In vivo remming van MicroRNA te verminderen tumor groei bij muizen

We voeren de eerste therapie uit, gebaseerd op een microRNA-remmer in een schildklierkankermodel. Deze ontwikkelende therapieën tonen belofte voor de behandeling van deze ziekte. Dit type orthotopisch model, met behulp van een systemische route van de behandeling levering, vergemakkelijkt de validatie van een nieuwe microRNA-gebaseerde geneesmiddelen.

Hoewel we gebruik maken van een orthotopisch model voor het implanteren van menselijke schildklierkankercellen in de muis schildklieren, deze modellen kunnen alle systemische voor andere soorten kanker. Het demonstreren van de procedure met Julia Ramirez-Moya en Adrian Acuna zal Raquel Arocha Riesco. Ze is een technicus van ons instituut.

Na het vaststellen van een CAL-62 menselijke schildklierkankercellijn onvolledig medium, schort een 1 keer 10 tot de 6e cel aliquot in 50 microliters van PBS op 4 graden Celsius, en meng de cellen met een gelijk volume van kelder membraan matrix. Laad de cellen in een 1 milliliter spuit, uitgerust met een 27 gage halve-inch naald, en onderhuids injecteren 100 microliter van het monster in de linkerflank van een 6 weken oude immunodeficient klep C naakt muis. Twee weken na de injectie voegt u de antagomiR- of gecontroleerde behandelingsbufferoplossing toe aan 160 microliters kamertemperatuur in vivo leveringsreagens in een buis van 1 punt 5 milliliter.

En onmiddellijk vortex de oplossing voor 10 seconden om te zorgen voor de complexiteit van het mengsel. Incubeer de behandelingsoplossing gedurende 30 minuten bij 50 graden Celsius, gevolgd door een korte centrifugatie in een microcentrifuge. Verdun vervolgens het sedimented treatment complex verzesvoudigd met verse PBS en grondig mengen.

En injecteer het volledige 200 microliter volume van de behandeling direct in de tumor. Injecteer 50 microliter van een 40 milligram per liter D-Luciferin subcutane oplossing onderhuids 2 keer per week, in elk proefdier. Zorg ervoor dat u een gebrek aan reactie op teen pinch bevestigen na isoflurane anesthesie.

Plaats het dier in de kamer van een in vivo bioluminescentie beeldvormingssysteem en beeld het bioluminescentiesignaal met de in vivo beeldvormingssoftware volgens standaardprotocollen. Analyseer dan de tumorgroei. Het vergelijken van beide behandelingen en het bepalen van de significantie- en groeiverschillen met behulp van een T-test.

Voor orthotopische schildklier tumorcel inenting schorten een aliquot van CAL-62 cellen in 5 microliters van PBS, en onderhuids injecteren 100 microliter van pijnstillende en 100 microliter van antibioticum in een 7 week oude klep C naakt muis. Na bevestiging van een gebrek aan respons op teenknijpen, plaatst u het dier onder een ontledenmicroscoop en desinfecteert u de hals van het dier met iodopovidone. Maak vervolgens een incisie van ongeveer 2 centimeter in de huid en verplaats de speekseleur om de nek bloot te leggen.

Gebruik dissectie-tangen en/of schaar om de bandspieren te ontleden om de luchtpijp en schildklier bloot te leggen en gebruik een spuit van 10 microliter om het volume van 5 microliter van tumorcellen in de juiste schildklierlobule te injecteren, gelegen aan de zijkant van het kraakbeen. Wanneer alle cellen zijn geleverd, herpositioneren van de speekselepister, en gebruik zijde gevlochten, gecoate, niet-absorberende hechtingen om de incisie te sluiten. Breng vervolgens iodopovidone aan op het wondgebied en plaats de muis op een thermische deken met controle tot volledig herstel.

twee tot drie weken na de intrathyroidcelinjectie, bereid de behandelingsoplossing voor zoals aangetoond en lever de oplossing intraveneus door retro-orbitale injectie van de veneuze sinus van het verdoofde schildkliertumordragende dier. In dit representatieve experiment werd de groei van tumoren die intratumoraal worden geïnjecteerd zonder microRNA 146B-remmer aanzienlijk onderdrukt met betrekking tot de negatieve controle. Intratumorale expressie niveaus van sommige proliferatie markers werden ook waargenomen in lage niveaus, in antagomiR behandelde tumoren, in vergelijking met in controle tumoren.

Bovendien kan het herstel van de micro-RNA-doelen worden bestudeerd door de analyse van tumorgeextraheerd RNA of eiwit. Collectief onthullend dat de in vivo remming van individuele micro RNA's effectief is en therapeutisch kan worden benut voor schildklierkankerbehandelingen. Histologische analyse van schildkliertumoren vastgesteld in muizen zoals aangetoond, maakt vlekken voor de epitheliale cellen rond de tumor mogelijk, waardoor de schildklierfollile architectuur van het tumorweefsel wordt onthuld.

Met name de intraveneuze injectie van microRNA 146B-remmer in muizen, met een gevestigde tumor, resulteert in een significante afname van het tumorvolume in vergelijking met met controle behandelde dieren. Verder neemt de expressie van het nieuw beschreven microRNA 146B-doel DICER1 in de primaire tumor toe, neemt toe na een antimicro-RNA 146B-behandeling, waardoor het potentieel van de remming van indogen micro-RNA-expressie en dus het herstel van zijn doelgenen als therapie bij schildklierkanker verder wordt onderstreept. Deze techniek, en de daaropvolgende lipine resultaten, open de mogelijkheid van het verkennen van nieuwe therapieën op basis van niet-genezen RNA's voor de behandeling van schildklierkanker.