Met en gezichts immunofluorescentie kleuring om vasculaire endotheel cellen direct te observeren

Dit protocol helpt mensen bij het analyseren van endotheelcelmorfologie, en de expressie van moleculen in regio's, onder verschillende vochtschuifstress. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een directe beoordeling van vasculaire endotheelcellen onder verschillende vochtschaar stress biedt. Bij het uitvoeren van deze procedure zijn de belangrijkste stappen het gebruik van vers bereide paraformaldehyde en het uitvoeren van een goede perfusie.

Begin deze procedure met verdovendering van een 12 weken oude C57BL/6 muis, zoals beschreven in het tekstprotocol. Bevestig de juiste verdovendering door zachtjes knijpen de staart. Plak de poten van de muis vast aan een stapel papieren handdoeken, met plakband.

Houd de huid van de muis met tangen omhoog en snijd de huid met een schaar van de buik naar de bovenkant van de thorax. Open de buikholte, onder de ribbenkast, met een scherpe schaar. Til het borstbeen op met tangen en snijd het middenrif door.

Snijd vervolgens de ribbenkast weg om de borstholte bloot te leggen. Snijd de vena cava net boven de lever af met een schaar. Druk doorsneed de arteriële boom gedurende vijf minuten, met voorgekoelde normale zoutoplossing met 40 eenheden per milliliter heparine, door de linker ventrikel, totdat de longen en lever bleek worden.

Vervolgens doornemen met voorgekoelde 4%paraformaldehyde in PBS gedurende vier minuten. Verwijder alle spieren, organen en vet, totdat de aorta is blootgesteld. Plaats de muis onder een ontledenmicroscoop.

Gebruik delicate tangen en een delicate schaar om de aorta duidelijk bloot te leggen onder een ontledenmicroscoop en verwijder het bindweefsel langs de aorta, zo schoon mogelijk. Ontleden de thoracale aorta van het hart naar de celeliakie met een delicate schaar. Plaats de aorta in een zes centimeter cel cultuur schotel, met PBS.

Snijd de aorta langs de lange weg open, eerst langs de mindere curve, en gebruik vervolgens de microscissors om de drie takken van de aortaboog open te snijden, inclusief de innominaat, linker gemeenschappelijke halsslagader, en de linker subclavian slagader langs de grotere curve totdat het rechte segment is voldaan. Permeabiliseren van de aorta met 1%polyoxyethyleen octyl fenyl ether, in PBS gedurende 10 minuten. Blokkeer vervolgens de aorta met 10% normaal geitenserum in tris-gebufferde zoutoplossing met 2,5% polysorbaat 20 gedurende een uur bij kamertemperatuur, in een 12 putcelkweekplaat.

Volgende incubeer de aorta in de blokkerende buffer met vijf gram per milliliter konijn anti-VCAM1, en vijf gram per milliliter rat anti-VE-Cadherin, 's nachts op vier graden Celsius. Na het spoelen van het monster drie keer met wasoplossing, breng de fluorescentie geconjugeerde secundaire antilichamen gedurende een uur bij kamertemperatuur, houden op een donkere plaats. Spoel nog eens drie keer in de wasoplossing.

Verdort de aorta met DAPI gedurende 10 minuten, op een donkere plaats. Spoel vervolgens de bevlekte aorta drie keer in wasoplossing. Plaats de aorta op een afdeksel met het lumenoppervlak naar beneden, en beweeg het langzaam naar antifade montage-oplossing die eerder is gedaald op de cover slip.

Strek de aorta voorzichtig uit om het exemplaar plat te houden. Keer de afdekstrook om en leg deze op de glazen schuif. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen tussen het monster en het glas.

Bestudeer de aorta met een laserscanning confocale microscoop. Analyseer kleurintensiteiten van verschillende kanalen uit de gewenste regio in de en face-afbeeldingen, met Image-Pro Plus-software. En gezicht immunofluorescentie vlekken beelden van vasculaire endotheelcellen uit de muis aorta worden getoond.

En gezicht immunofluorescentie van de vasculaire cel hechting eiwit een, en expressie met VE-Cadherin als een endotheel marker, worden getoond onder verschillende stroompatronen uit verschillende regio's van de muis aorta. DAPI werd ook tegengewerkt om de celkernen voor betere visualisatie te tonen. Wanneer u door de Z-stapels onder de microscoop kijkt, kunnen de endotheel en gladde spiercellen gemakkelijk worden onderscheiden door hun celkernenmorfologie.

De endotheelcelkernen zijn ovaal gevormd en groter dan de spindelvormige, gladde spiercelkernen. Expressie van VCAM-1 was overvloediger in gebieden onder verstoorde stroom, bij mindere kromming van de aortaboog, vergeleken met gebieden onder gestage stroom, bij een grotere kromming van de aortaboog, en bij de thoracale aorta. Hier worden gebieden met een kleinere kromming van een muisaorta aangeduid als d-flow gebieden, en de grotere kromming en thoracale.

Met de juiste modificatie kan deze techniek ook worden toegepast op de analyse van vasculaire doorlaatbaarheid en de positie van macromoleculen in de endotheelcel intima.