Name: Conversie van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) in functionele spinale en craniale motor neuronen met behulp van PiggyBac vectoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Leer de conversie van menselijke iPSCs naar functionele spinale en craniale motor neuronen met behulp van PiggyBac vectoren. Deze methode versnelt drugscreening voor ALS en andere motorneuronenziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen de Imaging Facility te bedanken bij Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di tecnologia, voor ondersteuning en technisch advies. Wij zijn dankbaar voor de leden van het centrum voor het leven nano wetenschap voor nuttige discussie. Dit werk werd gedeeltelijk gesteund door een toelage van AriSLA (proef toelage 2016 "StressFUS") aan AR.

1. onderhoud van de menselijke iPSCs
<ol><li>
Bereiding van matrix gecoate platen
	<ol>
<li>Dooi één 5 mL flacon van matrijs (Zie de lijst van materialen) bij 4 °c 's nachts. De originele matrijs voorraden komen op verschillende voorraad concentraties en de hoeveelheid wordt gemaakt volgens de verdunningsfactor die op het gegevensblad wordt vermeld, specifiek voor de individuele partij. Het is belangrijk om de flacon en de buizen ijskoud te houden om vroegtijdige geleer van de matrix te voorkomen. Doseer de matrix in de voor gekoelde cryobuizen op het ijs. Bevriezen ongebruikte fracties bij-20 °C.</li>
		<li>Plaats één hoeveelheid ijs voor ongeveer 2 uur om te ontdooien.</li>
		<li>Verdun de hoeveelheid matrix met 20 mL koude DMEM/F12 in een conische buis van 50 mL.</li>
		<li>Meng goed en verdeel 1 mL verdunde matrix in 35 mm schotels (equivalente hoeveelheden per oppervlakte van andere gerechten).</li>
		<li>Houd de afwas met verdunde matrix voor 1 h bij kamertemperatuur om coating mogelijk te maken. Opmerking: Gerechten, verzegeld met Parafilm, kunnen worden opgeslagen bij 4 °C voor maximaal 2 weken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voor bereiding van de stockoplossing (20 ml) en 1x werk hoeveelheid van de zachte cel dissociatie reagens (Zie de lijst van materialen).<ol>
<li>Los poeder op 10 mg/mL in PBS (CA2 +/mg2 + gratis).</li>
		<li>Filter steriliseren door middel van een 0,22 μm filter membraan.</li>
		<li>Bereid 20 maal (1 mL per stuk) en bewaar bij-20 °C.</li>
		<li>Verdun vóór gebruik één hoeveelheid in PBS (CA2 +/mg2 + Free) tot 1 mg/ml (1x werk hoeveelheid). NB: 1x werk hoeveelheid kan maximaal 2 weken bij 4 °c worden opgeslagen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passaging menselijke iPSCs.
	<ol>
<li>Voor aanvang: indien opgeslagen bij 4 °C, pre-warm matrijs-met een laag bedekte platen in de incubator bij 37 °C voor 20-30 min. pre-warm bij kamertemperatuur de hoeveelheid menselijk iPSC middel (Zie vereiste lijst van materialen). Pre-warm de DMEM/F12.</li>
		<li>Aspireren cultuurmedium.</li>
		<li>Spoel iPSCs met PBS (CA2 +/mg2 + gratis).</li>
		<li>Voeg 1x zachte dissociatie oplossing toe (0,5 mL voor een 35 mm schotel). Incubeer bij 37 °C tot de randen van de kolonies beginnen te losmaken van de plaat, gewoonlijk 3-5 min.</li>
		<li>Aspireren de zachte dissociatie oplossing, oplettend om iPSC kolonies niet los te koppelen.</li>
		<li>Was de cellen met DMEM/F12 (2 mL voor een 35 mm schotel) en aspireren wordt voorzichtig niet te ontkoppelen van de cellen. Herhaal deze stap nog een keer.</li>
		<li>Voeg humaan iPSC medium toe (1 mL voor een 35 mm schotel).</li>
		<li>Maak de kolonies voorzichtig los met een cel lifter en breng deze over naar een 15 mL Tube.</li>
		<li>Breek de cel bosjes voorzichtig door het pipetteren op en neer met een P1000 pipetter 3-4 keer.</li>
		<li>Aspireren de bovendrijvende uit de matrix beklede plaat (en).</li>
		<li>Zaad de cellen in het aangewezen cultuur volume van menselijk iPSC middel. De split ratio kan variëren van lijn tot lijn en is ongeveer 1:4-1:8. Verander het medium dagelijks.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. generatie van NIL en NIP Afleidbaar iPSC lijnen
<ol><li>
Cel transfectie.
	<ol>
<li>Spoel de cellen met PBS (CA2 +/mg2 + gratis).</li>
		<li>Voeg cel dissociatie reagens toe (Zie de materiaallijst) (0,35 ml voor een 35 mm schotel) en Incubeer bij 37 °c tot enkele cellen gescheiden zijn (5-10 min).</li>
		<li>Voorzichtig complete cel scheiding door pipetten op en neer met een P1000 pipetter 3-4 keer.</li>
		<li>Verzamel in een 15 mL Tube en voeg PBS (CA2 +/mg2 + gratis) toe aan 10 ml. Tel de cellen.</li>
		<li>Pellet 106 cellen en opnieuw op te schorten in 100 l van buffer R (opgenomen in de cel Electroporation Kit, Zie tabel van materialen).</li>
		<li>Voeg plasmide DNA toe voor Transfectie: 4,5 μg van transponerende vector (epB-BSD-TT-NIL of epB-BSD-TT-NIP12) en 0,5 μg van piggyBac transposase plasmide13.</li>
		<li>Transfect met de cel Electroporation systeem (Zie tabel van materialen) volgens de instructies van de fabrikant en zoals eerder beschreven3 met de volgende parameters: 1.200 V spanning, 30 MS breedte, 1 puls. Zaad van de cellen in de menselijke iPSC medium aangevuld met 10 μM Y-27632 (ROCK-remmer, Zie tabel van materialen) in een 6 mm matrix-gecoate schotel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Selectie met antibiotica.
	<ol>
<li>Voeg twee dagen na transfectie 5 μg/mL blasticidin toe aan het kweekmedium.</li>
		<li>De meeste van de niet-transfected cellen zullen sterven binnen 48 h van blasticidin selectie. Houd de cellen in blasticidin gedurende ten minste 7-10 dagen te Counter-Selecteer de cellen die niet hebben geïntegreerd de transgenes in het genoom.</li>
		<li>Handhaaf stabiel transfected cellen als gemengde bevolking, die uit cellen met verschillend aantal genen en verschillende integratie plaatsen wordt samengesteld, of isoleert enige klonen.</li>
		<li>Bereid een extra schotel om te controleren op effectieve expressie van de transgenen, op 1 μg/mL doxycycline inductie, door RT-PCR met transgene-specifieke primers voor Ngn2 (Forward: TATGCACCTCACCTCCCCATAG; Omgekeerde: GAAGGGAGGAGGGCTCGACT), zoals eerder beschreven12.</li>
		<li>In dit stadium, bevriezen de voorraden van de roman NIL-en NIP-iPSC lijnen in bevriezend middel voor menselijke iPSCs (Zie lijst van materialen).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. motor neuron differentiatie
<ol><li>Scheid de cellen met het reagens van de cel dissociatie zoals beschreven (stappen 2.1.1.-2.1.3.). Verzamel gescheiden cellen in een 15 mL buis en Verdun met 5 volumes van DMEM/F12. Pellet de cellen en opnieuw op te schorten in de menselijke iPSC medium aangevuld met 10 μM ROCK-remmer. Tel de cellen en zaad op matrix-gecoate gerechten bij een dichtheid van 62.500 cellen/cm2.</li>
	<li>De dag na, vervang het medium met DMEM/F12, aangevuld met 1x stabiele L-glutamine analoog, 1x niet-essentiële aminozuur (NEAA) cel cultuur aan te vullen en 0,5 x penicilline/streptomycine, en met 1 μg/mL doxycycline. Dit wordt beschouwd als dag 0 van differentiatie. Op dag 1, vernieuw het medium en doxycycline.</li>
	<li>Op dag 2, verander het medium om Neurobasal/B27 medium (Neurobasal medium aangevuld met 1x B27, 1x stabiele L-glutamine analoog, 1x NEAA en 0,5 x penicilline/streptomycine), met 5 μM DAPT, 4 μM SU5402 en 1 μg/mL doxycycline (Zie tabel van materialen ). Vernieuw het medium en doxycycline elke dag tot dag 5.</li>
	<li>
Dag 5: cellen dissociatie met cel dissociatie reagens (Zie de lijst van materialen).<ol>
<li>Spoel de cellen met PBS (CA2 +/mg2 + gratis).</li>
		<li>Voeg cel dissociatie reagens (0,35 mL voor een 35 mm schotel) en Incubeer bij 37 °C tot de gehele cel monolayer scheidt van de schotel. Merk op dat enkele cellen niet worden gescheiden tijdens de incubatie.</li>
		<li>Voeg 1 mL DMEM/F12 toe en verzamel de cellen in een buis van 15 mL.</li>
		<li>Voorzichtig complete cel scheiding door pipetten op en neer met een P1000 pipetter 10-15 keer.</li>
		<li>Voeg 4 mL DMEM/F12 toe en Tel de cellen.</li>
		<li>In dit stadium, bevriezen motor neuron progenitoren in cel bevriezing medium (Zie tabel van materialen), volgens de fabrikant instructies.</li>
		<li>Pellet de cellen en opnieuw op te schorten in neuronale medium (Neurobasal/B27 medium aangevuld met 20 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF en 200 ng/mL L-ascorbinezuur, Zie tabel van materiaals) aangevuld met 10 μM Rock-remmer.</li>
		<li>Zaad de cellen op poly-Ornithine/laminin-of alternatief op matrijs-met een laag bedekte steunen bij de dichtheid van 100.000 cellen/cm2. Gebruik µ-dia plastic steunen met polymeer dekglaasje (Zie lijst van materialen) voor immunokleuring analyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Op dag 6, verander het medium met verse neuronale medium verstoken van ROCK-remmer. Op de volgende dagen, Vernieuw de helft van het medium om de 3 dagen. Het medium van de cultuur moet zeer zorgvuldig worden veranderd om detachement van de oppervlakte te verhinderen.</li>
</ol>4. immunokleuring analyse
<ol><li>Cel fixatie. Spoel de cellen met PBS (met CA2 +/mg2+) en incubeer voor 15 min in 4% Paraformaldehyde in PBS (met CA2 +/mg2 +) bij kamertemperatuur. Let op: Paraformaldehyde is giftig en verdacht om kanker te veroorzaken. Vermijd contact met huid en ogen en handvat onder een chemische rook kap.</li>
	<li>Permeabilize met PBS (met CA2 +/mg2 +) met 0,1% Triton X-100 voor 5 min bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Incubeer voor 30 min bij kamertemperatuur in antilichaam blokkerende oplossing (ABS: 3% BSA in PBS met CA2 +/mg2 +).</li>
	<li>Incubeer voor 1 h bij kamertemperatuur met primaire antilichamen in ABS: anti-TUJ1 (1:1000; konijn) en anti-Oct4 (1:200; muis) of anti-PRAATJE (anti-choline Acetyltransferase; 1:150; geit). Zie de lijst van materialen.</li>
	<li>Incubeer voor 45 min bij kamertemperatuur met het aangewezen ezel secundaire antilichaam paar in ABS: anti-muis Alexa Fluor 647 (1:250), anti-konijn Alexa Fluor 594 (1:250) en anti-geit Alexa Fluor 488 (1:250). Zie de lijst van materialen.</li>
	<li>Incubeer in 0,4 μg/mL DAPI voor 5 min bij kamertemperatuur om kernen te labelen.</li>
	<li>Monteer de cellen met een bevestigings medium (Zie de materiaallijst) voorbeeld vorming bij een fluorescentiemicroscoop.</li>
</ol>5. functionele karakterisering via flard-klem opnamen
<ol><li>Bereid de HEPES-geëquilibreerd externe oplossing (NES) als volgt voor: 140 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mm MgCl2, 10 mm Hepes, en 10 mm glucose. Stel de osmolariteit tussen 290-300 mΩ. Stel de pH in op 7,3 met behulp van 1N NaOH en bewaar de oplossing bij 4 °C.</li>
	<li>Bereid de interne oplossing voor: 140 mM K-gluconaat, 2 mM NaCl, 5 mM BAPTA, 2 mM MgCl2, 10 mm Hepes, 2 mm mg-ATP, 0,3 mm na-GTP. Pas de pH aan 7,3 met 1M KOH en controleer of de osmolariteit is ingesteld op ongeveer 290 mΩ. Bevriezen van de oplossing bij-20 °C in kleine fracties.</li>
	<li>Voor het uitvoeren van de experimenten, pre-warm de NES oplossing in een waterbad tot ongeveer 28-30 ° c.</li>
	<li>Trek enkele borosilicaatglas micropipetten (ID 0,86 mm; OD 1,5 mm) voorzien van een tip weerstand: 5-6 MΩ en vul met de intracellulaire oplossing alvorens in de pipet houder te monteren. Opmerking: Vergeet niet om chloride zilveren draden van de opname-elektrode en referentie-elektrode in bleekmiddel voor ten minste 30 min om een uniforme laag van AgCl op het draad oppervlak te vormen.</li>
	<li>Breng de Petri schaal in de opname kamer over en laat de kamer met de NES oplossing op 1-2 mL/min. Laat de stroom passeren een inline kachel ingesteld op temperatuur van 30 ° c om de oplossing warm te houden.</li>
	<li>Plaats elektrofysiologische opname kamer onder een rechte Microscoop. Record membraan stromingen met de patch-klem versterker en het verwerven van gegevens met een passende software.</li>
	<li>Open de software voor de versterker besturing en stel de signaal winst op waarde 1 en het Bessel-filter in op 10 kHz. Zorg ervoor dat het Bessel-filter 2,5 keer lager is dan de bemonsteringsfrequentie.</li>
	<li>Stel de experimentele protocollen voor spanning-klem en stroom-klem experimenten in de opname software.</li>
	<li>In het protocolinstelling, Tick episodische stimulatie-modus en stel de sampling frequentie op 25 kHz. Dan, ga naar de golfvorm tab en typ de spanning of de huidige stap amplitude en lengte als volgt.</li>
	<li>Voor de voltage-gated natrium stromingen, gebruik 15 spannings stappen (50 MS duur elk) van-100 mV tot + 40 mV (10 mV Increment). Voer het protocol na het opleggen van de gepatchte cel een holding potentieel van-60 mV via de versterker. Ook de voltage-gated kalium stromen worden opgeroepen door spannings stappen (250 MS duur elk) van-30 mV tot + 50 mV (10 mV Increment) die de opgenomen cel-40 mV.</li>
	<li>Voor het onderzoeken van de vuren eigenschappen van iPSC-afgeleid craniale en spinale MNs, de cellen van de klem, in stroom-klem wijze, bij een membraan potentieel van-70 mV en gebruik 4 huidige impulsen (1 s duur elk) van stijgende omvang (van + 20 pA aan + 80 pA; 20 pA toename).</li>
	<li>Verwerf voor elke cel voltage-geactiveerde stromen, opgeroepen vuren activiteit en drie passieve eigenschappen als gehele-cel capaciteit (cm), de weerstand van de celmembraan (RM) en rustend membraan potentieel (RMP).</li>
</ol>

<ol><li>Dimos, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Generated+from+Patients+with+ALS+Can+Be+Differentiated+into+Motor+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+NY%29%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons.</a> Science (New York, NY). 321 (5893), 1218(2008).</li>
<li>Ebert, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+from+a+spinal+muscular+atrophy+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient.</a> Nature. 457 (7227), 277-280 (2009).</li>
<li>Lenzi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALS+mutant+FUS+proteins+are+recruited+into+stress+granules+in+induced+Pluripotent+Stem+Cells+%28iPSCs%29+derived+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+models+%26+mechanisms%22%5BJournal%5D)">ALS mutant FUS proteins are recruited into stress granules in induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) derived motoneurons.</a> Disease models & mechanisms. 8 (7), 755-766 (2015).</li>
<li>Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+journal+of+rare+diseases%22%5BJournal%5D)">Amyotrophic lateral sclerosis.</a> Orphanet journal of rare diseases. 4 (3), 1-22 (2009).</li>
<li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frameshift+and+novel+mutations+in+FUS+in+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+ALS%2Fdementia%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Frameshift and novel mutations in FUS in familial amyotrophic lateral sclerosis and ALS/dementia.</a> Neurology. 75 (9), 807-814 (2010).</li>
<li>Boulting, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+characterized+test+set+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells.</a> Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).</li>
<li>Amoroso, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+high-yield+generation+of+limb-innervating+motor+neurons+from+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Accelerated high-yield generation of limb-innervating motor neurons from human stem cells.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (2), 574-586 (2013).</li>
<li>Maury, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+analysis+of+developmental+cues+efficiently+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+multiple+neuronal+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes.</a> Nature biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).</li>
<li>Allodi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+neuronal+vulnerability+identifies+IGF-2+as+a+protective+factor+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Differential neuronal vulnerability identifies IGF-2 as a protective factor in ALS.</a> Scientific reports. 6, 25960(2016).</li>
<li>Kaplan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+matrix+metalloproteinase-9+is+a+determinant+of+selective+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuronal matrix metalloproteinase-9 is a determinant of selective neurodegeneration.</a> Neuron. 81 (2), 333-348 (2014).</li>
<li>Mazzoni, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+binding+of+transcription+factors+to+cell-specific+enhancers+programs+motor+neuron+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity.</a> Nature neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).</li>
<li>De Santis, R., Garone, M. G., Pagani, F., de Turris, V., Di Angelantonio, S., Rosa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+human+pluripotent+stem+cells+into+cranial+motor+neurons+using+a+piggyBac+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of human pluripotent stem cells into cranial motor neurons using a piggyBac vector.</a> Stem Cell Research. 29, 189-196 (2018).</li>
<li>Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperactive+piggyBac+transposase+for+mammalian+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).</li>
<li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neuroscience. 16 (4), 542-553 (2016).</li>
<li>Miller, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-based+modeling+of+late-onset+disease+via+progerin-induced+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging.</a> Cell stem cell. 13 (6), 691-705 (2013).</li>
<li>Lenzi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+control+and+ALS+mutant+human+iPSCs+into+functional+skeletal+muscle+cells%2C+a+tool+for+the+study+of+neuromuscolar+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiation of control and ALS mutant human iPSCs into functional skeletal muscle cells, a tool for the study of neuromuscolar diseases.</a> Stem Cell Research. 17 (1), 140-147 (2016).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Single-Step+Induction+of+Functional+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rapid Single-Step Induction of Functional Neurons from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li>
<li>Theka, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+through+a+single-step+procedure+using+cell+lineage+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of functional dopaminergic neurons from human induced pluripotent stem cells through a single-step procedure using cell lineage transcription factors.</a> Stem cells translational medicine. 2 (6), 473-479 (2013).</li>
<li>Pawlowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+and+Deterministic+Forward+Programming+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+into+Neurons%2C+Skeletal+Myocytes%2C+and+Oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Inducible and Deterministic Forward Programming of Human Pluripotent Stem Cells into Neurons, Skeletal Myocytes, and Oligodendrocytes.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Generation+of+Functional+Subtype+Astrocytes+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Fast Generation of Functional Subtype Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 11 (4), 998-1008 (2018).</li>
<li>Nehme, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+NGN2+Programming+with+Developmental+Patterning+Generates+Human+Excitatory+Neurons+with+NMDAR-Mediated+Synaptic+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Combining NGN2 Programming with Developmental Patterning Generates Human Excitatory Neurons with NMDAR-Mediated Synaptic Transmission.</a> Cell reports. 23 (8), 2509-2523 (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen

Dit protocol maakt het mogelijk om efficiënt te converteren menselijke iPSCs in spinale en craniale motor neuronen dankzij de buitenbaarmoederlijke expressie van Lineage-specifieke transcriptiefactoren. Deze transgenen worden afleidbaar door doxycycline en stabiel geïntegreerd in het genoom dankzij een piggyBac op transposon gebaseerde vector. In een gemengde populatie, zal een of meerdere exemplaren van de piggyBac vector willekeurig worden geïntegreerd in het genoom van de individuele cellen, het verhogen van het risic...

Motor neuron (MN) degeneratie speelt een oorzakelijke rol bij menselijke ziekten, zoals amyotrofische lateraal sclerose (ALS) en spinale spieratrofie (SMA). Het opzetten van geschikte in vitro Cell modelsystemen die de complexiteit van de menselijke MN recapituleren is een belangrijke stap in de richting van de ontwikkeling van nieuwe therapeutische benaderingen. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs), die zijn begiftigd met opmerkelijke plurilineage differentiatie eigenschappen, zijn nu afgeleid van een aantal patiënten die getroffen zijn door motor neuron ziekten1,2. Extra iPSC lijnen die pathogene mutaties in verband met MN ziekten zijn gegenereerd door het bewerken van genen, te beginnen van de controle "gezonde" pluripotente stamcellen3. Deze lijnen vertegenwoordigen nuttige hulpmiddelen voor in vitro Disease modellering en drug screening, op voorwaarde dat passende methoden voor iPSC differentiatie in MNs beschikbaar zijn. De grondgedachte achter de ontwikkeling van deze methode is om de wetenschappelijke gemeenschap geïnteresseerd in MN ziekten met een snelle en efficiënte differentiatie protocol die aanleiding geven tot volwassen functionele MNs te bieden. Het eerste voordeel van deze methode is het tijdsbestek van de uitvoering. Een ander relevant punt van sterkte komt uit de afschaffing van om het even welke reinigingsstap. Ten slotte kan het protocol worden gebruikt om twee verschillende populaties van motorische neuronen te genereren.
De mogelijkheid van het genereren van verschillende subtypen van MNs is bijzonder relevant voor het modelleren van MN ziekten. Niet alle MN subtypen zijn even kwetsbaar in ALS en SMA en het begin van de symptomen in verschillende motor units sterk van invloed op de prognose. In ALS, spinale begin met symptomen die beginnen in de bovenste en onderste ledematen leidt tot de dood in ongeveer 3-5 jaar4. Omgekeerd, bulbaire begin, te beginnen met degeneratie van craniale MNs, heeft een slechtste prognose. Bovendien is het percentage van bulbaire begin significant hoger bij patiënten met mutaties in de RNA-bindende eiwitten FUS en TDP-43 dan bij personen met SOD1 mutaties5. Bijna de totaliteit van alternatieve MN differentiatie protocollen is gebaseerd op de activiteit van retinoic zuur (RA), die een spinale karakter verleent aan differentiëren iPSCs6,7,8. Dit beperkt de mogelijkheid van het bestuderen van intrinsieke factoren, die kunnen worden beschermend in specifieke MN subtypen9,10.
In overeenstemming met een eerdere werk in de muis embryonale stamcellen11, hebben we onlangs aangetoond dat in de menselijke iPSCs buitenbaarmoederlijke expressie van Ngn2, Isl1 en LHX3 (Nil) induceert een spinale MN identiteit, terwijl Ngn2 en Isl1 plus PHOX2A (NIP) specificeren craniale MNs12. We hebben dus ontwikkelde een efficiënt protocol, wat leidt tot de productie van menselijke MNs begiftigd met functionele eigenschappen in een 12 dagen turnaround. Het doel van deze methode is om, in een korte tijd en zonder de noodzaak voor de reiniging (bijv. door FACS), cel populaties zeer verrijkt voor MNs met spinale of craniale identiteit.

<table><tbody><tr><td>5-Bapta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4926-1G</td><td>chemicals voor elektrofysiologische oplossingen</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964-100ML&nbsp;</td><td>Celdissociatiereagens</td></tr><tr><td>anti-CHAT</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td>AB144P</td><td>Anti-Choline Acetyltransferase. Primair antilichaam gebruikt in immunokleuringsonderzoeken. RRID: AB_2079751; Lotnummer: 2971003</td></tr><tr><td>anti-goat Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A11055</td><td>Secundair antilichaam gebruikt voor immonofluorescentieonderzoeken. RRID: AB_2534102; Lotnummer: 1915848</td></tr><tr><td>anti-mouse Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A31571</td><td>Secundair antilichaam gebruikt voor immonofluorescentieonderzoeken. RRID: AB_162542; Lotnummer: 1757130</td></tr><tr><td>anti-Oct4&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>611202</td><td>Primair antilichaam gebruikt in immunokleuringsonderzoeken. RRID: AB_398736; Lotnummer: 5233722</td></tr><tr><td>anti-Phox2b</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-376997</td><td>Primair antilichaam gebruikt in immunokleuringsonderzoeken. Lotnummer: E0117</td></tr><tr><td>anti-rabbit Alexa Fluor 594&nbsp;</td><td>Immunological Sciences</td><td>IS-20152-1</td><td>Secundair antilichaam gebruikt voor immonofluorescentieonderzoeken</td></tr><tr><td>anti-TUJ1&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T2200</td><td>Primair antilichaam gebruikt in immunokleuringsonderzoeken. RRID: AB_262133</td></tr><tr><td>B27</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-566</td><td>Serumvrij supplement voor het onderhouden van neuronale cellen</td></tr><tr><td>Bambanker</td><td>Nippon Genetics</td><td>NGE-BB02</td><td>Celvriesmedium, hier gebruikt voor motorische neuron voorlopers</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>PreproTech</td><td>450-02</td><td>Brain-Derived Neurotrophic Factor</td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>203350</td><td>Nucleosidische antibiotica die eiwitsynthese in prokaryoten en eukaryoten remmen</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td>Bovien Serum Albumine. Blocking agent om niet-specifieke binding van antilichamen in immunokleuringsonderzoeken te voorkomen</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td>chemicals voor elektrofysiologische oplossingen</td></tr><tr><td>Clampex 10 software</td><td>Molecular Devices</td><td>Clampex 10</td><td>Membranstromen opnamesysteem</td></tr><tr><td>Corning Matrigel hESC-qualified Matrix</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Gereconstitueerde basale membraanvoorbereiding uit het Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muissarcoom. Gebruikt voor het hechten van iPSC aan plastic en glazen ondergronden</td></tr><tr><td>CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA</td><td>Biological Industries</td><td>05-710-1E</td><td>Vriesmedium voor humane iPSC's</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5146</td><td>chemicals voor elektrofysiologische oplossingen</td></tr><tr><td>DAPI poeder</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td>4',6-diamidino-2-fenylindole. Fluorescente kleurstof die bindt aan adenine-thymine rijke gebieden in DNA, gebruikt voor kleuring van kernen in immonofluorescentieonderzoeken</td></tr><tr><td>DAPT</td><td>AdipoGen</td><td>AG-CR1-0016-M005</td><td>Gamma secretase inhibitor</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>Reagens voor zachte dissociatie van humane iPSC's</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6421-500ML</td><td>Basismedium voor celkweek</td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-1G&nbsp;</td><td>Gebruikt om expressie van transgenen uit epB-Bsd-TT-NIL en epB-Bsd-TT-NIP vectoren te induceren</td></tr><tr><td>DS2U&nbsp;</td><td>WiCell</td><td>UWWC1-DS2U</td><td>Commerciële menselijke iPSC lijn</td></tr><tr><td>E.Z.N.A Total RNA Kit&nbsp;</td><td>Omega bio-tek</td><td>R6834-02</td><td>Kit voor totale extractie van RNA uit gekweekte eukaryotische cellen</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>PreproTech</td><td>450-10</td><td>Glial-Derived Neurotrophic Factor</td></tr><tr><td>Gibco Episomal hiPSC Line</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A18945</td><td>Commerciële menselijke iPSC lijn</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td>Een alternatief voor L-glutamine met verhoogde stabiliteit. Verbetert celgezondheid.</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>chemicals voor elektrofysiologische oplossingen</td></tr><tr><td>iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1708841</td><td>Kit voor genexpressieanalyse met behulp van real-time qPCR</td></tr><tr><td>iTaqTM Universal SYBR Green Supermix&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5121&nbsp;</td><td>Klaar voor gebruik reactie master mix geoptimaliseerd voor kleurstof-gebaseerde kwantitatieve PCR (qPCR) op elk real-time PCR instrument</td></tr><tr><td>K-Gluconate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td>chemicals voor elektrofysiologische oplossingen</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>chemicals voor elektrofysiologische oplossingen</td></tr><tr><td>L-ascorbinezuur</td><td>LKT Laboratories</td><td>A7210</td><td>Gebruikt in celkweek als antioxidant</td></tr><tr><td>Laminine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11243217001</td><td>Bespoedigt hechting en groei van neurale cellen in vitro</td></tr><tr><td>Laser scanning confocal microscope&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>&nbsp;iX83 FluoView1200</td><td>Confocale microscoop voor het verkrijgen van immunokleuringsbeelden</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>chemicals voor elektrofysiologische oplossingen</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>chemicals voor elektrofysiologische oplossingen</td></tr><tr><td>Mounting Medium&nbsp;</td><td>Ibidi</td><td>50001</td><td>Mounting oplossing gebruikt voor confocale microscopie en immunofluorescenceonderzoeken</td></tr><tr><td>Multiclamp patch-clamp versterker</td><td>Molecular Devices</td><td>700B</td><td>Membranstromen opnamesysteem</td></tr><tr><td>Na-GTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td>chemicals voor elektrofysiologische oplossingen</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71376</td><td>chemicals voor elektrofysiologische oplossingen</td></tr><tr><td>NEA

conversie van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (ipscs) in functionele spinale en craniale motor neuronen met behulp van piggybac vectoren

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We beschrijven hier een methode om functionele spinale en craniale motor neuronen te verkrijgen van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs). Directe omzetting in motor neuron wordt verkregen door een buitenbaarmoederlijke expressie van alternatieve modules van transcriptiefactoren, namelijk Ngn2, Isl1 en Lhx3 (NIL) of Ngn2, Isl1 en Phox2a (NIP). NIHIL en NIP specificeren, respectievelijk, spinale en craniale motor neuron identiteit. Ons protocol begint met de generatie van gemodificeerde iPSC lijnen waarin nihil of NIP stabiel zijn geïntegreerd in het genoom via een piggyBac transposon vector. Expressie van de transgenen wordt vervolgens geïnduceerd door doxycycline en leidt, in 5 dagen, tot de omzetting van iPSCs in MN progenitoren. Latere rijping, voor 7 dagen, leidt tot homogene populaties van spinale of craniale MNs. Onze methode heeft verschillende voordelen ten opzichte van eerdere protocollen: het is zeer snel en vereenvoudigd; het vereist geen virale infectie of verdere MN isolatie; het maakt het genereren van verschillende MN sub-populaties (spinale en craniale) met een opmerkelijke mate van rijping, zoals blijkt uit de mogelijkheid om treinen van actiepotentialen brand. Bovendien kan een groot aantal motor neuronen worden verkregen zonder zuivering van gemengde populaties. iPSC-afgeleide spinale en craniale motor neuronen kunnen worden gebruikt voor in vitro modellering van Amyotrofische laterale sclerose en andere neurodegeneratieve ziekten van de motor neuron. Homogene motor neuron populaties kunnen vertegenwoordigen een belangrijke bron voor cel type specifieke drug screenings.

Een schematische beschrijving van de differentiatie methode wordt weergegeven in Figuur 1. Human iPSCs (WT I lijn3) werden transfected met EpB-BSD-TT-Nil of EpB-BSD-TT-NIP, het genereren, op blasticidin selectie, stabiel en afleidbaar cel lijnen12, hierna aangeduid als iPSC-Nil en iPSC-NIP, respectievelijk. Onderscheidende cellen werden gekenmerkt voor de uitdrukking van de pluripotentie marker OCT4 en de pan-neuronale marker TUJ1. Immunokleuri...

Dit protocol maakt een snelle en efficiënte omzetting van geïnduceerde pluripotente stamcellen in motorische neuronen met een wervelkolom of schedel identiteit, door buitenbaarmoederlijke expressie van transcriptiefactoren van afleidbaar piggyBac vectoren.

Conversie van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) in functionele spinale en craniale motor neuronen met behulp van PiggyBac vectoren

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

De mogelijkheid van het genereren van verschillende subtypes van motorneuronen is vooral relevant voor het modelleren van moderne motorische neuron ziekten zoals amyotrofische laterale sclerose. Deze methode maakt het mogelijk de verwerving van celpopulaties die zeer stijf zijn voor motorische neuronen met een spinale of schedelidentiteit in een kort tijdsbestek en zonder de zuiveringsstap. De generatie van menselijke motorische neuronen uit geïnduceerde pluripotente stamcellen of iPSC onder vereenvoudigde kweekconditie kan het screenen van geneesmiddelen op motorische neuronziekten vergemakkelijken.De inducible expressie van het programmeren van transcriptie factor kan worden gebruikt om een andere cel types zoals neuronale, skeletspier, en gliacellen genereren uit een iPSC repository. Voor NIL en NIP iPSC lijn generatie, spoel de menselijke iPSC cultuur met calcium-en magnesium-vrije PBS voor de behandeling van de cellen met cel dissociatie reagens gedurende vijf tot 10 minuten op 37 graden Celsius. Wanneer de cellen zijn begonnen los te maken van de kweekcontainer, gebruik dan een P1000 pipet om de cellen voorzichtig drie tot vier keer handmatig te scheiden.Breng de cellen naar een buis van 15 milliliter en breng het uiteindelijke volume tot 10 milliliter met verse PBS zonder calcium en magnesium voor het tellen. Verzamel een keer 10 tot de zesde cellen door centrifugatie en resuspend de pellet in 100 microliters van buffer R van de elektroporatie kit. Voeg 4,5 microgram transposable vectorplasma DNA en 0,5 microgram van het piggyBac transposase plasma DNA toe voor transfectie.Transfecteer met het celelektroratiesysteem volgens de instructies van de fabrikant met de aangegeven parameters. Dan, zaad van de cellen in de menselijke iPSC medium aangevuld met 10 micromolar ROCK remmer Y-27632 in een zes millimeter matrix-gecoate schotel. Twee dagen na de transfectie, voeg 5 microgram per milliliter blasticidin aan de cultuur medium houden van de cellen in het antibioticum voor ten minste zeven tot 10 dagen om de cellen die niet hebben geïntegreerd de transgenes tegen te gaan.Aan het einde van de incubatie, handhaven van de stabiel getransfecteerde cellen als een gemengde populatie samengesteld uit cellen met verschillende aantallen transgenes en verschillende integratie sites of isoleren enkele klonen. Bereid een extra schotel om de effectieve expressie van de transgenen op een microgram per milliliter van doxycycline inductie te worden beoordeeld door RT-PCR met transgene-specifieke primers voor neurogenine-2 zoals eerder beschreven. In dit stadium moeten de voorraden van de nieuwe NIL- en NIP-iPSC-lijnen ook worden bevroren in vriesmedium voor menselijke IPSC's.Voor motorische neuron differentiatie, scheiden van de stabiel getransfecteerde celculturen met dissociatie reagens zoals aangetoond dat de cellen worden verzameld in een 15 milliliter buis met vijf volumes DMEM/F12 medium. Na centrifugatie, resuspend de cellen in menselijk iPSC medium aangevuld met micromolar ROCK remmer voor het tellen. Zaad de cellen op matrix-gecoate gerechten op een 6,25 keer 10 de vierde cellen per centimeter kwadraat dichtheid.Voor de komende twee dagen, vervang de supernatants met verse differentiatie medium aangevuld met doxycycline. Op dag twee, verander het medium naar neurobasale B27 medium aangevuld met gamma secretase remmer, vasculaire endotheelgroeifactor receptor remmer, en doxycyline. Op dag vijf, dissociate de cellen zoals aangetoond en resuspend de vrijstaande cellen in vier milliliter van DMEM/ F12 medium voor het tellen.Pipetting is belangrijk voor een volledige dissociatie van de cellen. Vries een aliquot van de motorneuron voorlopers in celvriezen medium volgens de instructies van de fabrikant en het verzamelen van de rest van de cellen door centrifugatie. Resuspend de pellet in neuronale medium aangevuld met 10 micromolar ROCK remmer.Zaad de cellen op polyornithine laminine gecoate microslide ondersteunt met polymeer deksel slips op een keer 10 tot de vijfde cellen per centimeter kwadraat dichtheid. Op dag zes, zorgvuldig vervangen van het medium met verse neuronale medium zonder remmer voor cultuur tot downstream-analyse zonder het losmaken van de cellen van het steunoppervlak. Een uniforme uitdrukking van de pluripotentie marker octamer-bindende transcriptie factor vier of OTC4 kan worden waargenomen in differentiërende celculturen op dag nul in de afwezigheid van pan neuronale marker neuron-specifieke klasse drie beta-tubulin TUJ1 positiviteit.Op dag drie is een sterke daling van het aantal OCT4-positieve cellen duidelijk. Dat wordt weerspiegeld door de expressie van TUJ1 in een subset van differentiërende iPSC's. Op dag vijf wordt geen expressie van OCT4 waargenomen in de populatie die een consistente expressie van TUJ1 en een verworven neuronale morfologie laat zien.Immunostaining analyse zeven dagen na het replating van de motorneuron voorloper cellen onthult een uniforme expressie van TUJ1 en de volwassen motorneuron marker choline acetyltransferase. iPSC NIL-afgeleide neuronen met succes weer te geven spanning-afhankelijke natriumstromen en spanning-afhankelijke kaliumstromen. 80% van de iPSC NIL-afgeleide motorneuronen geklemd in de huidige klem modaliteit zijn in staat om spike treinen trigger wanneer geïnjecteerd met een huidige puls van plus 60 picoamps of meer.De minimale stroom die nodig is om repetitieve vuren in meer dan 50% van de opgenomen cellen uit te lokken is plus 40 picoamps met een piek drempel van ongeveer min 38 millivolt en een gemiddelde afvuren frequentie op plus 40 picoamps van ongeveer acht hertz, wat suggereert dat iPSC NIL-afgeleide spinale motorneuronen vertonen functionele eigenschappen typisch voor volwassen neuronen. Spinale en craniale motorneuronen kunnen worden afgeleid uit gecontroleerde iPSC's of IPSC's die pathologische mutaties dragen en dat deze cellen kunnen worden gebruikt als thesismodellen of voor drugscreening. Onze methode kan worden gebruikt om te helpen begrijpen waarom verschillende motorische neuron eenheden differentieel worden beïnvloed door ALS.

conversion-human-induced-pluripotent-stem-cells-ipscs-into-functional

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een methode om de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) via retrovirus-gemedieerde ectopische expressie van OCT4 genereren, wordt SOX2, KLF4 en MYC beschreven. Een praktische manier om de menselijke IPSC kolonies op basis van GFP expressie te identificeren wordt ook besproken.

Herprogrammeren menselijke somatische cellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) Met behulp van retrovirale vector met GFP

This video demonstrates the procedure to generate motor neurons by transfection of human iPSCs with PiggyBac transposon system by the ectopic expression of lineage-specific transcription factors.

PiggyBac Transposon-Mediated Gene Editing in Human iPSCs: A Procedure to Integrate Gene of Interest in Human iPSCs Using PiggyBac Transposon System

This video showcases the process of differentiating human iPSCs into motor neurons. The rationale involves utilizing iPSCs that have been genetically modified to express specific transcription factors. When cultured in a media containing doxycycline, this antibiotic triggers the expression of transcription factors, thereby promoting iPSC differentiation into motor neuron progenitors. Ultimately, the progenitors are cultured in a neuronal medium to yield mature and functional motor neurons.

Differentiating Engineered Human Induced Pluripotent Stem Cells into Functional Motor Neurons

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen biedt fascinerende perspectieven voor de afleiding van autologe transplantaties. Echter, de progressie door middel van een pluripotente toestand en moeizaam re-differentiatie nog belemmert klinische vertaling. Hier beschrijven we de afleiding van volwassen humane fibroblasten en hun directe omzetting in geïnduceerde neurale progenitor cellen en de daaropvolgende differentiatie tot neuronale lijnen.

Afleiding van volwassen menselijke fibroblasten en hun directe omzetting in Expandable Neural Progenitor Cellen

Dendritische stekels van piramidale neuronen zijn de sites van de meest prikkelende synapsen in de hersenen van zoogdieren cortex. Deze methode beschrijft een 3D-kwantitatieve analyse van de wervelkolom morfologie in menselijke corticale piramidale glutamaat neuronen afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen.

Driedimensionale Kwantificering van Dendritische stekels van Piramidale Neuronen afgeleid van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen

In deze studie genereren we geïnduceerde pluripotente stamcellen uit muis-vruchtwatercellen, met behulp van een niet-viraal transposonsysteem.

De productie van pluripotente stamcellen van Mouse Vruchtwater cellen met behulp van een transposon System

Het protocol presenteert de herprogrammering van perifere bloed mononucleaire cellen voor het opwekken van neurale stamcellen door Sendai virus infectie, differentiatie van iNSCs in Dopaminerge neuronen, transplantatie van de voorlopers van de DA in de eenzijdig-lesioned De ziekte van Parkinson, en de evaluatie van de veiligheid en werkzaamheid van de in de SC afgeleide DA-precursoren voor PD-behandeling.

Generatie van geïnduceerde neurale stamcellen uit perifere mononucleaire cellen en differentiatie naar precursoren voor Dopaminerge neuron voor transplantatie studies

Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor naadloze genbewerking in menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een piggyBac-gebaseerd donorplasmide en de Cas9-nickasemutant. Tweepuntsmutaties werden geïntroduceerd in exon 8 van de hepatocytaire alfafactor 4 alfa (HNF4α) locus in menselijke embryonale stamcellen (hESCs).

Introductie van puntmutaties in menselijke pluripotente stamcellen met behulp van naadloze genoombewerking

Dit artikel beschrijft een protocol voor het genereren van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neuronen in een benchtop 3D-suspensie bioreactor.

Productie van menselijke neurogenine 2-induceerbare neuronen in een driedimensionale suspensie bioreactor

We hebben een protocol voor de inductie van neuroblasts rechtstreeks van pluripotente menselijke embryonale stamcellen gehouden onder bepaalde voorwaarden met kleine moleculen, die afleiding van een groot aanbod van menselijke neurale voorouders en neuronale celtypes in het ontwikkelen van CNS voor neurale reparatie mogelijk maakt.

Efficiënte Afleiding van de Mens Neuronale voorouders en neuronen van pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

Leer de conversie van menselijke iPSCs naar functionele spinale en craniale motor neuronen met behulp van PiggyBac vectoren. Deze methode versnelt drugscreening voor ALS en andere motorneuronenziekten.

Conversie van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) in functionele spinale en craniale motor neuronen met behulp van PiggyBac vectoren (Video) | JoVE Journal

Conversie van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) in functionele spinale en craniale motor neuronen met behulp van PiggyBac vectoren

Meer video's verkennen