Materiaal vorming van recombinant spin Silks door waterige oplosmiddel met behulp van warmte en druk

Deze methode van oplosbare recombinante spinrag produceert materiële vormen die niet mogelijk zijn met behulp van traditionele agressieve organische oplosmiddelen. Verder is het proces graan, wat resulteert in een eenvoudige eiwitoplossing in water. Door gebruik te maken van deze methode behouden de gevormde of geproduceerde materialen de gewenste kenmerken van spinrageiwitten.

Deze oplostechniek voor recombinant spinrag zorgt voor de oplos van recombinante spinrag in een proces in één stap. Dit is wenselijk omdat deze notoir moeilijk te produceren eiwitten niet verloren gaan door uitgebreide verwerking. Verder, omdat de oplossingen zijn gewoon eiwit in water, andere biologisch actieve verbindingen kunnen worden toegevoegd als dat wenselijk is voor de toepassing.

In het bijzonder, de eiwitstructuur functie relatie, dit systeem is memetisch hoe een spin maakt een vezel in dat het gebruik maakt van water en eiwitten in een hoge concentratie. Door gebruik te maken van deze oplosmethode en een daaropvolgende materiaalvorming, moet het mogelijk zijn om inzicht te krijgen in de materialen die worden gevormd, en de structuren die er verantwoordelijk voor zijn. Er wordt gedacht dat het kan zijn, we hebben deze techniek gebruikt voor het oplosen van synthetische peptiden die anders een alkalische of zure omgeving nodig zouden hebben om op te solvaten.

Dat kan voordelig zijn in downstream toepassingen voor deze peptiden. Bovendien, een aantal bekende eiwitten wanneer synthetisch uitgedrukt hebben de neiging om te eindigen in de onoplosbare fractie. Resolubiliseren, en vervolgens het opnieuw vouwen van deze eiwitten is vaak een moeizaam proces dat resulteert in grote verliezen.

Door gebruik te maken van deze techniek, zou het mogelijk zijn om de efficiëntie van herstelprocessen voor onoplosbare eiwitten te verhogen. Het plaatsen van een verzegelde flacon in een magnetron is een beetje ontmoedigend waardoor het risico van oververhitting en dus over het onder druk zetten van de flacon. Inzicht in de geënsceneerde aanpak van het toepassen van warmte en druk is van cruciaal belang.

Ten tweede, voor de recombinant spin zijde in het bijzonder, met zout aanwezig zal niet toestaan dat de techniek te werken of te werken zo effectief, afhankelijk van hoeveel zout aanwezig is. Zoutverwijdering is de sleutel. Wees geduldig en voorzichtig, houd uw magnetrontijden en temperaturen in de flacon nauwlettend in de gaten.

Het is van cruciaal belang omdat er een aantal bewegende delen in werking zijn die vaak moeilijk over te brengen zijn door middel van traditionele geschreven materialen en methodesecties. Gezien het feit dat er veel eiwitten zijn die oplosbaarheidsproblemen hebben die adequate studie voorkomen, kan deze methode worden toegepast in een verscheidenheid van eiwitruimten om analytische technieken en karakterisering te verbeteren of zelfs mogelijk te maken. Om te beginnen, selecteer een schone en nieuwe acht milliliter autoclaveable borosilicaat glas cultuur flacon met een rubberen gevoerde schroefdop, en plaats de lege flacon op een analytische balans.

Scheur de massa van de lege flacon, zodat de balans leest nul massa. Voeg het gewenste lyophilized recombinant spider silk eiwitpoeder toe aan de lege flacon voor het specifieke materiaal. Voeg vervolgens de gewenste hoeveelheid ultra zuiver water, ten minste twee milliliter, toe aan de flacon.

Sluit de flacon dop, en stevig vortex de inhoud om een verspreide en homogene recombinant spin zijde eiwit mengsel te creëren. Voer een laatste controle van de flacon dop uit om ervoor te zorgen dat deze stevig en stevig is aangedraaid. Breng vervolgens het zwevende recombinant spinrag-eiwitmengsel over naar een conventionele magnetron met een vermogensbereik van 700 tot 1500 watt.

Begin de werking van de magnetron met vijf seconden uitbarstingen ingesteld volle kracht door handmatig in- en uitschakelen. Na elke uitbarsting, kort open de deur, en zorgvuldig meng de flacon om te voorkomen dat bezinking, en onderhouden van de hangende mengsel. Laat af en toe de flacon en oplossing afkoelen en voorkom dat de oververhitte oplossing de afdichting raakt.

Gebruik een infraroodthermometer om de temperatuur van de oplossing met een deel van de flacon te meten. Herhaal het microgolfproces totdat de temperatuur ten minste 130 graden Celsius bereikt, en alle vaste deeltjes zijn volledig opgelost. Laat vervolgens de temperatuur van de oplossing en de flacon dop afkoelen tot onder de 100 graden Celsius.

Voordat deze oplossing volledig wordt gekoeld, giet het van de flacon in specifieke geometrieën om een hydrogel te vormen. Nadat de hydrogel is gevormd, plaats het in een waterbad, en breng het naar de vriezer bij min 20 graden Celsius. Wacht tot het bad volledig bevroren is.

Voltooi het sponsvormingsproces door de bevroren hydrogel en het waterbad uit de vriezer te halen en te ontdooien bij 25 graden Celsius. Verwijder vervolgens de resulterende spons uit het ontdooide water. Om een lyogel voor te bereiden, breng je een bevroren hydrogelmonster over aan een lyofielieer.

Verwijder na 24 uur het laatste gelyofiele gelmateriaal uit het vat. Voor de productie van films van recombinant spin zijde eiwit, gegoten 200 microliters van de hete oplosbare recombinant spin zijde eiwit uit de flacon op een PDMS vorm van de gewenste vorm. Nadat het is gedroogd, pel het van het PDMS-substraat voor het testen of de behandeling.

Om een coating te bereiden die niet uit het substraat kan worden verwijderd, gebruikt u een airbrushspuit om het opneembaar recombinant spinrageiwit aan te brengen om een eerste spuitcoating uit te voeren op het substraat naar keuze. Nadat het is gedroogd, dompel het gecoate substraat onder in het opneembaar recombinant spinrag-eiwit om een dipcoating te vormen. Herhaal de dipcoating om de gewenste dikte te bereiken.

Om lijmen te vormen, gebruik een pipet om de oplosbare recombinant spin zijde eiwit toe te voegen aan een substraat, en breng vervolgens een tweede substraat over de bovenkant van de oplossing. Klem de stukken stevig aan elkaar en droog de monsters vervolgens in een oven met een minimale temperatuur van 25 graden Celsius gedurende ten minste 16 uur. Om natte gesponnen vezels te genereren, gebruik een 19-metersgeduwaal en laad de oplosbare dopeoplossing in een concentrische spuit met een Luer-sluistip.

Uitwerp luchtbellen, en laat de dope zitten aan de Luer lock einde van de spuit. Steek ten minste 25 millimeter PEEK-buizen in de PEEK-buizen uit één stuk vingerdichting voor een van 16 inch buitendiameter, en 10 over 32 kammen. Vervang de 19-meter naald door deze setup op de Luer lock vrouwelijke adapter van de spuit.

Plaats vervolgens nitrilhandschoenen aan de buitenkant van de tussenliggende godets, om de vezel te houden die moet worden gegenereerd door uitglijden en om beschadiging van de motoren te voorkomen. Krijg een hoog helder glazen bad met 99% pure isopropanol te gebruiken als stollingsbad. Vul het eerste stretchbad met een 80 tot 20 verhouding van isopropanol en gedestilleerd water.

Vul in het tweede stretchbad een verhouding van 20 tot 80 isopropanol en gedestilleerd water. Zet het goet stretch systeem op de computer. Om de hoofdsnelheid van de vezelverwijdering aan te passen, past u de schuifbalk voor godet triplet A-snelheid aan op een waarde tussen 10 en 14 millimeter per seconde, afhankelijk van hoe goed en snel de vezel zich vormt.

Start een eerste stuk door het verplaatsen van de schuifbalk van de godet triple B stretch ratio tot twee Voor de laatste godet in stretch bad een, De middelste bovenste godet, en de eerste godet in stretch bad twee. Start het tweede stuk door het verplaatsen van de schuifbalk van de godet triple C stretch ratio tot twee voor de laatste godet in stretch bad twee, de laatste bovenste godet, en de winder. Deze opstelling zorgt ervoor dat de eerste godet na de stolling bad, en de eerste godet in de eerste stretch bad draaien op dezelfde snelheid.

Laad vervolgens de zijdeoplossing in de spuit van een aangepast spinlijninstrument. Stel in het geautomatiseerde systeem de extrusiesnelheid in op 10 millimeter per seconde om de zijdeoplossing in het met isopropanol gevulde glazen stollingsbad te extruderen. Laat de vezel extrusie uniform te worden, alvorens de vezels uit het bad met een dunne metalen haak.

Controleer of het verwijderen van de vezel uit het bad een lus creëert tussen de PEEK-slangpunt en het pad van de vezel die het bad verlaat. Gids de opgehaalde vezel door de reeks van godets, zodanig dat de vezel wordt ondergedompeld in de stretch baden, maar drogen in de lucht tussen de stretch baden, en voordat je op een spoel. In dit protocol door middel van een oplos van recombinant spinrag eiwit, een verscheidenheid aan materiële vormen kan worden bereikt.

Zeven materiële vormen worden hier gepresenteerd. Hydrogels, lyogels, spons, lijmen, coatings, films en vezels. Vezels vereisen de meest uitgebreide verwerking door extruderen in een stolling bad, en vervolgens serieel rekken van de ruwe vezel in post bin stretch baden.

Gezien het feit dat de eiwit- en wateroplossingen worden verwarmd tot een relatief hoge temperatuur en druk, is onze ervaring dat de oplossingen steriel zijn op het punt dat het eiwit opgaat. Hierdoor kan een van de hier gepresenteerde materiële vormen worden meegenomen naar de celcultuur, zolang ze op de juiste manier worden behandeld, om de cellulaire reactie op de materialen te bestuderen. Zeker deze techniek heeft geleid tot de ontdekking van nieuwe materiaalvormen, waaronder lijmen en sponsmateriaal.

Materiële vormen die niet noodzakelijkerwijs gericht zijn op vezelvorming, hoewel vezelvorming een van de gebieden is die ook verbetering heeft gezien door de ontwikkeling van deze techniek. Het genereren van warmte en druk in een afgesloten flacon heeft inherent gevaar. Draag altijd persoonlijke beschermingsmiddelen bij het uitvoeren van deze procedures.