Een geautomatiseerde methode voor het uitvoeren van de in-vitro micronucleus assay met behulp van multispectrale beeldvormings stroom Cytometrie

De op beeldstroom gebaseerde micronucleustest kan verschillende beperkingen van methoden overwinnen, zoals geautomatiseerde microscopie en conventionele stroomcytometrie, waaronder lage doorvoer en gebrek aan visuele bevestiging van gebeurtenissen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat alle vereiste gebeurtenissen om genotoxiciteit en cytotoxiciteit te bepalen automatisch kunnen worden afgebeeld, geïdentificeerd en gescoord zonder de noodzaak om microscoopdia's te maken. Voor celblootstelling aan clastogenen en/of aneugens voegt u een millimeter van de chemische stof van belang toe aan zeven tot acht keer 10 tot de vijfde van de experimentele cellen in negen milliliter van het juiste celkweekmedium in een T25-kolf en één milliliter water aan de controleculturen.

Incubeer de kolven op 37 graden Celsius en vijf procent kooldioxide gedurende drie uur voordat de cellen worden overgebracht naar een 15 milliliter polypropyleenbuis per kolf. Verzamel de cellen door centrifugatie en resuspend de pellets in 10 milliliter verse cultuur medium per buis voor zaaien in nieuwe T25 cultuur kolven. Voeg vervolgens 150 microliter van de voorraadconcentratie van cytochalasine B toe aan elke kolf om een uiteindelijke concentratie van drie microgram per milliliter te bereiken.

Breng de kolven terug naar de couveuse voor een hersteltijd van 1,5 tot twee verdubbelingstijden, zoals aanbevolen door de richtlijnen van de Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling. Breng aan het einde van de herstelperiode de culturen over in afzonderlijke 15 milliliter polypropyleenbuizen voor centrifugatie en zet de pellets opnieuw op in vijf milliliter van 75 millimolar kaliumchloride. Meng zachtjes door inversie drie keer en inculbaat van de monsters op vier graden Celsius gedurende zeven minuten.

Voeg aan het einde van de incubatie twee milliliter van vier procent formaline toe aan elk monster en meng voorzichtig met drie inversies. Breng de monsters gedurende 10 minuten terug naar vier graden Celsius voordat u de cellen door centrifugatie verzamelt. resuspend de pellets in 100 microliters van verse vier procent formaline gedurende 20 minuten.

Aan het einde van de incubatie, was de vaste cellen in vijf milliliter wasbuffer per buis door centrifugatie en resuspend de pellets in 100 microliters van wasbuffer per buis. Breng de monsters vervolgens over op afzonderlijke 1,5 milliliter microcentrifugebuizen voor het tellen op een hemocytometer. Voeg vijf microliter van 100 microgram per milliliter Hoechst 33342 per 1,0 x 10 toe aan de zes cellen per milliliter en 10 microliter van 500 microgram per milliliter RNase per 100 microliter monster per buis.

Na een incubatie van 30 minuten bij 37 graden Celsius en vijf procent kooldioxide, centrifugeren de monsters in een microcentrifuge en verwijder alle, maar 30 microliters van supernatant uit elke buis. Dan zorgvuldig resuspend de monsters, oppassen niet te induceren bubble vorming. Als er bellen verschijnen bij resuspensie, veeg dan voorzichtig met de buis om ze te verwijderen.

Om de monsters door multispectrale imaging flow cytometrie uit te voeren, zet je eerst de 405 nanometer laser aan en stel je de laserkracht in op 10 milliwatt. Schakel alle andere lasers, met inbegrip van de zijverstrooiingslaser, uit en stel het brightfield in op kanalen één en negen. Controleer of de schuifregelaar vergroting is ingesteld op 60x, dat de modus met hoge gevoeligheid is geselecteerd en dat alleen kanalen één, zeven en negen worden weergegeven in de afbeeldingsgalerie.

Klik op spreidingsplot en selecteer de hele populatie en het gebied M01 op de X-as. Selecteer de m01 van de beeldverhouding op de Y-as en klik op vierkant gebied om een gebied rond de afzonderlijke cellen te tekenen. Noem deze regio enkele cellen en klik met de rechtermuisknop op het plot om gebieden te selecteren.

Markeer het gebied met één cellen en wijzig de X-coördinaten naar 100 en 900 en de Y-coördinaten naar 0,75 en één. Stel de acquisitieparameters in en geef de bestandsnaam en de doelmap op. Verander vervolgens het aantal gebeurtenissen naar 20.000, selecteer de positieve populatie van DNA en voer het eerste monster uit.

Als u een gegevensbestand wilt openen in IDEAS, klikt u op Analyse starten om de wizard Bestand openen te starten en bladert u naar het gewenste raw-afbeeldingsbestand. Klik vervolgens op Volgende en blader naar een binucleated cel in de afbeeldingsgalerie. Als u een masker wilt maken, klikt u om de afbeelding van interesse te selecteren en opent u het tabblad Analyse.

Klik op Maskers, Nieuw en Functie om LevelSet te selecteren. Selecteer onder Masker de optie M07 en middenniveaumasker en stel de schaal van de contourdetails in op drie. Klik vervolgens twee keer op OK.

Als u binucleated cell-functies wilt herkennen, opent u het tabblad Analyse en selecteert u Onderdelen en Nieuw. Selecteer Ter plaatsetelling voor het functietype. Selecteer bij Masker het laatste verklikbare masker en stel de verbindingskracht in op vier, wijzig de naam in Aantal spotaantal BNC en klik op OK en dicht om de functiewaarden te berekenen.

Klik op histogram en selecteer niet-apoptopic als bovenliggende populatie voor een aantal spottellingen. Selecteer ter waarde van de X-as de optie Aantal xs6 en klik op OK en lineair gebied, teken vervolgens een gebied over Bim Twee en geef dit regiogebied 2N. Als u een micronucleusmasker wilt maken, selecteert u een binucleated cel die een micronucleus bevat in de afbeeldingsgalerie en opent u maskers op het tabblad Analyse.

Als u een spotidentificatiemasker wilt maken, klikt u op Nieuw en functie en selecteert u Spot. Controleer of de knop Bright-radio is geselecteerd en selecteer M07 onder masker. Stel de achtergrondverhouding van de cel en de minimale straal in op twee en stel de maximale straal in op zes.

Klik op OK en OK om het masker aan de lijst aan de linkerkant toe te voegen en klik vervolgens op Nieuw om een ander masker te maken. Klik op spot M07 Channel zeven Bright twee zes twee masker en klik op de pijl-omlaag om het toe te voegen aan het masker definitie en klik op de en niet-operatoren. Klik op de pijl-omlaag om verwijde bereikmasker toe te voegen aan de maskerdefinitie.

Als u een polynucleated populatiemasker wilt maken, klikt u op Analyse, Maskers, Nieuw en Functie. Selecteer Bereik onder Functie. Selecteer onder Masker de optie Watershed Dilate Set M07 Channel07, Middle, three, two en stel de afbeelding in op Kanaal 07.

Stel de minimum- en maximumwaarden voor het areaal in op respectievelijk 135 en 5000 en stel de minimum- en maximale beeldverhoudingswaarden in op respectievelijk 0,4 en één. Klik op OK en wijzig in het naamveld de tekst om het POLY-masker te lezen en klik op OK en Sluiten. Als u een aangepaste weergave wilt maken, klikt u op de knop Eigenschappen van afbeeldingsgalerie, opent u het tabblad Composieten en klikt u op Nieuw.

Voer Kanaal 01 in naar Kanaal 07. Klik op Afbeelding toevoegen en selecteer onder Afbeelding Kanaal 01 en stel het percentage in op 100. Klik nogmaals op Afbeelding toevoegen en selecteer onder afbeelding Kanaal 07 en stel het percentage in op 100.

Klik op het tabblad Weergave, klik op Nieuw en voer onder Naam BNC- en MN-maskers in. Klik vervolgens op Kolom toevoegen en selecteer onder Afbeeldingstype Kanaal 01 en selecteer onder Masker Geen. Klik op Kolom toevoegen en selecteer onder Afbeeldingstype Kanaal 07 en selecteer onder Masker Geen.

Klik op Kolom toevoegen, klik op de knop Samengestelde keuzerondje en klik vervolgens op Ok om de aangepaste weergave te voltooien. Klik op het menu Pulldown weergeven en klik op de weergave Maskers BNC en MN. Klik op de knop Maskers weergeven.

Als u belangrijke gebeurtenissen wilt opsommen, opent u het tabblad Rapporten en klikt u op Statistiekenrapport definiëren en klikt u in het nieuwe venster op Kolommen toevoegen. Als u de statistiek binucleated celtellingen wilt toevoegen, selecteert u onder Statistieken Tellen en selecteert u onder Geselecteerde populatie de BNC-populatie en klikt u vervolgens op Statistieken toevoegen om de statistiek aan de lijst toe te voegen en de sjabloon op te slaan. Zodra alle statistieken aan de lijst zijn toegevoegd, klikt u op Sluiten en klikt u vervolgens op OK en slaat u de sjabloon gegevensanalyse op.

Als u de experimentele bestanden wilt verwerken, klikt u onder het menu Extra op Batchgegevensbestanden en klikt u op Batch toevoegen in het nieuwe venster. Klik op Bestanden toevoegen om de experimentbestanden te selecteren die u aan de batch wilt toevoegen en klik op de knop Map openen onder de optie Een sjabloon of gegevensanalysebestand selecteren. Blader naar de sjabloon die zojuist is opgeslagen en open deze.

Klik op OK om het huidige venster te sluiten. Klik vervolgens op Batches verzenden om de batchverwerking van alle bestanden te starten. Hier worden vier geselecteerde panelen weergegeven voor het identificeren van binucleated cellen.

Deze bivariate plots en histogrammen maken de selectie van binucleated cellen mogelijk, evenals de identificatie van die cellen die twee kernen hebben met vergelijkbare circulariteit, gebieden en intensiteiten en die goed van elkaar gescheiden zijn. Deze Brightfield en Hoechst beelden, evenals de binucleated cel en micronucleus maskers, vergemakkelijken de identificatie en opsomsoming van binucleated cellen en micronuclei. Toepassing van de functie spottelling gebruikt het polynucleated masker om mononucleaire, trinucleaire en quadranucleaire cellen te identificeren.

Het aantal tri- en quadranucleaire cellen kan vervolgens worden samengevat om het uiteindelijke aantal polynucleated cellen te verkrijgen dat nodig is voor de berekening van cytotoxiciteit. Hier worden representatieve genotoxiciteits- en cytotoxiciteitswaarden getoond voor de endogene colchicine, de clastogene mitomycine C en een negatieve controle, mannitol, om de geldigheid van het protocol aan te tonen. Het labelen van de cellen met een passende concentratie van DNA-vlek is van cruciaal belang om een hoge kwaliteit beeldopname te garanderen, waardoor alle belangrijke gebeurtenissen gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd en gescoord.

Deze technieken zijn ook van toepassing op de micronucleus test voor straling biodosimemetrie, die het mogelijk maakt dosis schatting bij personen die kunnen zijn blootgesteld aan straling.