Conversie van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) in functionele spinale en craniale motor neuronen met behulp van PiggyBac vectoren

De mogelijkheid van het genereren van verschillende subtypes van motorneuronen is vooral relevant voor het modelleren van moderne motorische neuron ziekten zoals amyotrofische laterale sclerose. Deze methode maakt het mogelijk de verwerving van celpopulaties die zeer stijf zijn voor motorische neuronen met een spinale of schedelidentiteit in een kort tijdsbestek en zonder de zuiveringsstap. De generatie van menselijke motorische neuronen uit geïnduceerde pluripotente stamcellen of iPSC onder vereenvoudigde kweekconditie kan het screenen van geneesmiddelen op motorische neuronziekten vergemakkelijken.

De inducible expressie van het programmeren van transcriptie factor kan worden gebruikt om een andere cel types zoals neuronale, skeletspier, en gliacellen genereren uit een iPSC repository. Voor NIL en NIP iPSC lijn generatie, spoel de menselijke iPSC cultuur met calcium-en magnesium-vrije PBS voor de behandeling van de cellen met cel dissociatie reagens gedurende vijf tot 10 minuten op 37 graden Celsius. Wanneer de cellen zijn begonnen los te maken van de kweekcontainer, gebruik dan een P1000 pipet om de cellen voorzichtig drie tot vier keer handmatig te scheiden.

Breng de cellen naar een buis van 15 milliliter en breng het uiteindelijke volume tot 10 milliliter met verse PBS zonder calcium en magnesium voor het tellen. Verzamel een keer 10 tot de zesde cellen door centrifugatie en resuspend de pellet in 100 microliters van buffer R van de elektroporatie kit. Voeg 4,5 microgram transposable vectorplasma DNA en 0,5 microgram van het piggyBac transposase plasma DNA toe voor transfectie.

Transfecteer met het celelektroratiesysteem volgens de instructies van de fabrikant met de aangegeven parameters. Dan, zaad van de cellen in de menselijke iPSC medium aangevuld met 10 micromolar ROCK remmer Y-27632 in een zes millimeter matrix-gecoate schotel. Twee dagen na de transfectie, voeg 5 microgram per milliliter blasticidin aan de cultuur medium houden van de cellen in het antibioticum voor ten minste zeven tot 10 dagen om de cellen die niet hebben geïntegreerd de transgenes tegen te gaan.

Aan het einde van de incubatie, handhaven van de stabiel getransfecteerde cellen als een gemengde populatie samengesteld uit cellen met verschillende aantallen transgenes en verschillende integratie sites of isoleren enkele klonen. Bereid een extra schotel om de effectieve expressie van de transgenen op een microgram per milliliter van doxycycline inductie te worden beoordeeld door RT-PCR met transgene-specifieke primers voor neurogenine-2 zoals eerder beschreven. In dit stadium moeten de voorraden van de nieuwe NIL- en NIP-iPSC-lijnen ook worden bevroren in vriesmedium voor menselijke IPSC's.

Voor motorische neuron differentiatie, scheiden van de stabiel getransfecteerde celculturen met dissociatie reagens zoals aangetoond dat de cellen worden verzameld in een 15 milliliter buis met vijf volumes DMEM/F12 medium. Na centrifugatie, resuspend de cellen in menselijk iPSC medium aangevuld met micromolar ROCK remmer voor het tellen. Zaad de cellen op matrix-gecoate gerechten op een 6,25 keer 10 de vierde cellen per centimeter kwadraat dichtheid.

Voor de komende twee dagen, vervang de supernatants met verse differentiatie medium aangevuld met doxycycline. Op dag twee, verander het medium naar neurobasale B27 medium aangevuld met gamma secretase remmer, vasculaire endotheelgroeifactor receptor remmer, en doxycyline. Op dag vijf, dissociate de cellen zoals aangetoond en resuspend de vrijstaande cellen in vier milliliter van DMEM/ F12 medium voor het tellen.

Pipetting is belangrijk voor een volledige dissociatie van de cellen. Vries een aliquot van de motorneuron voorlopers in celvriezen medium volgens de instructies van de fabrikant en het verzamelen van de rest van de cellen door centrifugatie. Resuspend de pellet in neuronale medium aangevuld met 10 micromolar ROCK remmer.

Zaad de cellen op polyornithine laminine gecoate microslide ondersteunt met polymeer deksel slips op een keer 10 tot de vijfde cellen per centimeter kwadraat dichtheid. Op dag zes, zorgvuldig vervangen van het medium met verse neuronale medium zonder remmer voor cultuur tot downstream-analyse zonder het losmaken van de cellen van het steunoppervlak. Een uniforme uitdrukking van de pluripotentie marker octamer-bindende transcriptie factor vier of OTC4 kan worden waargenomen in differentiërende celculturen op dag nul in de afwezigheid van pan neuronale marker neuron-specifieke klasse drie beta-tubulin TUJ1 positiviteit.

Op dag drie is een sterke daling van het aantal OCT4-positieve cellen duidelijk. Dat wordt weerspiegeld door de expressie van TUJ1 in een subset van differentiërende iPSC's. Op dag vijf wordt geen expressie van OCT4 waargenomen in de populatie die een consistente expressie van TUJ1 en een verworven neuronale morfologie laat zien.

Immunostaining analyse zeven dagen na het replating van de motorneuron voorloper cellen onthult een uniforme expressie van TUJ1 en de volwassen motorneuron marker choline acetyltransferase. iPSC NIL-afgeleide neuronen met succes weer te geven spanning-afhankelijke natriumstromen en spanning-afhankelijke kaliumstromen. 80% van de iPSC NIL-afgeleide motorneuronen geklemd in de huidige klem modaliteit zijn in staat om spike treinen trigger wanneer geïnjecteerd met een huidige puls van plus 60 picoamps of meer.

De minimale stroom die nodig is om repetitieve vuren in meer dan 50% van de opgenomen cellen uit te lokken is plus 40 picoamps met een piek drempel van ongeveer min 38 millivolt en een gemiddelde afvuren frequentie op plus 40 picoamps van ongeveer acht hertz, wat suggereert dat iPSC NIL-afgeleide spinale motorneuronen vertonen functionele eigenschappen typisch voor volwassen neuronen. Spinale en craniale motorneuronen kunnen worden afgeleid uit gecontroleerde iPSC's of IPSC's die pathologische mutaties dragen en dat deze cellen kunnen worden gebruikt als thesismodellen of voor drugscreening. Onze methode kan worden gebruikt om te helpen begrijpen waarom verschillende motorische neuron eenheden differentieel worden beïnvloed door ALS.