Name: Dagelijkse fototherapie met rood licht te reguleren Candida albicans Biofilm groei (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Leer hoe fototherapie met rood licht de groei van Candida albicans-biofilmen reguleert. Dit protocol toont aan dat dagelijkse behandeling de biomassa en kolonievorming significant vermindert.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Dr. Paula da Silveira, Dr. Cecília Atem Gonçalves de Araújo Costa, Shawn M. Maule, Shane M. Maule, Dr. Malvin N. Janal en Dr. Iriana Zanin voor de ontwikkeling van deze studie. We erkennen ook Dr. Alexander D. Johnson (UCSF) voor het doneren van de spanning in dit onderzoek geanalyseerd.

1. bereiding van de voedingsbodems
<ol><li>Sabouraud dextrose agar (SDA) voor te bereiden. Schorten 65 g van SDA aangevuld met chlooramfenicol (50 mg/L) in 1000 mL gedestilleerd water. Kook om volledig los van het medium. Steriliseren in autoclaaf bij 15 PSI (121° C) gedurende 30 minuten afkoelen tot 45-50 ° C. Meng goed en giet in steriele Petri platen 20 mL van de SDA (grootte: 100 x 15 mm).</li>
	<li>Voorbereiding van gist stikstof base (YNB) medium aangevuld met 100 mM glucose door het mengen van 6,7 g YNB en 18 g dextrose tot 1000 mL ultrazuiver water. Meng met behulp van een roerder en steriliseren van het medium gebruik een vacuüm 0,22 µm-filtersysteem.</li>
	<li>RPMI voor te bereiden door het mengen van 10.4 g RPMI 1640 en 34.32 g van 3-(N-morfolino) propanesulfonic zuur (MOPS) tot 1000 mL ultrazuiver water. Meng in een roerder zonder warmte en breng de pH op 7 door toevoeging van 1 N NaOH (toevoegen 2 g NaOH aan 50 mL ultrazuiver water). Steriliseren het medium gebruik een vacuüm 0,22 µm-filtersysteem.</li>
</ol>2. pre entmateriaal en entmateriaal
<ol><li>Verwijder het micro-organisme C. albicans SN425 uit de −80 ° C diepvriezer en laat het ontdooien bij kamertemperatuur. Zaad van 10 µL van de voorraadculturen op petrischalen met SDA aangevuld met chlooramfenicol (50 mg/L). Incubeer de petrischaaltjes aëroob bij 37 ° C gedurende 48 uur.</li>
	<li>Na 48u van incubatie, toevoegen 10 kolonies van C. albicans tot 10 mL van de gist stikstof base (YNB) gemiddeld aangevuld met 100 mM glucose en Incubeer bij 37 ° C voor 16 h voor de pre entmateriaal aëroob.</li>
	<li>Na incubatie voor 16 h, de inoculums bereid door verdunning van de starterculturen in verse YNB medium aangevuld met 100 mM glucose in een 1:10 verhouding (1 mL van de cultuur van de starter verdund in 9 mL YNB). De eerste optische dichtheid (OD) meten bij 540 nm.</li>
	<li>Incubeer de inoculums aëroob bij 37 ° C gedurende 8 uur totdat de stammen de mid log groeifase bereikt en meten van de definitieve OD bij 540 nm. Aftrekken van de uiteindelijke OD van de initiële OD om te controleren of de OD van de inoculums op de mid log groeifase (8 h, gebaseerd op de groeikrommes in Figuur 1).</li>
	<li>Om te bereiken een entmateriaal met 107 cellen mL-1, het entmateriaal voor 5 min bij 5.500 x gcentrifugeren, verwijder het supernatant en concentreren van het entmateriaal tot de helft van het volume van de buizen.</li>
</ol>3. de Biofilm vorming en fototherapie
<ol><li>Voeg 1 mL van het entmateriaal aan de putjes van een 24-well polystyreen plaat. Incubeer bij 37 ° C gedurende 90 minuten dat cel adhesie naar de onderkant van de putten aëroob.</li>
	<li>Gebruik een niet-coherente rood licht (Zie Tabel van materialen) als de lichtbron met een golflengte van 635 ± 10 nm en een vaste uitvoergegevens vermogen van 1.460 mW cm−2.</li>
	<li>Een energiemeter gebruiken voor het meten van de vermogensdichtheid van het licht. De bestralingsdosis toegepast is 87.6 J cm-2, gelijkwaardig aan ongeveer 1 min van blootstelling. Gebruik de formule energie dichtheid (J/cm2) = vermogensdichtheid (W/cm2) x bestraling tijd (s). Een afstand van 5 mm tussen de lichtbron en de biofilm om te voorkomen dat opwarming van de aarde de steekproef toepassing.</li>
	<li>Behandeling van de positieve controle biofilms met 0,12% chloorhexidine voor 1 min en negatieve controle biofilms met 0,89% NaCl voor 1 min.</li>
	<li>Na behandelingen, wassen alle biofilms tweemaal met 0,89% NaCl-oplossing.</li>
	<li>Voeg vervolgens 1 mL van RPMI 1640 gebufferd met 3-(N-morfolino) propanesulfonic zuur (MOPS) met een pH van 7 naar de biofilms en Incubeer de platen bij 37 ° C's nachts.</li>
	<li>In de ochtend, gelden de dezelfde behandelingen zoals stappen 3.2-3.6, wassen de biofilms tweemaal met 0,89% NaCl, toevoegen van nieuwe RPMI gebufferd met MOPS (1 mL, pH 7) de putjes en incubeer aëroob bij 37 ° C.</li>
	<li>Op dezelfde dag, na 6 uur, bloot de biofilms aan het rode licht. Behandeling van de positieve controle biofilms met 0,12% chloorhexidine voor 1 min en negatieve controle biofilms met 0,89% NaCl voor 1 min. Na behandelingen, wassen de biofilms tweemaal met 0,89% NaCl-oplossing.</li>
	<li>Herhaal de stappen 3.2-3,8 tot 48u van biofilm ontwikkeling te bereiken. Opmerking: In principe één behandeling zal gebeuren in de ochtend en andere zal gebeuren in de middag op dezelfde dag (6 h uit elkaar).</li>
</ol>4. verwerking van de
<ol><li>Voeg 1 mL steriele 0,89% NaCl naar de waterput om de biofilm door het krabben van de goed met behulp van een pipet tip. De verwijderde biofilm aan een steriele buis toevoegen.</li>
	<li>Voeg een ander 1 mL steriele 0,89% NaCl naar de waterput. Kras er opnieuw en voeg de schorsing aan de dezelfde buis voor een totaal volume van 2 mL.</li>
	<li>Kolonie-vormende eenheden (kve)<ol>
<li>Krachtig vortex de biofilm schorsing voor 1 min. De schorsing van de biofilm, gebruiken een aliquoot gedeelte van 0,1 mL voor de seriële verdunning.</li>
		<li>Verdun de opschorting van de biofilm van 10-1 tot 10-4 in 0,89% NaCl-oplossing.</li>
		<li>Zaad van 50 μl van elke verdunning op SDA platen en Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 48 uur.</li>
		<li>Tellen van de kolonies en toepassing van de formule CFU/mL = aantal kolonies x 10n / q (n = verdunning; q = geplaatste volume).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Droog gewicht<ol>
<li>Wegen en etiketteren van microcentrifuge buizen.</li>
		<li>Gebruik vanaf de biofilm schorsing, 0,1 mL voor bepaling van het droge gewicht (biomassa).</li>
		<li>1 mL van absolute ethanol toevoegen aan een bekende hoeveelheid van 0,1 mL van de biofilms en opslaan bij-20 ° C gedurende 18 uur. Na 18u, centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Verwijder het supernatant, plaatst u de buizen op een exsiccator tot het drogen van de monsters gedurende één week en wegen de buizen van de microcentrifuge opnieuw.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
In water oplosbare polysacchariden (WSPs) en alkali-oplosbare polysacchariden (ASPs)
	<ol>
<li>Uit de biofilm suspensie, krachtig vortex de rest van het volume (1.8 mL) voor 1 min en centrifugeer bij 5.500 × g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Bewaar het supernatant in een nieuwe buis en was het neerslag tweemaal met de cellen die de onoplosbare bestanddelen van de extracellulaire matrix met steriele ultrazuiver water (5.500 × g, 10 min bij 4 ° C) bevatten.</li>
		<li>Resuspendeer de onoplosbare inhoud op 1.8 mL steriele ultrazuiver water.</li>
		<li>In water oplosbare polysacchariden (WSPs) Opmerking: Voer dit experiment in een zuurkast.<ol>
<li>Reserveren van het opgeslagen supernatant, 1 mL voor de kwantificering van de in water oplosbare polysacchariden (WSPs).</li>
			<li>Meng het opgeslagen supernatant voor 1 min. Vervolgens overbrengen in steriele buizen en toevoegen van 2,5 volumes van 95% ethanol. Bewaar de buizen voor 18u bij-20 ° C voor WSPs neerslag.</li>
			<li>Na 18u, centrifugeer de buizen bij 9.500 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. Na het centrifugeren, gooi het supernatant.</li>
			<li>De monsters driemaal met 75% ethanol wassen en drogen van de pellets. Resuspendeer de pellet met 1 mL steriele ultrazuiver water en kwantificeren van de WSP fenol-zwavelzuur zuur methode.</li>
			<li>0,1% glucose (0,01 g glucose tot 10 mL ultrazuiver water) gebruiken voor de standaard curve (0, 2.5, 5, 10, 15, 20 en 25 µL van glucose per buis).</li>
			<li>200 µL van 5% fenol (2,7 mL van 90% fenol 47.3 ml ultrazuiver water) toevoegen aan een glazen buis, bestaande uit 200 µL van het monster of standaard curve wijs (in drievoud per monster) en meng voorzichtig.</li>
			<li>Voeg 1 mL zwavelzuur aan de buis en meng. Wacht 20 min voor de reactie en de monsters met behulp van een spectrofotometer meten (490 nm).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Alkali-oplosbare polysacchariden (ASPs) Opmerking: Voer dit experiment in een zuurkast.<ol>
<li>Scheiden van het onoplosbare opnieuw opgeschorte bedrag, 1 mL voor de bepaling van ASPs. Centrifugeer het aliquots van elke opschorting van de biofilm (13.000 x ggedurende 10 minuten bij 4 ° C).</li>
			<li>Verwijder voorzichtig het supernatant van elke buis. Leg vervolgens de monsters op een vacuüm concentrator te drogen van de pellets.</li>
			<li>Weeg de pellets en voeg 300 µL van 1 N NaOH (2 g NaOH aan 50 mL ultrazuiver water) per 1 mg van het droge gewicht. Incubeer hen gedurende 2 uur bij 37 ° C en vervolgens Centrifugeer bij 13.000 × g gedurende 10 minuten.</li>
			<li>Microcentrifuge buizen, behoud van de pellet voorzichtig het supernatant met een pipet en overdracht verzamelen.</li>
			<li>Nogmaals, een gelijk volume 1 N NaOH toevoegen aan de buizen bestaande uit de pellets, en herhaal de zelfde stappen zoals hierboven voor de winning van ASP.</li>
			<li>Na incubatie gedurende 2 uur, centrifugeren van de monsters (13.000 x g gedurende 10 minuten), zorgvuldig verzamelen het supernatant en toevoegen aan de eerder verzamelde supernatant.</li>
			<li>Voor de derde extractie, herhaal de zelfde stappen zoals hierboven, maar dit keer, doen niet de monsters gedurende 2 uur voordat het centrifugeren uit te broeden.</li>
			<li>Daarna drie delen ethanol 95% aan elk monster toevoegen. Vervolgens voorraad de monsters op −20 ° C gedurende 18 uur bij precipitatie van ASP.</li>
			<li>Centrifugeer de buizen (9.500 × g gedurende 20 minuten bij 4 ° C) en gooi het supernatant.</li>
			<li>Elke pellet driemaal met 75% ethanol wassen en drogen (dezelfde procedures deed voor WSP). Resuspendeer de pellets in gelijke totaalvolume van de eerste extractie met 1 N NaOH.</li>
			<li>Lees de monsters voor de kwantificering van ASP met behulp van de fenol-zwavelzuur (dezelfde als voor de WSP analyse).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+species%3A+current+epidemiology%2C+pathogenicity%2C+biofilm+formation%2C+natural+antifungal+products+and+new+therapeutic+options%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options.</a> Journal of Medical Microbiology. 62 (Pt 1), 10-24 (2013).</li>
<li>Harriott, M. M., Noverr, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+and+Staphylococcus+aureus+form+polymicrobial+biofilms%3A+effects+on+antimicrobial+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Candida albicans and Staphylococcus aureus form polymicrobial biofilms: effects on antimicrobial resistance.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3914-3922 (2009).</li>
<li>Srinivasan, A., Lopez-Ribot, J. L., Ramasubramanian, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+antifungal+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today+Technologies%22%5BJournal%5D)">Overcoming antifungal resistance.</a> Drug Discovery Today Technologies. 11, 65-71 (2014).</li>
<li>Finkel, J. S., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+Candida+albicans+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genetic control of Candida albicans biofilm development.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (2), 109-118 (2011).</li>
<li>Zarnowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+entries+in+a+fungal+biofilm+matrix+encyclopedia%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Novel entries in a fungal biofilm matrix encyclopedia.</a> MBio. 5, e013333 (2014).</li>
<li>Mitchell, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+participation+in+biofilm+matrix+assembly+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Community participation in biofilm matrix assembly and function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4092-4097 (2015).</li>
<li>Mitchell, K. F., Zarnowski, R., Andes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+super+glue%3A+the+biofilm+matrix+and+its+composition%2C+assembly%2C+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Fungal super glue: the biofilm matrix and its composition, assembly, and functions.</a> PLoS Pathogens. 12, e1005828(2016).</li>
<li>Dai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+light+rescues+mice+from+potentially+fatal+Pseudomonas+aeruginosa+burn+infection%3A+efficacy%2C+safety%2C+and+mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Blue light rescues mice from potentially fatal Pseudomonas aeruginosa burn infection: efficacy, safety, and mechanism of action.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (3), 1238-1245 (2013).</li>
<li>de Sousa, D. L., Lima, R. A., Zanin, I. C., Klein, M. I., Janal, M. N., Duarte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+twice-daily+blue+light+treatment+on+matrix-rich+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effect of twice-daily blue light treatment on matrix-rich biofilm development.</a> PLoS One. 10 (7), e0131941(2015).</li>
<li>Fontana, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibacterial+effect+of+photodynamic+therapy+in+dental+plaque-derived+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Periodontal+Research%22%5BJournal%5D)">The antibacterial effect of photodynamic therapy in dental plaque-derived biofilms.</a> Journal of Periodontal Research. 44 (6), 751-759 (2009).</li>
<li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+survival+mechanisms+of+clinically+relevant+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).</li>
<li>Panariello, B. H. D., Klein, M. I., Pavarina, A. C., Duarte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+genes+TEC1+and+EFG1+in+Candida+albicans+influences+extracellular+matrix+composition+and+biofilm+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Inactivation of genes TEC1 and EFG1 in Candida albicans influences extracellular matrix composition and biofilm morphology.</a> Journal of Oral Microbiology. 9 (1), 1385372(2017).</li>
<li>Gulati, M., Lohse, M. B., Ennis, C. L., Gonzalez, R. E., Perry, A. M., Bapat, P., Valle Arevalo, A., Rodriguez, D. L., L, D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+culturing+and+screening+of+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms.</a> Current Protocols in Microbiology. 50 (1), e60(2018).</li>
<li>Roberts, A. E., Kragh, K. N., Bjarnsholt, T., Diggle, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+limitations+of+in+vitro+experimentation+in+understanding+biofilms+and+chronic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The limitations of in vitro experimentation in understanding biofilms and chronic infection.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3646-3661 (2015).</li>
<li>Kucharíková, S., Tournu, H., Lagrou, K., Van Dijck, P., Bujdáková, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+comparison+of+Candida+albicans+and+Candida+glabrata+biofilms+under+different+conditions+and+their+susceptibility+to+caspofungin+and+anidulafungin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Detailed comparison of Candida albicans and Candida glabrata biofilms under different conditions and their susceptibility to caspofungin and anidulafungin.</a> Journal of Medical Microbiology. 60 (Pt 9), 1261-1269 (2011).</li>
<li>Weerasekera, M. M., Wijesinghe, G. K., Jayarathna, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+media+profoundly+affect+Candida+albicans+and+Candida+tropicalis+growth%2C+adhesion+and+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mem%C3%B3rias++Do++Instituto+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">Culture media profoundly affect Candida albicans and Candida tropicalis growth, adhesion and biofilm development.</a> Memórias Do Instituto Oswaldo Cruz. 111 (11), 697-702 (2016).</li>
<li>Kadosh, D., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+Candida+albicans+filamentous+growth+program+by+relief+of+transcriptional+repression%3A+a+genome-wide+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Induction of the Candida albicans filamentous growth program by relief of transcriptional repression: a genome-wide analysis.</a> Molecular biology of the cell. 16 (6), 2903-2912 (2005).</li>
<li>Paschoal, M. A., Lin, M., Santos-Pinto, L., Duarte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+antimicrobial+chemotherapy+on+Streptococcus+mutans+using+curcumin+and+toluidine+blue+activated+by+a+novel+LED+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Photodynamic antimicrobial chemotherapy on Streptococcus mutans using curcumin and toluidine blue activated by a novel LED device.</a> Lasers in Medical Science. 30 (2), 885-890 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De meest kritische stappen voor het succesvol kweken van C. albicans biofilm zijn: 1) om te doen de pre entmateriaal en het entmateriaal in YNB medium aangevuld met 100 mM glucose; 2) te wachten 90 min op de fase van de hechting en zorgvuldig was tweemaal de putjes met 0,89% NaCl voor het verwijderen van niet-naleving cellen; en 3) toe te voegen RPMI medium aan de zelfklevend cellen om te beginnen de vorming van de biofilm, aangezien RPMI schimmeldraden groei zal stimuleren. Aneuploidies kan optreden wanneer kwe...

De toename van diabetes, immunosuppressieve therapie toepassingen, HIV, AIDS-epidemie, invasieve klinische procedures en breedspectrum antibiotica verbruik in de afgelopen jaren gestegen de incidentie van Candida albicans gerelateerde ziekten1,2. C. albicans infecties zijn meestal gerelateerd aan biofilm ontwikkeling en Klinische manifestaties, zoals candidiasis of systemische weerslag, zoals candidemia1,2kunnen veroorzaken. Een van de opmerkelijkste virulentiefactoren van biofilm groei is de polysacharide extracellulaire matrix vestiging. Biofilm vorming samenwerkt om te verhogen van de weerstand tegen bestaande antifungale geneesmiddelen, milieudruk en host immuun mechanismen3.
De groei van de biofilm van C. albicans begint met de vroege hechting van planktonische cellen op een substraat, gevolgd door de verspreiding van gistcellen door middel van het oppervlak van het substraat, en hyphal groei. De laatste fase van de groei van de biofilm is de maturatie fase, waarin gist-achtige ontwikkeling wordt onderdrukt, de hyphal ontwikkeling breidt en de extracellulaire matrix omsluit de biofilm4. C. albicans exopolysaccharides (EPS) in de matrix samen vormen de mannan-glucaan complexe5,6. De interactie van exopolysaccharides is van cruciaal belang voor de verdediging van de biofilms tegen drugs7. Vandaar, de vermindering van EPS uit de extracellulaire matrix van C. albicans kan ondersteunen de ontwikkeling van nieuwe antibiofilm protocollen voor orale candidiasis controle
Licht regelt de groei, de ontwikkeling en het gedrag van verschillende organismen8 en deze is vereffend als een antimicrobiële in Fotodynamische antimicrobiële chemotherapie (PACT). PACT is een zichtbaar licht van een specifieke golflengte en een licht absorberende fotosensitizer9van toepassing. De photosensitizers hebben echter problemen in de biofilm, doordringende veroorzaakt lagere werkzaamheid10. Het falen van therapeutische agenten om te infiltreren volledig biofilms is een reden dat biofilms, af en toe van zich verzetten tegen traditionele antimicrobiële therapie3,5. Deactiveren van de bijgevoegde Microbiële cellen, moeten antimicrobiële stoffen doordringen via de extracellulaire matrix; Toch is het EPS kenmerkt een diffusional obstakel voor dergelijke moleculen door te vragen hun niveau van vervoer in de biofilm of door het beïnvloeden van de reactie van de antimicrobiële met de matrix zelf11.
Gezien de nadelen van het PACT, het gebruik van licht vanzelf naar voren komt als een waardevolle verbetering. Voorlopige gegevens bleek dat de behandeling met blauw licht twee keer per dag de productie van EPS-onoplosbaar in Streptococcus mutans biofilm aanzienlijk geremd. Door de daling van de EPS-onoplosbaar, blauw licht verminderd biofilm groei. De resultaten van fototherapie rood licht met C. albicans biofilms zijn echter schaars. Vandaar, is het doel van dit onderzoek was om te evalueren in welke wijze fototherapie met behulp van rood licht de groei en de rangschikking van C. albicans biofilm beïnvloedt. Voor de behandeling tweemaal daags, aangepast we onze laboratory's eerdere protocollen9,12 te bieden een gemakkelijk en reproduceerbaar biofilm model dat antwoorden met betrekking tot de levensvatbaarheid levert, droog gewicht en extracellulaire polysacchariden bedragen na rood licht behandeling. Hetzelfde protocol kan worden gebruikt voor het testen van andere therapieën.

<table><tbody><tr><td>Clorhexidine 20%&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9394</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose (D-Glucose) Anhydrous</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof</td><td>Decon Laboratories</td><td>DSP-MD.43</td><td></td></tr><tr><td>LumaCare LC-122 A&nbsp;</td><td>LumaCare Medical Group, Newport Beach, CA, USA&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Fisher Chemical</td><td>S641-500</td><td></td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>Fisher Bioreagents&nbsp;</td><td>BP 359-500</td><td></td></tr><tr><td>Phenol 5%</td><td>Milipore Sigma</td><td>843984</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 buffered with 3-(N-morpholino)</td><td>Sigma</td><td>R7755</td><td></td></tr><tr><td>Sabouraud dextrose agar supplemented with chloramphenicol</td><td>Acumedia</td><td>7306A</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuric acid&nbsp;</td><td>Fisher Chemical</td><td>SA200-1</td><td></td></tr><tr><td>Yeast nitrogen base&nbsp;</td><td>Difco</td><td>DF0392-15-9</td><td></td></tr><tr><td>3-(N-morpholino)propanesulfonic acid MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;24-well polystyrene plate&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>353935</td><td></td></tr></tbody></table>

dagelijkse fototherapie met rood licht te reguleren candida albicans biofilm groei

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Hier presenteren we een protocol voor de beoordeling van de resultaten van per dag rood licht behandeling op de groei van Candida albicans biofilm. Het vergroten van de planktonische groei van C. albicans SN425, groeide de inoculums op gist stikstof Base media. Voor de vorming van de biofilm, waren RPMI 1640 media, die hoge concentraties van aminozuren hebben toegepast om te helpen biofilm groei. Biofilms 48 uur twee keer per dag gedurende 1 min werden behandeld met een niet-coherente lichtapparatuur (rood licht; golflengte = 635 nm; energiedichtheid = 87.6 J·cm-2). Zoals een positieve controle (PC), 0,12% chloorhexidine (CHX) werd toegepast, en als een negatieve controle (NC), 0,89% NaCl werd toegepast op de biofilms. Kolonievormende eenheden (kve), droog gewicht, oplosbare en onoplosbare exopolysaccharides na behandelingen werden gekwantificeerd. Kort, het protocol hier gepresenteerd is eenvoudig, reproduceerbare en biedt antwoorden met betrekking tot de levensvatbaarheid, droog gewicht en extracellulaire polysaccharide bedragen na rood licht behandeling.

Figuur 2 weergegeven de uitkomsten van Log10 CFU/mL C. albicans na per diem behandelingen met rood licht voor 1 min. Roodlicht aanzienlijk verminderd de Log10 CFU/mL vergeleken met de NC (p = 0.004). Figuur 3 geeft de resultaten van de biomassa (mg) van C. albicans biofilms na dagelijkse behandelingen. Alle behandelde groepen bleek van vermindering van de biomassa ten opzichte van de NC (p ...

Hier presenteren we een protocol voor de beoordeling van de resultaten van de toepassing van het rood licht op de groei van Candida albicans biofilm. Een niet-coherente rood licht apparaat met de golflengte van 635 nm en dichtheid van de energie van 87.6 J·cm-2 werd toegepast in de groei van Candida albicans biofilms gedurende 48 uur.

Dagelijkse fototherapie met rood licht te reguleren Candida albicans Biofilm groei

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

Candida is de meest voorkomende oorzaak van verspreide schimmelinfectie in immuungecompromitteerde gastheren. Het falen van therapeutische middelen om biofilm volledig te infiltreren vanwege de matrix is een van de redenen waarom biofilms zich verzetten tegen traditionele therapieën. Ons protocol evalueert hoe fototherapie, met rood licht, interfereert met de groei en de opstelling van Candida albicans biofilms.De toegepaste methoden zijn goed ingeburgerd, omdat de stam die in deze studie werd gebruikt zijn extracellulaire matrix had gekenmerkt en het lichtapparaat met succes is toegepast op andere planktonische micro-organismen suspensies en biofilms. Het grootste voordeel van dit apparaat is de vermindering van de behandelingstijd, waardoor het beter zichtbaar is voor klinische toepassingen. Bij het kweken candida albicans zich ervan bewust dat antilichamen kunnen worden verworven.Daarom is het belangrijk om geen kolonies te gebruiken die meer dan zeven dagen oud zijn, om geen platen te starten bij vier graden Celsius en cellen niet opnieuw te strepen van bestaande platen. Evenzo moet een stam worden gebruikt voorafgaand aan 18 uur van de nachtelijke groei. Bij het gebruik van een spectrofotometer voor de eerste keer is het belangrijk om eerst kolonie boerderij te verkrijgen in eenheden telt, om te correleren met optische dichtheid waarden.Daarom zullen experimenten beginnen met het gebruik van het midden van de groeifase in de initiële celconcentratie van 10 tot zeven cellen per milliliter. Deze celconcentratie is aangetoond dat de meest afhankelijke en stabiele materie biofilms. Om te beginnen, schorsen 65 gram SDA, aangevuld met 50 milligram per liter Chloramphenicol, in 1, 000 milliliter gedestilleerd water in een beker.Plaats het bekerglas op een kachel aan de kook om het medium volledig op te lossen. Breng de media vervolgens over naar een glazen fles. Plaats de dop op de fles, maar schroef het niet helemaal naar beneden om ervoor te zorgen dat de fles kan ventileren.Plaats de fles in een autoclave om de oplossing te steriliseren op 15 PSI en 121 graden Celsius gedurende 30 minuten. Koel de oplossing af tot ongeveer 45 graden Celsius. Gebruik een wegwerp, steriele pipet, om goed te mengen, en pipet 20 milliliter SDA in steriele Petri platen.Om ynb medium te bereiden, aangevuld met 100 millimolar glucose, meng 6,7 gram YNB en 18 gram dextrose tot 1,000 milliliter ultra zuiver water in een beker. Doe een roerstaaf in het bekerglas en leg de beker op een roerplaat om te mengen. Filter het medium door een vacuümfiltersysteem van 0,22 micrometer om te steriliseren.Bereid RPMI-medium door 10,4 gram RPMI-1640 en 34 gram MOPS te mengen tot 1.000 milliliter ultra zuiver water. Meng in een roerder zonder warmte en stel de PH aan op zeven door een normale natriumhydroxide toe te voegen. Steriliseren van het medium met behulp van een 0,22 micrometer vacuümfiltersysteem.Ontdooi eerst het micro-organisme Candida albicans SN 425 bij omgevingstemperatuur. Zaad 10 microliters van de stopcultuur op eerder bereide petrischaaltjes met SDA, aangevuld met Chlooramfenicol. Incubeer de petrischaaltjes aërobe op 37 graden Celsius gedurende 48 uur.Voor het pre-entcuum gebruik maken van een gesteriliseerde glijmiddel om 10 kolonies Candida albicans te plukken uit de Petri gerechten en plaats ze in een centrifuge buis met 10 milliliter van YNB medium, aangevuld met glucose. Broed de buis aërobe op 37 graden Celsius gedurende 16 uur. Bereid vervolgens de enenculums door deze startercultuur toe te voegen aan vers YNB-medium, aangevuld met glucose, in een één tot 10 verhouding voor verdunning.Gebruik de spectrofotometer om de initiële OD op 540 nanometer te meten. Incubeer de entculums aërobe op 37 graden Celsius gedurende acht uur, en meet de uiteindelijke OD op 540 nanometer. Trek de laatste OD af van de eerste OD om te controleren of de OD van de entculums zich op de mid-log groeifase bevindt.Om een entmateriaal met 10 tot de zeven cellen per milliliter te verkrijgen, centrifuge het entmateriaal gedurende vijf minuten bij 5, 500 keer G.Giet het supernatant in een beker met natriumhypochloriet en voeg verse YNB toe om het entmateriaal te concentreren tot de helft van het vorige volume. Voeg een milliliter van het entmateriaal toe aan elke put van een 24 put polystyreenplaat. Incubaal aërobe bij 37 graden Celsius gedurende 90 minuten om celhechting aan de onderkant van de putten mogelijk te maken.Behandel de biofilms gedurende één minuut met één milliliter van 0,12%chlorhexidine voor de positieve controlebiofilms. Voor de negatieve controle, behandel de biofilms gedurende een minuut met een milliliter steriel, 0,89% natriumchloride. Vervolgens was de putten twee keer, elk één minuut, met één milliliter steriele 0,89% natriumchloride om niet-aanhangende cellen te verwijderen.Zet vervolgens een niet-coherent rood licht aan en gebruik een vermogensmeter om de vermogensdichtheid van het licht te meten. Bepaal de belichtingstijd op basis van de energiedichtheidseis van 87,6 joules per vierkante centimeter. Plaats de plaat onder het rode licht.Houd de afstand tussen de lichtbron en de biofilm op vijf milliliter om te voorkomen dat het monster wordt opwarmd. Na blootstelling gedurende een minuut, voeg een milliliter van de gesteriliseerde RPMI medium aan elke put, en incubeer de platen op 37 graden Celsius 's nachts. Herhaal 's ochtends dezelfde was-, lichte behandeling, positieve en negatieve controlebehandelingen en incubatie gedurende zes uur met RPMI-medium.Nogmaals, was de biofilms twee keer, bloot stellen aan rood licht, en het uitvoeren van positieve en negatieve controle behandelingen. Aspirate de oplossing in de putten en voeg RPMI medium. Herhaal de incubatie, wassen, lichte behandeling, en positieve en negatieve controle behandelingen, tot het bereiken van 48 uur van biofilm ontwikkeling.Om te beginnen met de verwerking, gooi het medium en voeg een milliliter steriele, 0,89% natriumchloride aan de put, en gebruik een pipet tip om de biofilm krassen uit de put. Breng de verwijderde biofilm over naar een steriele buis. Voeg nog een milliliter steriele, 0,89% natriumchloride toe aan de put.Kras het opnieuw en voeg de ophanging toe aan dezelfde buis, voor een totaal volume van 2 milliliter. Krachtig vortex de biofilm suspensie voor een minuut. Voor CFU-analyse moet u een aliquot van 0,1 milliliter van de biofilmsuspensie overbrengen naar een microcentrifugebuis met 900 microliter van 0,89% natriumchlorideoplossing voor elke verdunning.Verdun de biofilmoplossing van 10 tot de negatieve, tot 10 tot de negatieve vier, in zoutoplossing. Zaad 50 microliter van elke verdunning tot SDA-platen en broed de platen gedurende 48 uur uit op 37 graden Celsius. Tel de kolonies en pas de formule toe.Voor droge gewichtsanalyse, eerst wegen en label micro centrifuge buizen. Voeg 0,1 milliliter van de biofilm suspensie en een milliliter absolute ethanol toe aan de buizen en bewaar ze gedurende 18 uur op negatieve 20 graden Celsius. Dan, centrifuge het 10.000 keer G gedurende 10 minuten.Gooi de supernatant en plaats de buizen in een desiccator om de monsters te drogen voor een week. Weeg de microcentrifugebuizen opnieuw af en doe de aftrekking om het biomassagewicht te verkrijgen. In dit experiment, na per diem behandelingen met rood licht voor een minuut naar Candida albicans biofilms, de CFU werd verminderd, in vergelijking met de negatieve controle behandeld met natriumchloride.De resultaten van de biomassa van Candida albicans biofilms na dagelijkse behandelingen, tonen de rood licht behandelde groep gepresenteerd soortgelijke vermindering van biomassa aan die waargenomen in de positieve controlegroep, behandeld met chloorhexidine. De twee groepen vertoonden ook statistische gelijkenis met elkaar. Terwijl ze beide een vermindering van de biomassa vertoonden, vergeleken met de negatieve controle behandeld met natriumchloride.Inferieure hoeveelheden Candida albicans oplosbare en onoplosbare EPS, werd waargenomen in positieve controle, in vergelijking met negatieve controle. Hoewel niet statistisch significant, per diem toepassing van rood licht numeriek verminderde de hoeveelheden EPS oplosbaar en EPS onoplosbaar. De negatieve controle en de rode licht behandelde groep, toonde statistische gelijkenis.Het meten van de vermogensdichtheid van het licht, met behulp van een vermogensmeter voordat u met de behandeling begint om de exacte toedieningsperioden te bepalen. De stappen zorgen ervoor dat de energiedichtheid altijd 87,6 joules per vierkante centimeter zal zijn. Gebruik de eerder aangehaalde formule.De meting wordt gemaakt met behulp van hetzelfde van het licht naar de fles van de platen, vijf millimeter. Een verband tussen fototherapie en schimmeldodende geneesmiddelen kan worden bestudeerd om te controleren of de voorbehandeling met rood licht, gevolgd door toepassing van geneesmiddelen, de penetratie van geneesmiddelen in de biofilm verbetert. Voor de tweemaal dagelijkse behandeling hebben we de protocollen van ons laboratorium aangepast, met een eenvoudig en reproduceerbaar biofilmmodel, dat antwoorden geeft met betrekking tot levensvatbaarheid, droog gewicht en extracellulaire polysaccharidehoeveelheden na een roodlichtbehandeling.Het protocol is generiek en kan worden gebruikt voor het testen van andere therapieën, naast rood licht, met inbegrip van drugs, andere lichten, of de combinatie van licht en drugs. Werken met micro-organismen vereist speciale apparatuur, zoals veiligheidsbril, knoop lab jas, en nitro handschoenen.

daily-phototherapy-with-red-light-to-regulate-candida-albicans

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We hebben een hoge dichtheid microarray platform bestaande uit 3D nano-biofilms...

Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) voor high-throughput antimycoticum Screening

Source: Zhao, K., et al. An In Vitro Model to Study the Effect of 5-Aminolevulinic Acid-mediated Photodynamic Therapy on Staphylococcus aureus Biofilm. J. Vis. Exp. (2018)The video demonstrates a photodynamic therapy protocol to assess antibacterial effects on Gram-positive bacterial biofilms. Biofilms are divided into four groups: two receive a photosensitizer precursor, and two receive a buffer. All are incubated in the dark, followed by red light exposure to one precursor-treated group and...

Light-Activated Treatment of Bacterial Biofilms Using a Photosensitizer Precursor

Om de interne kenmerken van Candida albicans biofilms te bekijken en te kwantificeren, bereiden we vaste intacte exemplaren voor die worden verduidelijkt door refractieve indexmatching. Vervolgens kan optische sectioning microscopie worden gebruikt om driedimensionale beeldgegevens te verkrijgen, hoewel de volledige dikte van de biofilm.

Verduidelijken en beeldvorming Candida albicans Biofilms

De groeiende incidentie van resistente Candida albicans is wereldwijd een ernstig gezondheidsprobleem. Antimicrobiële fotodynamische therapie (aPDT) kan een strategie bieden om resistente schimmelinfecties te bestrijden. Het huidige protocol beschrijft rose bengal-gemedieerde aPDT werkzaamheid op een multiresistente C. albicans stam in vitro.

Rose Bengal-Gemedieerde fotodynamische therapie om Candida albicans te remmen

Een 96-well microtiter plaat-gebaseerd protocol met behulp van een 2,3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfofenyl)-5-carboxanilide-2H-tetrazolium (XTT) reductietest wordt hierin beschreven, om de effecten van antilichamen op biofilms gevormd door C. tropicalis te bestuderen. Dit in vitro protocol kan worden gebruikt om het effect van potentiële nieuwe antischimmelverbindingen op de metabole activiteit van Candida-soortencellen in biofilms te controleren.

Een oplosbare tetrazolium-gebaseerde reductietest om het effect van antilichamen op Candida tropicalis biofilms te evalueren

Dit protocol beschrijft de toepassing van antimicrobiële fotodynamische therapie (aPDT) in een muizenmodel van orale candidiasis. aPDT werd uitgevoerd met behulp van een in water oplosbaar mengsel van curcuminoïden en blauw LED-licht.

Curcuminoïde-gemedieerde antimicrobiële fotodynamische therapie op een muizenmodel van orale candidiasis

De betekenis van kleine kolonies in resistentie tegen geneesmiddelen tegen Candida spp. is nog niet volledig onderzocht. Antimicrobiële fotodynamische therapie (aPDT) biedt een veelbelovende strategie tegen resistente schimmelinfecties. Deze studie toont aan dat roos bengaal-gemedieerde aPDT Candida glabrata effectief deactiveert en kleine kolonies induceert, wat een unieke procedure oplevert.

Inductie van kleine kolonies in Candida glabraat via Bengaalse rozengemedieerde fotodynamische therapie

Een 405 nm blauwlicht LED-apparaat toont antimicrobiële effectiviteit tegen een breed scala aan wondpathogenen wanneer het wordt geëvalueerd op een collageengebaseerd synthetisch huidmodel. Deze vereenvoudigde in vitro-benadering biedt een reproduceerbaar en ethisch haalbaar alternatief voor vroege evaluatie van lichtgebaseerde antimicrobiële therapieën.

Onderzoek naar een blauw licht LED-apparaat om wondpathogenen te onderdrukken met behulp van een collageengebaseerd synthetisch huidmodel

Beschrijven we een eenvoudige, snelle en robuuste methode voor de vorming...

Een 96 Goed microtiterplaat-gebaseerde methode voor de controle Formation en schimmelwerende gevoeligheid testen van Candida albicans Biofilms

De test beschrijft een snelle wijze te vroeg biofilmvorming in bacteriën en schimmels te meten. Deze methode maakt gebruik van een microtiterplaat als substraat voor microbiële biofilm en de vorming van biofilm wordt gevisualiseerd met behulp van kristalviolet stam. De test geeft zowel een kwalitatieve of kwantitatieve test voor de vroege biofilmvorming.

Microtiter Dish biofilm vorming Assay

Leer hoe fototherapie met rood licht de groei van Candida albicans-biofilmen reguleert. Dit protocol toont aan dat dagelijkse behandeling de biomassa en kolonievorming significant vermindert.

Dagelijkse fototherapie met rood licht te reguleren Candida albicans Biofilm groei

Meer video's verkennen