Identificatie van Nucleollaire factoren tijdens de HIV-1-replicatie via Rev-immunoprecipitatie en massaspectrometrie

Ons protocol biedt alternatieve methoden voor de identificatie en karakterisering van virale, nucleolar, en niet-nucleolar host factoren die de HIV-1 infectieuze cyclus te handhaven. De concepten die in deze benadering worden gebruikt, zijn van toepassing op andere virale en ziektemodellen die de karakterisering van onderbestudeerde trajecten vereisen. Probleemoplossingstechnieken worden beschreven voor wijziging van andere eiwitmodellen.

Het aantonen van de procedure zal worden Haitang Li en Pritsana Chomchan, wetenschappers in de moleculaire en cellulaire biologie afdeling van het Beckman Research Institute in de stad van de hoop, en Roger Moore, leden van de Stad van Hoop Proteomics Core en de afdeling Moleculaire Immunologie. Begin met het kweken van een HLfB stabiel uitdrukken HeLa cellijn cultuur in drie, 100-millimeter cultuur platen om een twee-keer-10-to-the-six-cells-per-milliliter dichtheid. Wanneer de cellen de juiste concentratie bereiken, meng 20 microgram plasmide met de Rev nucleolar lokalisatie signaal drie-prime vlag mutatie van belang met 1,76 milliliter TE 79/10 in een 15-milliliter buis, gevolgd door de toevoeging van 240 microliter van twee-molaire calciumchloride, met grondige mengen.

Breng vervolgens de inhoud van de buis dropwise over in een nieuwe buis van 15 milliliter met twee milliliter 2x HBS, gevolgd door het mengen op een vortexmachine. Na 30 minuten bij kamertemperatuur, vortex de neerslag. Voeg een milliliter van de suspensie dropwise aan elk van de drie, 100-millimeter HLfB cultuurplaten, terwijl zachtjes wervelen het medium.

Na een incubatie van zes uur in de celkweek incubator, vervang het transfectiemengsel door 10 milliliter vers kweekmedium en breng de cellen nog 42 uur terug naar de couveuse. 48 uur na de transfectie, plaats elke plaat op een bed van ijs binnen een biohazard niveau twee weefsel cultuur kap. Verwijder de celkweekmedia en spoel de cellen voorzichtig af met 10 milliliter gepehed PBS, zonder de cellagen te verstoren.

Gooi de PBS na het spoelen van de cellen weg. Behandel vervolgens de cellen met één milliliter lysebuffer, aangevuld met proteaseremmercocktail, per bord. Het kantelen van de platen om de cellen te verzamelen in een zwembad, gebruik maken van een cel schraper om handmatig verstoren van de lagen.

Met behulp van een micropipet van 1.000 microliter, pool het lysaat van elke plaat in een geprefroerde, 15-milliliter buis voor een 15 minuten durende incubatie op ijs, met vortexing om de vijf minuten. Aan het einde van de incubatie, aliquot de lysates in drie, 1,5-milliliter microcentrifuge buizen, en het verzamelen van de lysates door centrifugatie. Breng de supernatant over in een nieuwe buis van 15 milliliter en verkrijg de virale eiwitlysaatconcentratie, zoals beschreven in het manuscript.

Voor co-immuunsylistatie van de Rev nucleolar lokalisatie signaal drie-prime vlag, spoel 25 microliters van M2 affiniteit gel kralen drie keer met 500 microliters van verse lyse buffer, aangevuld met proteaseremmer cocktail, per wasbeurt. Voer deze stappen uit in een koude kamer of met de reagentia op ijs. Voeg na de laatste spoeling een concentratie van één milligram per milliliter van viraal eiwitlysaat toe aan de gespoelde kralen in een eindvolume van vijf milliliter lysisbuffer.

Broed de reactie drie uur lang bij vier graden Celsius met rotatie. Aan het einde van de incubatie, pellet de virale eiwit lysaat-geconjugated kralen door centrifugatie. Verzamel de supernatant voor het meten van de post-immunoprecipitatie lysaat eiwitconcentratie.

Zie het manuscript voor de instructies voor de opslag van monsters. Voeg 750 microliter lysebuffer toe aan de virale eiwitgeconjugeerde kraalkorrel, breng de kralen over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en was de kralen vijf minuten op een rotator bij vier graden Celsius. Verzamel de kralen door centrifugatie voor nog eens twee wasbeurten op de rotator, zoals net aangetoond.

Gebruik na de laatste wasbeurt een beknelde, lange gelbelastingtip om eventuele sporen van lysebuffer uit het kraal-coimmununoprecipitatiecomplex te verwijderen. Resuspend de kralen in 55 microliter van 2x laadbuffer. Kook vervolgens het monster 10 minuten op 95 graden Celsius.

Laad 25 microliter eluate op een westerse vlek gel en een Coomassie vlekken SDS-PAGE gel. Na voltooiing van SDS-PAGE gel elektroforese, spoel de gel drie keer in 25 milliliter ultrazuiver water gedurende 15 minuten. Voeg na de laatste wasbeurt 100 milliliter Coomassie vlekreagens toe aan de gel.

Zie het manuscript voor het volledige kleuringsprotocol. Voor de vertering van de gelbanden gebruikt u eerst een schoon scheermesje om de gelbanden van de gehele baan van de gel, die elke mutatie vertegenwoordigt, in ongeveer 5 millimeter kubussen te snijden. Plaats elke band in een schone, 0,5-milliliter microcentrifuge buis.

Bedek de banden twee keer met 100 millimolar ammoniumbicarbonaat in een één-op-één acetonitrile-naar-water oplossing bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten per wasbeurt. Droog vervolgens de gelstukken gedurende vijf minuten in een vacuümcentrifuge. Om de eiwitten te verminderen, bedek de gedroogde gelstukken met 10-millimolar dithiothreitol in 100-millimolar ammoniumbicarbonaat voor een incubatie van een uur bij 56 graden Celsius, gevolgd door alkylation in 100-millimolar iododoacetamide in water gedurende een uur bij kamertemperatuur in het donker.

Vervolgens krimpen en reswell de gel stukken twee keer met acetonitril, gevolgd door 100-millimolar ammonium bicarbonaat, beide met zachte schudden bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Na de tweede reswelling, droog de gel stukken gedurende vijf minuten in een vacuüm centrifuge. Zwellen de gel stukken met 50 nanogram per microliter van sequencing-grade gemodificeerde trypsine in 100-millimolar ammonium bicarbonaat.

Bedek na vijf minuten de gelstukken met 100 millimolar ammoniumbicarbonaat en laat ze volledig weer goed zwellen, waardoor extra 100-millimolar ammonium bicarbonaat wordt toegevoegd, zodat de gezwollen gelstukken volledig bedekt zijn. Vervolgens, incubeer de gel stukken 's nachts op 37 graden Celsius, het stoppen van de reactie met 1/10 van het volume van de monsters met 10% mierenzuur in water de volgende ochtend, en het verzamelen van de supernatant van elke buis. Rev nucleolar lokalisatie signaal drie-prime vlag is detecteerbaar onder drie verschillende lyse buffer voorwaarden die verschillende concentraties natriumchloride.

B23 is ook detecteerbaar in lysisbuffer met de lagere zoutconcentratie, nauwelijks detecteerbaar in lysisbuffer met de medium zoutconcentratie en niet detecteerbaar in lysebuffer met een hoge zoutconcentratie. B23 detectie is optimaal in lysis buffer met de lage natriumchloride concentratie met wild-type Rev drie-prime vlag en verliest affiniteit met Rev nucleolar lokalisatie signaal M1 drie-prime vlag. B23 affiniteit met wild-type Rev drie-prime vlag neemt ook af met een hogere zoutconcentratie, en de pcDNA negatieve controle levert geen niet-specifieke immunodetetie na immunoprecipitatie onder beide lyse buffer voorwaarden.

Rev nucleolar lokalisatie signaal drie-prime vlag is het meest detecteerbaar na elutie door het koken in 2x monster laden buffer, terwijl B23 is detecteerbaar onder zowel de 37-en 95-graden Celsius monster buffer incubatie voorwaarden. Na immunoprecipitatie en zilvervlekken, zoals aangetoond, zijn de wild-type Rev en Rev nucleolar lokalisatiesignalen M2, M6 en M9 detecteerbaar bij 18 kilodaltons. Banden die overeenkomen met B23-eiwit worden ook waargenomen bij de 37-kilodaltonmarker.

Kleuring met Coomassie reagens toont verder de detecteerbaarheid van Rev nucleolar lokalisatie signaal drie-prime vlag in de aanwezigheid en afwezigheid van mutaties op 18 kilodaltons. Gebruik zoveel mogelijk controles, zowel positief als negatief, als nodig is voor verwijzingen die betrekking hebben op uw ziektemodel tijdens het probleemoplossings- en screeningsproces voor mogelijke bindende factoren. Alle verwijdering en single-point mutaties kunnen worden onderzocht op dominant-negatieve activiteit door middel van multimerisatie met wild-type Rev en gebruikt bij de arrestatie van HIV-1 replicatie.