Name: Zuivering en transplanteren van Myogenic Progenitor cel afgeleid Exosomes ter verbetering van de hartfunctie bij Duchenne Muscular Dystrofe muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Leer exosoomzuivering en intramyocardiale transplantatie om de hartfunctie bij Duchenne musculaire dystrofie muizen te verbeteren. Deze methode toont therapeutisch potentieel voor cardiomyopathiebehandeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tang werden slechts gedeeltelijk ondersteund door de American Heart Association: GRNT31430008 NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.

Dieren werden verwerkt volgens goedgekeurde protocollen en het welzijn van dieren verordeningen van de institutionele Animal Care en gebruik van het Comité van de Medical College of Georgia Augusta Universiteit.
1. isolatie en zuivering van MPC afkomstige Exosomes
<ol><li>Zaad 5 x 106 C2C12 cellen in een 15 cm cel cultuur schotel met 20 mL volledige Dulbecco bewerkt Eagle's medium (DMEM) met 10% foetale runderserum (FBS), 100 U/mL penicilline G en 100 μg/mL streptomycine. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2.</li>
	<li>Voorbereiden op middellange exosome-uitgeput door ultracentrifugatie van FBS bij 100.000 x g 18 uur bij 4 ° C met behulp van een swingende emmer rotor. Gooi de pellet.</li>
	<li>Vervang de complete DMEM met exosome-verarmd medium wanneer enkelgelaagde cellen 80% samenvloeiing in de cultuur-schotel bereiken.</li>
	<li>Gebruik een pipet overdracht voor het verzamelen van de bovendrijvende substantie van de cel cultuur schotel elke 48 uur voor een totaal van drie keer. Verzamelen het supernatant in 50 mL centrifuge buizen en centrifuge bij 150 x g gedurende 10 minuten te verwijderen van de resterende cellen.</li>
	<li>Filtreer het supernatant door een 0,22 μm-filter om te elimineren cel puin. Ultracentrifuge het gefilterde medium in ultra-heldere buizen met behulp van de swingende emmer rotor op 100.000 x g gedurende 120 minuten bij 4 ° C te precipiteren exosomes.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet exosome-bevattende in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en vul de hele ultra-heldere buis met PBS. Uitvoeren ultracentrifugatie deze schorsing bij 100.000 x g gedurende 120 minuten bij 4 ° C tot het elimineren van contaminerende eiwitten.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet exosome in 100 µL PBS. -80 ° C voor toekomstig gebruik opslaan.</li>
	<li>P.a. van elektronenmicroscopie, 3 µL van schorsing van de exosomal op een 200 netraster met koperen elektronenmicroscoop formvar beklede gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te plaatsen. Ga verder met standaard uranyl acetaat kleuring van23. Het raster van semi-droge onderzoeken door transmissie-elektronenmicroscopie.</li>
</ol>2. Intramyocardial Exosome levering
Opmerking: We hebben zes muizen gebruikt in elke groep.
<ol><li>DBA/2J-DMDMDX muizen (man, leeftijd > 10 maanden; lichaamsgewicht (BW) > 18 g) met intraperitoneaal (i.p.) injectie van 100 mg/kg BW van ketamine gecombineerd met 10 mg/kg BW xylazine anesthetize, en bevestig de diepte van de verdoving door teen snuifje.</li>
	<li>Corrigeer elke muis in liggende positie op een chirurgische platform met behulp van tape om te beveiligen elke ledemaat en plaatsen van een 3-0 hechtdraad horizontaal onder de bovenste tanden aan de bovenkaak op zijn plaats houden.</li>
	<li>De ontharende room van toepassing op de linkerkant van de borst van de muis te verwijderen van de vacht van de huid.</li>
	<li>Endotracheale intubatie via de mondholte met behulp van een katheter 24 G uitvoeren en ventileren van de muis met kamer lucht met een snelheid van 195 adem/min met behulp van een knaagdier ventilator (Zie de Tabel van de materialen).</li>
	<li>Desinfecteren van de huid met 75% alcohol en 10% Povidon jodium.</li>
	<li>Maken van een 10\u201215 mm schuine snede vanaf de linkerrand van de sternale aan de linker oksel, knipt de m. pectoralis major en pectoralis minor door een schaar en daarna een linker Thoracotomie maken door de Vierde intercostale ruimte. Zachtjes invoegen de oprolmechanisme bands te verspreiden van de borstholte tot een breedte van 10 mm. Zorg om te voorkomen dat schade aan de linker long.</li>
	<li>Gebruik twee rechte pincet te verwijderen van het hartzakje, trek ze uit elkaar en plaats ze achter de oprolmechanisme tips om het hart bloot te stellen. MPC-Exo injecteren (50 μg in 30 µL PBS) of 30 μL PBS (als een besturingselement) intramyocardially in de voorste wand van de linkerventrikel met behulp van een naald van de insuline 31 G op één site.</li>
	<li>Gebruik 6-0 nylon hechtingen te sluiten van de borstholte, de pectoralis spieren en de huid in de juiste volgorde.</li>
	<li>Herstellen van muizen. Zodra ritmische, spontane ademhaling aanwezig is, verwijdert u de muizen van de ventilator, en extubate. Observeren en registreren de muizen voorwaarde na de operatie.</li>
</ol>3. echocardiografie
Opmerking: Een enkele waarnemer verblind aan de experimentele groepen voert echocardiografie en data analyse.
<ol><li>Twee dagen na de transplantatie van PBS/exosome, anesthetize de muizen met 1\u20122% Isofluraan.</li>
	<li>Los van een muis in liggende positie met behulp van tape en de voorverwarmde akoestische gel van toepassing op het gebied van de linker borst.</li>
	<li>
Beoordelen ventriculaire functie left door echocardiografie als eerder beschreven16,24.
	<ol>
<li>Verkrijgen van de parasternal lange as weergave van de linker ventrikel (LV) in twee dimensies (B-modus) en vervolgens de ultrasone sonde 90° worden gedraaid zodat ze een LV korte-axis Bekijk papillaire spier niveau te verkrijgen.</li>
		<li>Record echocardiographic beelden van de M-stand en maatregel links ventriculaire einde-diastolische diameter (LVEDD), linker ventriculaire einde-systolische volume (LVESD), linker ventriculaire einde-diastolische volume (LVEDV) en linker ventriculaire einde-systolische volume (LVESV). Opmerking: Fractionele verkorting (FS-%) = [(LVEDD − LVESD) / LVEDD] x 100 en linker ventriculaire ejectie fractie (LVEF %) = [(LVEDV − LVESV) / LVEDV] x 100.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Immunohistochemistry
<ol><li>Twee dagen na de transplantatie van PBS/exosome, anesthetize van muizen (zie stap 2.1) en het borstbeen opengesneden om de borstholte bloot te stellen. Ontleden van de vena cava inferior en perfuse van het hart via de apex van de linkerventrikel met 3 mL PBS, gevolgd door 3 mL 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur, met behulp van een katheter vlinder met een 25 G naald aangesloten op een 5 mL spuit.</li>
	<li>Vaste harten inbedden in paraffine, en snijd in 5 μm dik secties.</li>
	<li>Deparaffinize van de dia's in xyleen en hydrateren in ethanol oplossingen in volgende volgorde: 100% xyleen (3 min), 100% xyleen (3 min), 100% ethanol (1 min), 100% ethanol (1 min), 95% ethanol (1 min), 80% ethanol (1 min), H2O (1 min).</li>
	<li>Fix weefselsecties met 4% paraformaldehyde gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Onderdompelen van dia's in Natriumcitraat (0,01 M, pH 6.0) en het uitvoeren van antigeen ophalen met behulp van een antigeen retriever.</li>
	<li>Permeabilize secties gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met 1% polyethyleenglycol tert-octylphenyl ether in PBS.</li>
	<li>Secties met 5% geit serum in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur te blokkeren.</li>
	<li>Incubeer secties met verdunde primair antilichaam (anti-Dystrofine antilichaam) in PBS (1:100) 's nachts bij 4 ° C, dan Spoel driemaal met PBS voor 5 min.</li>
	<li>Secties met verdunde secundair antilichaam (Alexa Fluor 488 geconjugeerd geit anti-konijn IgG) in PBS (1:400) voor 45 min bij kamertemperatuur incuberen.</li>
	<li>Controle autofluorescence met behulp van een autofluorescence blussen kit (Zie de Tabel van de materialen).</li>
	<li>Gebruik montage opslagmedium met DAPI (Zie de Tabel van materialen) te monteren op de dia's.</li>
	<li>Observeren van dia's onder een confocal microscoop.</li>
</ol>

<ol><li>Yiu, E. M., Kornberg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Paediatrics+and+Child+Health%22%5BJournal%5D)">Duchenne muscular dystrophy.</a> Journal of Paediatrics and Child Health. 51 (8), 759-764 (2015).</li>
<li>Nudel, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duchenne+muscular+dystrophy+gene+product+is+not+identical+in+muscle+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Duchenne muscular dystrophy gene product is not identical in muscle and brain.</a> Nature. 337 (6202), 76-78 (1989).</li>
<li>Rae, M. G., O'Malley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cognitive+dysfunction+in+Duchenne+muscular+dystrophy%3A+a+possible+role+for+neuromodulatory+immune+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Cognitive dysfunction in Duchenne muscular dystrophy: a possible role for neuromodulatory immune molecules.</a> Journal of Neurophysiology. 116 (3), 1304-1315 (2016).</li>
<li>Mah, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+review+and+meta-analysis+on+the+epidemiology+of+Duchenne+and+Becker+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disorders%22%5BJournal%5D)">A systematic review and meta-analysis on the epidemiology of Duchenne and Becker muscular dystrophy.</a> Neuromuscular Disorders. 24 (6), 482-491 (2014).</li>
<li>D'Amario, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+current+approach+to+heart+failure+in+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Heart%22%5BJournal%5D)">A current approach to heart failure in Duchenne muscular dystrophy.</a> Heart. 103 (22), 1770-1779 (2017).</li>
<li>Koeks, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Outcomes+in+Duchenne+Muscular+Dystrophy%3A+A+Study+of+5345+Patients+from+the+TREAT-NMD+DMD+Global+Database%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuromuscular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Clinical Outcomes in Duchenne Muscular Dystrophy: A Study of 5345 Patients from the TREAT-NMD DMD Global Database.</a> Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (4), 293-306 (2017).</li>
<li>Kamdar, F., Garry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin-Deficient+Cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Dystrophin-Deficient Cardiomyopathy.</a> Journal of the American College of Cardiology. 67 (21), 2533-2546 (2016).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+Therapy+for+Cardiomyopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Regenerative Therapy for Cardiomyopathies.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).</li>
<li>Fayssoil, A., Nardi, O., Orlikowski, D., Annane, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyopathy+in+Duchenne+muscular+dystrophy%3A+pathogenesis+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Failure+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy: pathogenesis and therapeutics.</a> Heart Failure Reviews. 15 (1), 103-107 (2010).</li>
<li>Hagan, M., Ashraf, M., Kim, I. M., Weintraub, N. L., Tang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+regeneration+of+dystrophic+muscle+using+autologous+iPSC-derived+progenitors+with+CRISPR-Cas9+mediated+precise+correction%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Hypotheses%22%5BJournal%5D)">Effective regeneration of dystrophic muscle using autologous iPSC-derived progenitors with CRISPR-Cas9 mediated precise correction.</a> Medical Hypotheses. 110, 97-100 (2018).</li>
<li>Quinlan, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+mdx+mouse+cardiomyopathy%3A+physiological+and+morphological+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disorders%22%5BJournal%5D)">Evolution of the mdx mouse cardiomyopathy: physiological and morphological findings.</a> Neuromuscular Disorders. 14 (8-9), 491-496 (2004).</li>
<li>Siemionow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+Dystrophin+Expressing+Chimeric+Cells+of+Myoblast+Origin+as+a+Novel+Stem+Cell+Based+Therapy+for+Duchenne+Muscular+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Creation of Dystrophin Expressing Chimeric Cells of Myoblast Origin as a Novel Stem Cell Based Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 14 (2), 189-199 (2018).</li>
<li>Sienkiewicz, D., Kulak, W., Okurowska-Zawada, B., Paszko-Patej, G., Kawnik, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duchenne+muscular+dystrophy%3A+current+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutic+Advances+in+Neurological+Disorders%22%5BJournal%5D)">Duchenne muscular dystrophy: current cell therapies.</a> Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 8 (4), 166-177 (2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+engraftment+of+myogenic+progenitors+from+adipose-derived+stem+cells+and+muscle+regeneration+in+dystrophic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Long-term engraftment of myogenic progenitors from adipose-derived stem cells and muscle regeneration in dystrophic mice.</a> Human Molecular Genetics. 24 (21), 6029-6040 (2015).</li>
<li>Ju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+Cardiac+Mesenchymal+Stem+Cell-Derived+Exosomes+for+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes for Angiogenesis.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 429-437 (2018).</li>
<li>Ju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+Cardiac+Mesenchymal+Stem+Cell-Derived+Exosomes+Promotes+Repair+in+Ischemic+Myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Promotes Repair in Ischemic Myocardium.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 420-428 (2018).</li>
<li>Ruan, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suxiao+Jiuxin+pill+promotes+exosome+secretion+from+mouse+cardiac+mesenchymal+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Suxiao Jiuxin pill promotes exosome secretion from mouse cardiac mesenchymal stem cells in vitro.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 569-578 (2018).</li>
<li>Ruan, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+from+Suxiao+Jiuxin+pill-treated+cardiac+mesenchymal+stem+cells+decrease+H3K27+demethylase+UTX+expression+in+mouse+cardiomyocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Exosomes from Suxiao Jiuxin pill-treated cardiac mesenchymal stem cells decrease H3K27 demethylase UTX expression in mouse cardiomyocytes in vitro.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 579-586 (2018).</li>
<li>Chen, Y., Tang, Y., Fan, G. C., Duan, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+novel+biomarkers+and+pharmaceutic+targets+of+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as novel biomarkers and pharmaceutic targets of diseases.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 499-500 (2018).</li>
<li>Chen, Y., Tang, Y., Long, W., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell-Released+Microvesicles+and+Exosomes+as+Novel+Biomarkers+and+Treatments+of+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Stem Cell-Released Microvesicles and Exosomes as Novel Biomarkers and Treatments of Diseases.</a> Stem Cells International. 2016, 2417268(2016).</li>
<li>Murphy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+extracellular+vesicles+in+musculoskeletal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Emerging role of extracellular vesicles in musculoskeletal diseases.</a> Molecular Aspects of Medicine. 60, 123-128 (2018).</li>
<li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-Derived+Dystrophin+from+Allograft+Myogenic+Progenitors+Improves+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).</li>
<li>Hu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+shuttling+of+microRNA-29+regulates+HIV+Tat+and+morphine-mediated+neuronal+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated shuttling of microRNA-29 regulates HIV Tat and morphine-mediated neuronal dysfunction.</a> Cell Death & Disease. 3, 381(2012).</li>
<li>Bayoumi, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+carvedilol-responsive+microRNA%2C+miR-125b-5p+protects+the+heart+from+acute+myocardial+infarction+by+repressing+pro-apoptotic+bak1+and+klf13+in+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">A carvedilol-responsive microRNA, miR-125b-5p protects the heart from acute myocardial infarction by repressing pro-apoptotic bak1 and klf13 in cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 72-82 (2018).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%2Fmicrovesicles+from+induced+pluripotent+stem+cells+deliver+cardioprotective+miRNAs+and+prevent+cardiomyocyte+apoptosis+in+the+ischemic+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Exosomes/microvesicles from induced pluripotent stem cells deliver cardioprotective miRNAs and prevent cardiomyocyte apoptosis in the ischemic myocardium.</a> International Journal of Cardiology. 192, 61-69 (2015).</li>
<li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).</li>
<li>Oksvold, M. P., Neurauter, A., Pedersen, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+bead-based+isolation+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Magnetic bead-based isolation of exosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 1218, 465-481 (2015).</li>
<li>Pedersen, K. W., Kierulf, B., Neurauter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+and+Generic+Isolation+of+Extracellular+Vesicles+with+Magnetic+Beads%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Specific and Generic Isolation of Extracellular Vesicles with Magnetic Beads.</a> Methods in Molecular Biology. 1660, 65-87 (2017).</li>
<li>Teng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Stem+Cell-Derived+Exosomes+Improve+the+Microenvironment+of+Infarcted+Myocardium+Contributing+to+Angiogenesis+and+Anti-Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Improve the Microenvironment of Infarcted Myocardium Contributing to Angiogenesis and Anti-Inflammation.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 37 (6), 2415-2424 (2015).</li>
<li>Aminzadeh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-Mediated+Benefits+of+Cell+Therapy+in+Mouse+and+Human+Models+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Exosome-Mediated Benefits of Cell Therapy in Mouse and Human Models of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 942-955 (2018).</li>
</ol>

Alle auteurs verklaart dat zij hebben geen conflicten van interesse.

De methode van het isoleren van pure exosomes is essentieel voor de studie van de functie van exosomes. Een van de gebruikte technieken voor exosome isolatie is polyethyleen glycolen (pinnen) gemedieerde neerslag17,18,25. Exosomes kunnen worden neergeslagen in haringen en Ingehuld door lage snelheid centrifugeren. PEG-gemedieerde zuivering is erg handig, goedkope, hoeft niet alle geavanceerde apparatuur, maar er bestaat bezorgdh...

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is een X-gebonden recessieve, progressieve neuromusculaire ziekte veroorzaakt door een mutatie in gen DMD en het verlies van functionele Dystrofine1. Dystrofine voornamelijk in skeletspieren en myocard wordt uitgedrukt, en minder wordt uitgedrukt in gladde spieren, endocriene klieren en neuronen2,3. DMD is de meest voorkomende vorm van spierdystrofie met een incidentie van één per 3.500 tot 5.000 pasgeboren jongens wereldwijd4,5. Individuen ontwikkelen meestal progressieve spier necrose, verlies van onafhankelijke wandelen door vroege adolescentie, en dood in de decennia van de tweede naar de derde van hun leven als gevolg van hartfalen en respiratoir falen6.
Verwijde cardiomyopathie, aritmieën en congestief hartfalen zijn gemeenschappelijke cardiovasculaire uitingen van DMD7,8. De ziekte kan niet worden genezen, ondersteunende behandeling kan symptomen verbeteren of vertragen van de progressie van hartfalen, maar het is heel moeilijk om het hart functie9,10.
Soortgelijk aan DMD patiënten, spierdystrofie X-gebonden (MDX) muizen hebben een tekort in het Dystrofine-eiwit en huidige symptomen van cardiomyopathie11, en worden daarom veel gebruikt bij DMD verbonden cardiomyopathie onderzoek. Om te herstellen van Dystrofine in betrokken spieren, heeft allogene stamcel therapie bewezen een effectieve behandeling voor DMD12,13,14. Exosomes, 30-150 nm membraan blaasjes uitgescheiden door verschillende celtypes, spelen een sleutelrol in de cel-naar-cel communicatie via genetische materiaal vervoer, zoals messenger-RNA (mRNA) en niet-coderende RNAs15,16,17 ,18,19,20,21.
Onze vorige studies hebben aangetoond dat exosomes afgeleid van myogenic voorlopercellen (MPC), zoals C2C12 cellijn, Dystrofine kunt overbrengen mRNA naar host cardiomyocytes na directe cardiale injectie22, waarmee wordt aangegeven dat allogene levering van MPC-afgeleide exosomes (MPC-Exo) kunt Transient DMD genexpressie in MDX-muizen herstellen. Dit artikel richt zich op de zuivering en -transplantatie technieken MPC-Exo.

<table><tbody><tr><td>0.22 &mu;m Filter</td><td>Fisherbrand</td><td>09-720-004</td><td></td></tr><tr><td>15 cm Cell Culture Dish</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>157150</td><td></td></tr><tr><td>24 G catheter</td><td>TERUMO</td><td>SR-OX2419CA</td><td></td></tr><tr><td>31 G insulin needle</td><td>BD</td><td>328291</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde&nbsp;</td><td>Affymetrix</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Centrifuge Tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>6-0 suture</td><td>Pro Advantage by NDC</td><td>P420697</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic Antimycotic Solution</td><td>Corning&nbsp;</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Dystrophin antibody</td><td>Abcam</td><td>ab15277</td><td></td></tr><tr><td>Antigen retriever&nbsp;</td><td>Aptum Biologics</td><td>R2100-US</td><td>Antigen recovery</td></tr><tr><td>Autofluorescence Quenching Kit&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP-8400</td><td></td></tr><tr><td>C2C12 cell line</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Unico</td><td>C8606</td><td></td></tr><tr><td>Change-A-Tip High Temp Cauteries</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>HIT</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscopy</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss 780 Upright Confocal</td><td></td></tr><tr><td>DBA/2J-mdx mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>013141</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning&nbsp;</td><td>10-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Corning&nbsp;</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum&nbsp;</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>191356</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-1389</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Henry Schein</td><td>056344</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Medium with DAPI&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Retractor Set</td><td>Kent Scientific</td><td>SURGI-5001</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Rodent ventilator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>55-7066</td><td></td></tr><tr><td>SW-28 Ti rotor</td><td>Beckman</td><td>342207</td><td></td></tr><tr><td>The Vevo 2100 Imaging Platform</td><td>FUJIFILM VisualSonics</td><td>Vevo 2100</td><td>Ultrasound System&nbsp;</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman</td><td>365672</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear Tubes</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine (XylaMed)</td><td>Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td><td>1XYL003 8XYL006</td><td></td></tr></tbody></table>

zuivering en transplanteren van myogenic progenitor cel afgeleid exosomes ter verbetering van de hartfunctie bij duchenne muscular dystrofe muizen

Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice

Duchene Muscular Dystrophy (DMD) is een X-gebonden recessieve genetische ziekte die wordt veroorzaakt door een gebrek aan functionele Dystrofine-eiwit. De ziekte kan niet worden genezen, en naarmate de ziekte vordert, ontwikkelt de patiënt symptomen van verwijde cardiomyopathie, aritmie en congestief hartfalen. De DMDMDX mutant muizen doen niet express Dystrofine en worden vaak gebruikt als een muismodel van DMD. In onze recente studie, die we hebben vastgesteld dat intramyocardial injectie van brede type (WT)-myogenic voorlopercellen cellen afkomstige exosomes (MPC-Exo) Transient hersteld de uitdrukking van Dystrofine in het myocardium van DMDMDX mutant muizen, die werd geassocieerd met een tijdelijke verbetering van de hartfunctie suggereren dat kan WT-MPC-Exo bieden een optie voor het verlichten van de cardiale symptomen van DMD. Dit artikel beschrijft de techniek van MPC-Exo-zuivering en transplantatie in het hart van DMDMDX mutant muizen.

Een stroomschema om te isoleren en zuiveren van exosomes van C2C12 cellen wordt weergegeven in Figuur 1A. Controleer de aanwezigheid van exosomes, we Transmissie Electronenmicroscopie analyse uitgevoerd. Transmissie Electronenmicroscopie beeld (Figuur 1B) toont de morfologie van de blaasjes helder en ronde vorm van C2C12 afgeleide exosomes. Westelijke vlekkenanalyse bevestigde de aanwezigheid van markeringen in exosome, met inbe...

Hier presenteren we een protocol om Transient hartfunctie bij Duchenne spierdystrofie muizen door exosomes afgeleid van normale myogenic voorlopercellen verplanten.

Zuivering en transplanteren van Myogenic Progenitor cel afgeleid Exosomes ter verbetering van de hartfunctie bij Duchenne Muscular Dystrofe muizen

Duchene Muscular Dystrophy (DMD) is an X-linked recessive genetic disease caused by a lack of functional dystrophin protein. The disease cannot be cured, ...

Dit protocol presenteert de methode om de hartfunctie bij duchenne's spierdystrofie muizen tijdelijk te verbeteren door exon afgeleid van normale myogene voorlopercellen te transplanteren. De exosomale transplantatie kan de hartfunctie bij DMD-muizen verbeteren in combinatie met een verhoogde expressie van dystrofie in de harten van de ontvanger. De juiste methode voor exonisolatie, zuivering en intramyocardiale transplantatie dragen tot het succes van de exontransplantatie bij om hartfunctie voor muizen met de spierdystrofie van Duchenne te verbeteren.MPC-afgeleide exosoomtherapie kan de skeletspierfunctie verbeteren door exosoomgemedieerde normale dystrofische mRNA-overdracht. Deze video toont de kritische technieken voor exosoom zuivering, intramyocardiale exosoom levering, en echocardiografie post-transplantatie. De demonstratie van echocardiografie zal worden gedaan door Yan Shen, technicus van ons lab.Om te beginnen met deze procedure, zaad vijf miljoen C2C12 cellen in een 15 centimeter cultuur schotel met 20 milliliter van volledige DMEM met 10%FBS en antibiotica. Incubeer bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide. Gebruik vervolgens een swingende emmerrotor om FBS op 100,000 keer G en 18 uur lang bij vier graden Celsius te bereiden om exosoomarm medium voor te bereiden.Gooi de pellet weg en verzamel de supernatant. Wanneer de monolaagcellen 80% samenvloeiing in het kweekschotel bereiken, vervangt u de volledige DMEM door exosoomarm medium. Gebruik een transfer pipet om de supernatant te verzamelen van de cel cultuur schotel om de 48 uur.Centrifugeren de buizen op 150 keer G gedurende tien minuten om de resterende cellen te verwijderen. Filtreer de supernatant door een filter van 0,22 micrometer om celpuin te elimineren en het gefilterde medium over te brengen naar ultrahelde buizen. Gebruik vervolgens een swingemmerrotor om de buizen op 100, 00 keer G en 4 graden Celsius gedurende 120 minuten te ultracentrifugeren om de exosomen neer te slaan.Resuspend de exosoom-bevattende pellet in PBS en vul vervolgens de gehele ultra-clear buis met PBS. Ultracentrifuge deze suspensie op 100, 00 keer G en bij 4 graden Celsius gedurende 120 minuten om vervuilende eiwitten te elimineren. Gooi de supernatant weg en verleg de exosoompel in 100 microliter pbs.Bewaar bij min 80 graden Celsius voor toekomstig gebruik. Ten eerste, fix elke verdoofde muis in de supine positie op een chirurgisch platform door het beveiligen van elke ledemaat met tape. Plaats een 3-0 hechting horizontaal onder de boventanden om de bovenkaak op zijn plaats te houden.Breng vervolgens ontharingscrème aan op de linkerkant van de borst van de muis om de spar van de huid te verwijderen. Met behulp van een 24-meter katheter, uit te voeren endotracheale intubatie via de mondholte. En gebruik een knaagdier ventilator om de muis te ventileren met kamerlucht met een snelheid van 195 ademhalingen per minuut.Desinfecteer de huid met 70% alcohol en 10%povidone jodium. Maak vervolgens een schuine incisie van 10 tot 15 millimeter van de linker achtersteven rand naar de linker oksel. Gebruik schaar om de pectoralis major en pectoralis minor te snijden.En maak een linkse thoracotamie door de vierde intercoastal ruimte. Steek voorzichtig oprolbanden in om de borstholte te verspreiden tot een breedte van 10 millimeter, waarbij u ervoor zorgt dat de linkerlong niet wordt beschadigd. Gebruik hierna twee rechte pincet om het pericardium te verwijderen.Trek ze uit elkaar en plaats ze achter de oprolbare tips om het hart bloot te leggen. Gebruik een 31-meter insulinenaald om MPC-Exo of PBS intramyocardiaal te injecteren in de voorste wand van de linkerventrikel op één locatie. Gebruik vervolgens 6-0 nylon hechtingen om de borstholte, de pectoralisspieren en de huid achter elkaar te sluiten.Twee dagen na de PBS exosoomtransplantatie verdoven de muizen zoals beschreven in het tekstprotocol. Gebruik tape om een muis in de supine positie vast te stellen en voorverwarmde akoestische gel toe te passen op de linker borst. Gebruik vervolgens echocardiografie om de linker ventriculaire functie te beoordelen.Verkrijg het zicht op de linkerventrikel in twee dimensies en draai de ultrasone sonde 90 graden om een korte asweergave aan de linker ventrikel op het papillaire spierniveau te verkrijgen. Neem hierna echocardiografische afbeeldingen in de M-modus op en meet de linker ventriculaire einddiastolische diameter, het linker ventriculaire eindsystolische volume, het linker ventriculaire einddiastolvolume en het linker ventriculaire eindsystolische volume. De hartslag van de muizen moet ten minste 400 bpm worden gecontroleerd voor de hartmetingsfunctie.Nadat exosomen zijn geïsoleerd en gezuiverd uit C2C12-cellen, wordt hun aanwezigheid bevestigd met behulp van transmissieelektronenmicroscopieanalyse. Het transmissieelektronenmicroscopiebeeld toont de morfologie van de heldere en ronde vesikels van C2C12-afgeleide exosomen. Westerse blot analyse bevestigt de aanwezigheid van exosoom markers waaronder CD63 en Tsg101.Een doorschijnend oedeemgebied wordt waargenomen na de intramyocardiale injectie in de voorste wand van de linkerventrikel van mdx-muizen, wat aangeeft dat de injectie in het myocardium succesvol is. Immunofluorescente kleuring voor dystrofine wordt vervolgens uitgevoerd om te bepalen of cardiale MPC-Exo levering herstelt dystrofisch-eiwit expressie in mdx harten. Gedeeltelijke restauratie van dystrofie expressie wordt waargenomen met membraan lokalisatie in sommige van cardiomyocyten.De hartfunctie wordt gemeten door echocardiografie twee dagen na intramyocardiale levering om te bepalen of transplatie van MPC-Exo de hartfunctie bij mdx-muizen verbetert. De MPC-Exo behandeling wordt gezien ter verbetering van de binnenwand beweging in vergelijking met PBS, wat suggereert dat MPC-Exo transplantatie verbeterde cardiale functie in mdx muizen. Met behulp van een 31 meter insulinenaald met de tip op ongeveer 20 graden is van cruciaal belang voor het succes voor de levering van de meeste exosomen in het myocardium en maximaliseert de blootstelling van geïnjecteerde exosomen om cardiomyocyten host.Na de procedure kan dystrofineexpressie worden gedetecteerd na MPC-afgeleide exosoominjectie door immunofluorescente vlekken die erop wijzen dat cardiale MPC-afgeleide exosoomlevering dystrofisch-eiwitexpressie herstelt. Deze techniek zal de weg vrijmaken voor cardiomyopathie behandeling met exosoom-dragende therapeutische genetische materialen, waaronder DNA, mRNA, lncRNA, of microRNAs.

purification-transplantation-myogenic-progenitor-cell-derived

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC)-afgeleide myogene voorlopers zijn veelbelovende kandidaten voor celtherapiestrategieën om spierdystrofieën te behandelen. Dit protocol beschrijft transplantatie en functionele metingen die nodig zijn om de engraftment en differentiatie van iPSC-afgeleide mesoangioblasten (een type spiergenitors) te evalueren in muismodellen van acute en chronische spierregeneratie.

Transplantatie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide mesoangioblast-achtige myogene voorlopers in muismodellen van spierregeneratie

De isolatie en cultuur van een zuivere populatie van rustende cellen satelliet, een spier stamcelpopulatie, is essentieel voor het begrip van spier stamcel biologie en regeneratie, en stamceltransplantatie voor therapieën spierdystrofie en andere degeneratieve ziekten.

Isolatie, Cultuur en Transplantatie van Muscle satelliet-cellen

Dit protocol omvat gedetailleerde procedures voor de isolatie van urine-afgeleide cellen van patiënten met spierdystrofie; hun efficiënte en snelle herprogrammering door Sendai-virus transductie.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van spierdystrofie patiënten: Efficiënte-Integratie gratis herprogrammeren van Urine-afgeleide cellen

We presenteren drie nieuwe en efficiëntere protocollen voor differentiatie humane geïnduceerde pluripotente stamcellen in cardiomyocyten, endotheelcellen en gladde spiercellen en bezorg- de engraftment van getransplanteerde cellen verbetert door het combineren celinjectie met patch-gemedieerde cytokine.

Pluripotente stamcellen afkomstig van hartcellen voor myocard reparatie

Hier bieden we een gedetailleerd protocol te verrichten in vivo cardiale gene bewerken in muizen met behulp van recombinant Adeno-Associated Virus (rAAV)-gemedieerde levering van CRISPR. Dit protocol biedt een veelbelovende therapeutische strategie voor de behandeling van Dystrofe cardiomyopathie in Duchenne spierdystrofie en kan worden gebruikt voor het genereren van cardiale-specifieke knock-out in de postnatale muizen.

Adeno-Associated Virus-gemedieerde levering van CRISPR voor cardiale Gene bewerken in muizen

Hier presenteren we een Cas9-gebaseerd exon23 deletie protocol om Dystrofine expressie in iPSC te herstellen van DMDMDX Mouse-afgeleide huid fibroblasten en direct ipscs te onderscheiden in myogene voorlopercellen (MPC) met behulp van het Tet-on myod activeringssysteem.

CRISPR/Cas9 technologie in het herstellen van Dystrofine expressie in door iPSC afgeleide spier voorlopercellen

Complexe menselijke ziekten kunnen lastig zijn om te modelleren in traditionele laboratoriummodel systemen. Hier beschrijven we een chirurgische benadering om de menselijke spierziekte te modelleren door de transplantatie van menselijke skeletspier biopsieën in immunodeficiënte muizen.

Het uitvoeren van menselijke skeletspieren xenografts in Immunodeficiënte muizen

In dit artikel beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het efficiënt modelleren van Duchenne spierdystrofie met behulp van MYOD1-geconverteerdeurine-afgeleide cellen om het herstel van dystrofine mRNA en eiwitniveaus te evalueren na exon overslaan.

Exon Overslaan in direct geherprogrammeerd Myotubes verkregen uit menselijke urine-afgeleide cellen

Dit protocol illustreert de 1) de isolatie en kweek van primaire fibroblasten uit de gastrocnemius-spier van volwassen muizen, evenals 2) zuivering en karakterisering van exosomen met behulp van een differentiële ultracentrifugatiemethode in combinatie met sucrosedichtheidsgradiënten gevolgd door western blot-analyses.

Isolatie en karakterisering van exosomen uit skeletspierfibroblasten

Dit protocol beschrijft de omzetting van huidfibbroblasten in myoblasten en hun differentiatie in myotubes. De cellijnen zijn afgeleid van patiënten met neuromusculaire aandoeningen en kunnen worden gebruikt om pathologische mechanismen te onderzoeken en therapeutische strategieën te testen.

Directe herprogrammering van menselijke fibroblasten in myoblasten om therapieën voor neuromusculaire aandoeningen te onderzoeken

Echogeleide celafgifte rond de plaats van myocardinfarct bij muizen is een veilige, effectieve en handige manier van celtransplantatie.

Echogeleide geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocytenimplantatie bij myocardinfarct muizen

Leer exosoomzuivering en intramyocardiale transplantatie om de hartfunctie bij Duchenne musculaire dystrofie muizen te verbeteren. Deze methode toont therapeutisch potentieel voor cardiomyopathiebehandeling.

Zuivering en transplanteren van Myogenic Progenitor cel afgeleid Exosomes ter verbetering van de hartfunctie bij Duchenne Muscular Dystrofe muizen (Video) | JoVE Journal

Zuivering en transplanteren van Myogenic Progenitor cel afgeleid Exosomes ter verbetering van de hartfunctie bij Duchenne Muscular Dystrofe muizen

Meer video's verkennen