing. Klem de stukken stevig aan elkaar en droog de monsters vervolgens in een oven met een minimale temperatuur van 25 graden Celsius gedurende ten minste 16 uur. Om natte gesponnen vezels te genereren, gebruik een 19-metersgeduwaal en laad de oplosbare dopeoplossing in een concentrische spuit met een Luer-sluistip.Uitwerp luchtbellen, en laat de dope zitten aan de Luer lock einde van de spuit. Steek ten minste 25 millimeter PEEK-buizen in de PEEK-buizen uit één stuk vingerdichting voor een van 16 inch buitendiameter, en 10 over 32 kammen. Vervang de 19-meter naald door deze setup op de Luer lock vrouwelijke adapter van de spuit.Plaats vervolgens nitrilhandschoenen aan de buitenkant van de tussenliggende godets, om de vezel te houden die moet worden gegenereerd door uitglijden en om beschadiging van de motoren te voorkomen. Krijg een hoog helder glazen bad met 99% pure isopropanol te gebruiken als stollingsbad. Vul het eerste stretchbad met een 80 tot 20 verhouding van isopropanol en gedestilleerd water.Vul in het tweede stretchbad een verhouding van 20 tot 80 isopropanol en gedestilleerd water. Zet het goet stretch systeem op de computer. Om de hoofdsnelheid van de vezelverwijdering aan te passen, past u de schuifbalk voor godet triplet A-snelheid aan op een waarde tussen 10 en 14 millimeter per seconde, afhankelijk van hoe goed en snel de vezel zich vormt.Start een eerste stuk door het verplaatsen van de schuifbalk van de godet triple B stretch ratio tot twee Voor de laatste godet in stretch bad een, De middelste bovenste godet, en de eerste godet in stretch bad twee. Start het tweede stuk door het verplaatsen van de schuifbalk van de godet triple C stretch ratio tot twee voor de laatste godet in stretch bad twee, de laatste bovenste godet, en de winder. Deze opstelling zorgt ervoor dat de eerste godet na de stolling bad, en de eerste godet in de eerste stretch bad draaien op dezelfde snelheid.Laad vervolgens de zijdeoplossing in de spuit van een aangepast spinlijninstrument. Stel in het geautomatiseerde systeem de extrusiesnelheid in op 10 millimeter per seconde om de zijdeoplossing in het met isopropanol gevulde glazen stollingsbad te extruderen. Laat de vezel extrusie uniform te worden, alvorens de vezels uit het bad met een dunne metalen haak.Controleer of het verwijderen van de vezel uit het bad een lus creëert tussen de PEEK-slangpunt en het pad van de vezel die het bad verlaat. Gids de opgehaalde vezel door de reeks van godets, zodanig dat de vezel wordt ondergedompeld in de stretch baden, maar drogen in de lucht tussen de stretch baden, en voordat je op een spoel. In dit protocol door middel van een oplos van recombinant spinrag eiwit, een verscheidenheid aan materiële vormen kan worden bereikt.Zeven materiële vormen worden hier gepresenteerd. Hydrogels, lyogels, spons, lijmen, coatings, films en vezels. Vezels vereisen de meest uitgebreide verwerking door extruderen in een stolling bad, en vervolgens serieel rekken van de ruwe vezel in post bin stretch baden.Gezien het feit dat de eiwit- en wateroplossingen worden verwarmd tot een relatief hoge temperatuur en druk, is onze ervaring dat de oplossingen steriel zijn op het punt dat het eiwit opgaat. Hierdoor kan een van de hier gepresenteerde materiële vormen worden meegenomen naar de celcultuur, zolang ze op de juiste manier worden behandeld, om de cellulaire reactie op de materialen te bestuderen. Zeker deze techniek heeft geleid tot de ontdekking van nieuwe materiaalvormen, waaronder lijmen en sponsmateriaal.Materiële vormen die niet noodzakelijkerwijs gericht zijn op vezelvorming, hoewel vezelvorming een van de gebieden is die ook verbetering heeft gezien door de ontwikkeling van deze techniek. Het genereren van warmte en druk in een afgesloten flacon heeft inherent gevaar. Draag altijd persoonlijke beschermingsmiddelen bij het uitvoeren van deze procedures.

material-formation-recombinant-spider-silks-through-aqueous-solvation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Hier beschrijven we een efficiënte strategie om de zijde-producerende klieren te verwijderen uit de buik van de vrouwelijke zwarte weduwe spinnen. Deze procedure maakt het mogelijk een snelle isolatie van de zeven verschillende zijde-producerende klieren in een sterk gezuiverd, mode, een belangrijk proces voor de onderzoekers bestuderen spinnenzijde productie en assemblage vezels.

Microdissectie van Black Widow Spider Silk-producerende klieren

Ondanks de uitstekende mechanische en biochemische eigenschappen van spin zijde, kan dit materiaal worden geoogst in grote hoeveelheden op conventionele wijze. Hier beschrijven we een efficiënte strategie om kunstmatige spinnenzijde vezels, die is een belangrijk proces voor de onderzoekers bestuderen van spinnenzijde productie en het gebruik ervan als next-generation biomaterialen te laten draaien.

Synthetische Spider Silk Production op laboratoriumschaal

Spinnenzijde vezels geven buitengewone mechanische eigenschappen.

Air Filter apparaten Inclusief geweven Netten van Electrospun Recombinant Spider Silk Eiwitten

Mengen is een efficiënte benadering van biomaterialen met een breed scala van eigenschappen en gecombineerde functies te genereren. Door het voorspellen van de moleculaire interacties tussen de verschillende natuurlijke zijde proteïnen, kunnen nieuwe zijde-zijde eiwit legering platforms met instelbare mechanische veerkracht, elektrische reactie, optische transparantie, chemische verwerkbaarheid, biologische afbreekbaarheid, of thermische stabiliteit worden ontworpen.

Het ontwerpen van Silk-zijde Protein Alloy materialen voor biomedische toepassingen

Een protocol voor de microfluidic spinnen en karakterisering van de microstructuur van geregenereerde zijde fibroin monofilament wordt gepresenteerd.

Microfluidic droog-spinnen en karakterisering van geregenereerde zijde Fibroin vezels

Dit protocol toont de mogelijkheid om reactieve inkjet printen te gebruiken om zelf beweeglijke biocompatibele en milieuvriendelijke micro-roer werkers af te drukken voor gebruik in biomedische en milieutoepassingen.

Reactieve Inkjet Printing en voortstuwings analyse van zijde-gebaseerde zelfrijdende micro-roeren

Een tapping mode atomic force microscoop (AFM) methode voor de visualisatie van plasmide DNA, cytoplasmatische eiwitten en DNA-eiwitcomplexen is beschreven. De methode bestaat uit alternatieve benaderingen voor het bereiden van monsters voor AFM beeldvorming volgende biochemische manipulatie. DNA met specifieke eiwit interactie regio's zijn waargenomen in de buurt-fysiologische buffer omstandigheden.

Visualisatie van Recombinant DNA en eiwit complexen met behulp van Atomic Force Microscopy

Waterige tweefasensysteem systemen werden gebruikt om gelijktijdig meerdere patroon populaties van cellen. Deze snelle en gemakkelijke methode voor patroonvorming cel maakt gebruik van de fasenscheiding van waterige oplossingen van dextran en polyethyleenglycol en de grensvlakspanning die tussen de twee polymeeroplossingen.

Cell Co-cultuur Patterning gebruiken waterige tweefasensysteem Systems

Wij rapporteren over technieken micropattern nanoporeuze gouden dunne films via stencilafdruk en fotolithografie, alsook werkwijzen cultuur brengen van cellen op microschaal vervaardigde patronen. Verder beschrijven we beeld analysemethoden morfologie van het materiaal en de gekweekte cellen met behulp van scanning elektronenmicroscopie en fluorescentie microscopie technieken karakteriseren.

Microfabricage van Nanoporeuze Gold Patronen voor Cell-materiaal Interaction Studies

Protocollen voor de studie van biofilmvorming in een microfluïdisch apparaat dat poreuze media nabootst, worden besproken. Het microfluïdische apparaat bestaat uit een array van micro-pillaren en de biofilmvorming door Pseudomonas fluorescens in dit apparaat wordt onderzocht.

Protocol voor Biofilm Streamer Vorming in een microfluïdische apparaat met micro-pijlers

Leer een waterige methode voor het oplossen van recombinant spinnenzijde zonder agressieve organische oplosmiddelen. Dit eenvoudige proces behoudt de unieke eigenschappen van het eiwit en opent nieuwe toepassingen in biotechnologie en materiaalwetenschap.

Materiaal vorming van recombinant spin Silks door waterige oplosmiddel met behulp van warmte en druk

Meer video's verkennen