Name: Een strategie om verbindingen te identificeren die van invloed zijn op de celgroei en overleving in gekweekte zoogdiercellen bij een lage tot matige doorvoer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 s
Description: Leer een snelle en efficiënte strategie voor het screenen van verbindingen op hun effect op celgroei in gekweekte zoogdiercellen met behulp van twee assays tegelijk. Deze methode identificeert cytotoxische stoffen en beoordeelt zowel groei-inhibitie als -versterking.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het NINDS Intramural Research Program.

1. cultuur van de NSC
Opmerking: manipulatie van een menselijke NSC-lijn wordt hieronder beschreven, maar elke cellijn kan voor dit protocol worden gebruikt. Alle celkweek werkzaamheden worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast.
<ol><li>Jas een 96-goed bord met kelder membraan/extracellulaire matrix (ECM).<ol>
<li>Hoeveelheid ecu (tabel met materialen) ontdooien, die de bevestiging van de NSC op ijs zal vergemakkelijken. Verdun de ECM naar de juiste concentratie (in het algemeen 1:100) in 10 mL basismedium (tabel met materialen) en voeg 50 μL per putje toe aan elk van de 60 binnenputten van een 96-wells plaat (Figuur 1). Gebruik alleen de binnenzijde 60 Wells om artefacten te voorkomen die kunnen voortvloeien uit het randeffect16.</li>
		<li>Laat de plaat gedurende ten minste 30 minuten op kamertemperatuur of in een kweek couveuse (37 °C, 5% CO2) zitten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dissociate en plaat neurale stamcellen. Opmerking: cellen voor gebruik in deze methode moeten worden geteeld tot ten minste 80% samenvloeiing in een T75 kolf.<ol>
<li>Kweekcellen in een T75 kolf in een celkweek incubator bij 37 °C en 5% CO2 in NSC-medium dat bestaat uit basismedium, B27, niet-essentiële aminozuren, 2 mm glutamine en 10 ng/ml basis fibroblast-groeifactor (FGFb of FGF2).</li>
		<li>Verwijder cellen uit de incubator zodra ze 80% samenvloeiing bereiken en aspireren uit NSC medium. Voeg een geschikte hoeveelheid celdissociatie reagens toe (3 mL voor een T75 kolf; Tabel met materialen) en incuberen gedurende 5 minuten in de incubator.</li>
		<li>Voeg na incubatie 7 mL NSC-medium toe in de T75 kolf en Pipetteer krachtig om ervoor te zorgen dat alle cellen losraken. Breng de gezien Cell-oplossing over in een buis van 15 ml en centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Na centrifugeren, verwijder supernatant uit de buis en respendeer cellen in 10 mL NSC medium en Tel cellen.</li>
		<li>Readjust concentratie van cellen tot 200.000 cellen/mL met NSC medium. Zorg ervoor dat cellen volledig worden geresuspendeerd voor homogene plating in putten.</li>
		<li>Plaat 100 μL van het celmengsel (20.000 cellen) in de 60 binnenputten van 3 96-boorput platen die zijn gecoat zoals beschreven in punt 1,1. Gebruik zes van de acht sleuven van een 8-kanaals multikanaalpipettor voor kolom-voor-kolom van de plaat cellen.</li>
		<li>Voeg 100 μL basismedium of NSC medium toe aan alle putjes zonder cellen om mogelijke verdamping uit de buitenste putten te minimaliseren.</li>
		<li>Inspecteer onder een celkweek Microscoop ten minste 10 putjes op elk van de 3 96-boorput platen om te bevestigen dat de cellen op de verwachte dichtheid zijn gesest. Ga niet verder met de assay als cellen worden verguld bij een dichtheid te dun of te dicht.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. behandeling van cellen met verbindingen
Opmerking: de zelfgemaakte bibliotheek getest in deze demonstratie bevat verbindingen die moduleren Wingless/Integrated (WNT), retinoïnezuur, transformeren groeifactor-Beta (TGF-β), en Sonic hedgehog signalering trajecten evenals een verscheidenheid van tyrosine kinases.
<ol><li>
Verkennend primair scherm voor toxiciteit/celnummer
	<ol>
<li>Aliquot 50 − 100 mL van tot 57 test verbindingen (aanvullende tabel 1) bij een concentratie van 10 mM in 100% dimethylsulfoxide (DMSO) in het interieur 60 putjes van een U-bodem, V-bodem of ronde bodem 96-putplaat met drie DMSO Wells als controle (Zie Afbeelding 1 voor een plaat kaart). Dit zal dienen als de Master samengestelde plaat met 25 μL van samengestelde die kan worden bevroren en ontdooid meerdere malen. Opmerking: platte bodemplaten mogen niet worden gebruikt omdat het moeilijker zal zijn om kleine hoeveelheden verbindingen van hen te aspireren met een bench top pipettor.</li>
		<li>Verwijder celcultuurplaten uit de incubator 16-24 h na het splitsen zoals beschreven in sectie 1 en zuig de gemiddelde kolom-voor-kolom van NSC op met een 8-kanaals multi-well pipet met slechts zes van de acht multi-well-sleuven. Voeg 95 μL verse NSC-medium toe aan cellen in elk van de drie replicaatplaten en plaats de platen terug in de incubator totdat stap 2.1.4 hieronder is voltooid.</li>
		<li>Voeg 49 μL NSC-medium toe aan elk van de inwendige 60 putten van een lege U-bodem, met V-bodem of met ronde bodem 96-boorput met een 8-kanaals multi-well pipettor. Ontsluit de Master samengestelde plaat en gebruik een bench top pipet of gelijkwaardig instrument om 1 μL verbinding van de Hoofdplaat te pipetteren in de 49 μL van het nsc-medium in elk van de inwendige 60 putjes.</li>
		<li>Meng de verdunde verbinding 3x met de Bench top pipettor.</li>
		<li>Verwijder de 3 96-put platen van de NSCs uit de incubator, Pipetteer 15 μL van elke verdunde verbinding met de bovenste pipetttop en doseer een 5 μL aliquot van een stof in elk van de drie platen. Opmerking: deze 1:20 verdunning van de verbinding in de cellen in combinatie met de initiële 1:50 verdunning in stap 2.1.3 levert een verdunning van 1:1000 op, zodat de uiteindelijke concentratie van de verbindingen op de NSCs 10 μM zal zijn met een DMSO-concentratie van 0,1% en de uiteindelijke de concentratie voor de DMSO-besturingselementen is 0,1%.</li>
		<li>Incuberen cellen met compound voor 72 h en ga verder met cytotoxiciteit testen. Kortere intervallen kunnen worden gebruikt, maar een incubatietijd van 72 uur moet de potentiële cytotoxische effecten van geteste verbindingen maximaliseren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dosisrespons bepaling Opmerking: de set-up voor de 96-goed gebruikt voor de dosis-respons wordt weergegeven in Figuur 2.
	<ol>
<li>Gebruik kolom 2 voor zes DMSO-controle-replicaties en test triplicaten van maximaal drie verschillende verbindingen bij twee-voudige seriële verdunningen bij zes doses beginnend met een hoge dosis van 10 μM.</li>
		<li>Verdun 4 μL DMSO-of teststof in DMSO tot 196 μL NSC-medium in een micro centrifugebuis van 1,5 mL. Voeg 25 μL DMSO toe aan de kolom putjes van B2-G2 en 50 μL teststoffen in de rij van B3-B11 met de drie geteste verbindingen in 10 mM-triplicaten in rijen B3-B5, B6-B8 en B9-B11.</li>
		<li>Pipetteer 25 μL NSC-medium naar de resterende lege kolommen in het binnengedeelte van de 96-goed plaat. Verwijder 25 μL verbinding uit Wells B3-B11 met een multikanaalpipettor, voeg toe aan Wells C3-C11 en meng ten minste vijf keer. Herhaal het proces voor de resterende rijen om triplicaten te genereren bij twee-voudige verdunningen voor een totaal van zes doses voor elk van de verbindingen.</li>
		<li>Genereer NSCs voor de dosisrespons precies zoals beschreven voor het primaire scherm in paragraaf 2,1. De verbindingen voor de dosisrespons worden toegevoegd aan en geïntrigeerd op de cellen, precies zoals beschreven in de stappen 2.1.5 en 2.1.6. Opmerking: drie biologische replicaten van de dosisrespons test worden uitgevoerd door de assay op de NSCs op verschillende passages op afzonderlijke dagen te herhalen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. beeldvormings cellen op een plaat lezer
<ol><li>Nadat cellen voor de toegewezen tijd met verbindingen zijn geïntrigeerd, worden de beeld cellen op een plaat lezer om het voorbehandelings celnummer per put te bepalen. Opmerking: instructies voor Imaging cellen zijn specifiek voor lezers, maar volgen over het algemeen een vergelijkbare strategie. De onderstaande aanwijzingen zijn van toepassing op de lezer die in deze demonstratie wordt gebruikt (tabel met materialen).</li>
	<li>Verwijder de plaat uit de incubator en plaats deze in de plaat lezer. Open de imager-software voor het instellen van protocol-en experiment bestanden voor de studie. Ga naar Imager Manual Mode in Taakbeheer en klik op nu vastleggen....</li>
	<li>Kies 96-well plate als het type vat, selecteer 10x voor de vergroting en rood fluorescerende proteïne (RFP) 531 en 593 voor Imaging tdTomato. Kies een put en klik vervolgens op autofocus om de afbeelding scherp te stellen en Stel automatisch bloot voor de juiste belichtingstijd. Pas indien nodig de scherpstelling en belichting handmatig aan.</li>
	<li>Zodra de juiste scherpstelling en belichting zijn verkregen, klikt u op het camerapictogram om de foto vast te leggen. Klik vervolgens op process/ANALZYE boven afbeelding om door te gaan met het bouwen van het protocol en selecteer de analyse tabblad.</li>
	<li>Klik op mobiele analyse in analyse stap toevoegen aan de rechterkant van de afbeelding en klik op starten. Afbeelding toont gemarkeerde cellen om elke afzonderlijke cel aan te geven. De selectie van opties kan worden geklikt om parameters te wijzigen om beter cellen te selecteren op basis van de fluorescentie drempel of celgrootte. Als de imager de cellen op de juiste manier telt, klikt u op stap toevoegen onder aan het scherm.</li>
	<li>Klik op het pictogram boven aan het scherm om een experiment te maken van de afbeeldingsset, waarmee een venster met het experiment wordt geopend. Eenmaal geopend, klik op procedure onder het tabblad Protocol en in het nieuwe venster dat opent Selecteer Lees, klik vervolgens in het nieuwe venster op volledige plaat om alleen de 60 putten te selecteren die de cellen bevatten (B2... G11). Klik op OK om de wijzigingen op te slaan en klik vervolgens op OK in het venster procedure.</li>
	<li>De plaat kan nu worden afbeelding gemaakt door dit protocol en het experimentele bestand kan worden opgeslagen. Klik op het pictogram afspelen om de plaat uit te voeren. Zodra de eerste plaat is gefotografeerd, beeld de andere twee platen. Nadat de Imaging is voltooid, downloadt u de celtellinggegevens naar een werkblad voor analyse. Neem alle beelden bij 10x vergroting.</li>
</ol>4. terminale MTT-cytotoxiciteits test
Opmerking: Start de MTT test binnen twee uur na het voltooien van tdTomato Imaging.
<ol><li>Maak een MTT-stamoplossing van 5 mg/mL door 25 mg MTT uit te wegen en deze in 5 mL NSC-medium opnieuw op te schorten. Vortex de oplossing totdat er geen zichtbare precipitaten van MTT, die enkele minuten kan duren.</li>
	<li>Verwijder celcultuurplaten uit de incubator en zuig het celkweekmedium op. Verdun MTT 1:10 in het celkweekmedium en voeg 100 μL MTT toe aan elk goed van cellen.</li>
	<li>Incuberen cellen bij 37 °C gedurende 2 uur. Een paars precipitaat moet ruwweg zichtbaar zijn in verhouding tot het aantal cellen in de put. Aspiraat de MTT-oplossing uit platen of Inverteer de plaat snel naar flick oplossing uit de plaat.</li>
	<li>Voeg 50 μL 100% DMSO toe aan elke put en schud de platen bij kamertemperatuur gedurende 10 min bij 400 rpm. Lees de extinctie van elke put op 595 nm in een plaat lezer en exporteer gegevens naar een spreadsheet voor analyse.</li>
</ol>5. gegevensanalyse
<ol><li>Voer een analyse uit van het aantal tdTomato-cellen en gemiddelde met de juiste software (Commercial spreadsheet, R). Bereken gemiddelden voor absorptie of het aantal cellen van de drie DMSO-replicaten op elke plaat voor normalisatie doeleinden, verdeel vervolgens de waarde voor het aantal cellen of gemiddelde voor elke put op de plaat door dit gemiddelde en zet deze om in een percentage. Dit resulteert in het genormaliseerde aantal cellen of de extinctie ten opzichte van de DMSO-regeling voor elke plaat.</li>
	<li>Bereken het gemiddelde genormaliseerde aantal of de extinctie en de standaarddeviatie voor het repliceren van putjes op de drie platen. Opmerking: op dit moment moeten er vier verschillende sets van genormaliseerde waarden: één voor elk van de platen en één gemiddelde voor de drie replicaatplaten.</li>
	<li>Wees conservatief en gebruik een genormaliseerde waarde op of onder 25% voor het gemiddelde over de drie replicaatplaten om een samengestelde als giftig te classificeren. Ook, omdat slechts één behandeling per stof wordt uitgevoerd op elke plaat, alleen label verbindingen die onder deze drempel op alle drie replicaatplaten als giftig vallen. Onderzoek fluorescerende beelden van alle verbindingen die deze analyse filtert als giftig voor het visueel bevestigen van toxiciteit. Opmerking: de identificatie van verbindingen met een groei remmende of groeibevorderende werking is moeilijker te beoordelen in een verkennende assay van dit type als gevolg van het ontbreken van replicaten op elke plaat. Echter, het volgende is een snelle manier om te identificeren van verbindingen die ofwel vertragen of verbeteren van cellulaire groei.</li>
	<li>Bereken de standaarddeviatie voor de drie replicaatdmso-besturingselementen op elke plaat en filter vervolgens op alle verbindingen die gemiddelde waarden hebben ten minste twee standaarddeviaties boven of onder de DMSO-besturing. Verbindingen die op elk van de drie platen uit dit filter vallen, kunnen nader onderzoek rechtvaardigen.</li>
	<li>Gebruik dezelfde analyse strategie voor de dosisrespons als het primaire toxiciteits scherm. Bereken de gemiddelden voor de DMSO-besturingselementen voor elke biologische replicatie en gebruik deze waarden om het percentage levende cellen of procent gemiddelde te normaliseren voor elke samengestelde/dosiscombinatie. Bereken de middelen en de standaardfout van de middelen voor alle samengestelde/dosis combinaties voor de drie biologische replicaten.</li>
	<li>Transformeer de concentratie naar de logwaarde, Genereer een dosisrespons curve voor het log van de concentratie versus genormaliseerde levensvatbaarheid en monteer de curve met een niet-lineaire regressieanalyse (analyse kan worden uitgevoerd in R of verschillende commerciële statistische pakketten). Bereken de dodelijke dosis 50 (of technisch in dit geval de levensvatbare dosis 50) of de concentratie van de stof die resulteert in 50% toxiciteit uit de vergelijking van deze curve. Veel softwarepakketten zullen dit cijfer automatisch berekenen.</li>
</ol>

<ol><li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Toxicity+Testing+in+the+21st+century%3A+A+Vision+and+a+Strategy%22">Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy</a>. , National Academies Press. Washington DC. (2007).</li>
<li>Llorens, J., Li, A. A., Ceccatelli, S., Sunol, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+and+tools+for+preventing+neurotoxicity%3A+to+Test%2C+to+predict%2C+and+how+to+do+it%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Strategies and tools for preventing neurotoxicity: to Test, to predict, and how to do it.</a> Neurotoxicology. 33 (4), 796-804 (2012).</li>
<li>Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+and+cytotoxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation and cytotoxicity assays.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).</li>
<li>Ciofani, G., Danti, S., D'Alessandro, D., Moscato, S., Menciassi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+cytotoxicity+of+boron+nitride+nanotubes%3A+interference+with+the+MTT+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Assessing cytotoxicity of boron nitride nanotubes: interference with the MTT assay.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (2), 405-411 (2010).</li>
<li>Tennant, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+trypan+blue+technique+for+determination+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability.</a> Transplantation. 2 (6), 685-694 (1964).</li>
<li>Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-release+assay+for+natural+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">An enzyme-release assay for natural cytotoxicity.</a> Journal of Immunological Methods. 64 (3), 313-320 (1983).</li>
<li>Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+rapid+and+simple+nonradioactive+assay+to+monitor+and+determine+the+proliferation+of+lymphocytes%3A+an+alternative+to+%5B3H%5Dthymidine+incorporation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A new rapid and simple nonradioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay.</a> Journal of Immunological Methods. 170 (2), 211-224 (1994).</li>
<li>Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcein-acetyoxymethyl+cytotoxicity+assay%3A+Standardization+of+a+method+allowing+additional+analyses+on+recovered+effector+cells+and+supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: Standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).</li>
<li>Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+ATP+bioluminescence+as+a+measure+of+cell+proliferation+and+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity.</a> Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).</li>
<li>Mosmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+colorimetric+assay+for+cellular+growth+and+survival%3A+application+to+proliferation+and+cytotoxicity+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay.</a> Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).</li>
<li>Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazolium+dyes+as+tools+in+cell+biology%3A+new+insights+into+their+cellular+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Annual+Review%22%5BJournal%5D)">Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).</li>
<li>Malik, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compounds+with+species+and+cell+type+specific+toxicity+identified+in+a+2000+compound+drug+screen+of+neural+stem+cells+and+rat+mixed+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons.</a> Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), 100(2006).</li>
<li>Cerbini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+activator-like+effector+nuclease+%28TALEN%29-mediated+CLYBL+targeting+enables+enhanced+transgene+expression+and+one-step+generation+of+dual+reporter+human+induced+pluriopotent+stem+cell+%28iPSC%29+and+neural+stem+cell+%28NSC%29+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated CLYBL targeting enables enhanced transgene expression and one-step generation of dual reporter human induced pluriopotent stem cell (iPSC) and neural stem cell (NSC) lines.</a> PLoS One. 10 (1), 0116032(2015).</li>
<li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).</li>
<li>Qie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+depletion+and+glucose+depletion+trigger+growth+inhibition+via+distinctive+gene+expression+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming.</a> Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).</li>
<li>Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+cell+culture+optimization+enhances+experimental+reproducibility+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3029(2018).</li>
<li>Carmichael, J., DeGraff, W. G., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Mitchell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+tetrazolium-based+semiautomated+colorimetric+assay%3A+assessment+of+chemosensitivity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing.</a> Cancer Research. 47 (4), 936-942 (1987).</li>
<li>Romijn, J. C., Verkoelen, C. F., Schroeder, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+MTT+assay+to+human+prostate+cancer+cell+lines+in+vitro%3A+establishment+of+test+conditions+and+assessment+of+hormone-stimulated+growth+and+drug-induced+cytostatic+and+cytotoxic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects.</a> Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).</li>
<li>Jo, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unreliability+of+MTT+assay+in+the+cytotoxic+test+of+primary+cultured+glioblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells.</a> Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).</li>
<li>Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity+test+based+on+human+cells+labeled+with+fluorescent+proteins%3A+photography%2C+and+scanning+for+high-throughput+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay.</a> Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het primaire doel van dit artikel was om een strategie die efficiënt en goedkoop identificeren van verbindingen die van invloed zijn op de celgroei in een low-to matige doorvoer screening te beschrijven. Er werden twee orthogonale technieken gebruikt om het celnummer te beoordelen om het vertrouwen in de conclusies te vergroten en aanvullende inzichten te bieden die niet beschikbaar zouden zijn als slechts één enkele test werd gebruikt. Een van de assays gebruikt een fluorescerende celimager om rechtstreeks tdtomaat-posi...

Een van de belangrijkste kenmerken die moet worden bepaald voor een chemische verbinding die therapeutische potentie heeft is de toxiciteit voor dierlijke cellen. Dit kenmerk zal bepalen of een medicijn een goede kandidaat is voor een uitgebreidere studie. In de meeste gevallen, verbindingen met minimale toxiciteit worden gezocht, maar er zijn situaties waarin een verbinding met de capaciteit om specifieke celtypen te doden is van belang, bijvoorbeeld, anti-tumorigene drugs. Hoewel hele dieren de beste modelsystemen zijn om systemische toxiciteit te bepalen, zijn de betrokken kosten en arbeid prohibitief wanneer meer dan een paar verbindingen moeten worden getest. Als zodanig wordt de zoogdier celcultuur over het algemeen gebruikt als het meest efficiënte alternatief1,2. Kleine tot middelgrote doorvoer drug schermen zijn een belangrijke modaliteit waardoor toxiciteit kan worden beoordeeld in de celcultuur. Deze schermen kunnen worden gebruikt voor het interroken van geannoleerde bibliotheken die gericht zijn op individuele signalerings trajecten. Het algemene formaat van een dergelijk scherm is om in eerste instantie alle verbindingen in de bibliotheek te testen met een enkelvoudige dosis (over het algemeen 10 μM) in een verkennend primair toxiciteits scherm, en vervolgens een diepgaand secundair dosisrespons scherm uit te voeren om de toxiciteit volledig te karakteriseren Profiel van hits van het primaire scherm. De methoden om deze strategie uit te voeren worden hier beschreven en bieden een snelle, efficiënte en goedkope manier om toxische verbindingen te identificeren en te karakteriseren.
Er zijn meerdere methoden ontwikkeld om de cytotoxiciteit van kleine verbindingen en nanomateriaal in zoogdiercellen3,4te beoordelen. Opgemerkt moet worden dat bepaalde materialen kunnen interageren met de test die misleidende resultaten oplevert, en dergelijke interacties moeten worden getest bij het karakteriseren van hits van toxiciteits schermen4. Cytotoxiciteits testen omvatten trypaan blauwe uitsluiting5, lactaat dehydrogenase (LDH) release assay6, Alamar blue assay7, calcien ACETOXYMETHYL Ester (am)8en de ATP-test9. Al deze assays meten verschillende aspecten van celmetabolisme die als een proxy voor het celnummer fungeren kunnen. Terwijl alle voordelen bieden, tetrazolium zout gebaseerde assays zoals 3-(4, 5-dimethylthizol-2-yl)-2, 5-difenyltetrazoliumbromide (MTT), 2, 3-bis (2-methoxy-4-Nitro-5-sulfopheny)-2H-tetrazolium-5-carboxyanilide Inner Salt (XTT)-1, en 4-(3-[4- Iodophenyl]-2-[4-nitrofenyl]-2H-5-tetrazolio)-1,3-benzeen disulfonaat (WST-1)10,11 bieden een goede nauwkeurigheid en gebruiksgemak tegen lage kosten. MTT, dat in deze demonstratie zal worden gebruikt, wordt gereduceerd tot een onoplosbare Formazan door een mitochondriale reductase en de snelheid van deze conversie correleert sterk met het celnummer. Deze test is routinematig gebruikt op zowel een kleine schaal en voor het screenen van bibliotheken met maximaal 2.000 verbindingen12. Direct tellen van cellen door een gelabelde marker biedt een andere methode om het mobiele nummer te beoordelen, en in tegenstelling tot de MTT-assay kan het aanvullende informatie geven over de dynamiek van cellulaire groei. Er zijn verschillende algemeen beschikbare algoritmen beschikbaar om geautomatiseerde celcount-analyses uit te voeren en er zijn ook eigen algoritmen die deel uitmaken van softwarepakketten voor beeldvormings lezers13,14. In deze methode beschrijving, een menselijke neurale stam cel (NSC) lijn die is genetisch bewerkt tot constitutief Express tdTomato15 zal dienen als een test lijn om cellulaire levensvatbaarheid resultaten te vergelijken tussen een MTT assay en een geautomatiseerde celtelling assay in een scherm dat de toxiciteit van 57 teststoffen beoordeelt. Hoewel het primaire doel van deze strategie was om te identificeren en te karakteriseren van giftige stoffen, het heeft het extra voordeel van potentieel identificeren van groei remmende en groei-verbeterende verbindingen en biedt dus een effectieve methode voor het identificeren van drugs die cellulaire groei kan moduleren.

```html
<table><tbody><tr><td>B-27 (50X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504001</td><td>Neural stem cell medium component.  </td></tr><tr><td>BenchTop pipettor</td><td>Sorenson Bioscience</td><td>73990</td><td>Biedt de mogelijkheid om compoundbibliotheek in één keer in een 96-well plaat te pipetteren.</td></tr><tr><td>BioLite 96 well multidish</td><td>Thermo Scientific</td><td>130188</td><td>Elke 96-well celkweekplaat zal werken.  We gebruiken deze in ons werk.</td></tr><tr><td>Cell culture microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td>Visuele inspectie van cellen om de juiste dichtheid te garanderen.</td></tr><tr><td>Cytation 5/ Imaging reader</td><td>BioTek</td><td>CYT3MFV</td><td>Gebruikt voor celbeeldvorming en absorptiemetingen.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>610420010</td><td>Oplosmiddel voor compounden gebruikt in screen. Lost MTT-precipitaten op om absorptiemetingen te vergemakkelijken.</td></tr><tr><td>FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Neural stem cell medium component.  </td></tr><tr><td>GelTrex</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1413202</td><td>Neural stem cell basement membrane matrix.  Laat cellen zich hechten aan celkweekplaten.</td></tr><tr><td>Gen5 3.04</td><td>BioTek</td><td></td><td>Analysesoftware om celtellingen te bepalen voor tdTomato expresserende cellen.</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030081</td><td>Neural stem cell medium component.  </td></tr><tr><td>Microtest U-Bottom</td><td>Becton Dickinson</td><td>3077</td><td>Opslag van compoundbibliotheken.</td></tr><tr><td>MTT</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M6494</td><td>Actieve assay reagent om cellulaire levensvatbaarheid te bepalen.</td></tr><tr><td>Multichannel pippette</td><td>Rainin</td><td>E8-1200</td><td>Kolommen-per-kolommen toevoeging van celkweekmedium, MTT of DMSO.</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21103049</td><td>Neural stem cell basismedium.</td></tr><tr><td>RFP filter cube</td><td>BioTek</td><td>1225103</td><td>Filter in Cytation 5 gebruikt om tdTomato expresserende cellen te beeldvormen.</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12605036</td><td>Celdissociatiereagens.</td></tr></tbody></table>
```

een strategie om verbindingen te identificeren die van invloed zijn op de celgroei en overleving in gekweekte zoogdiercellen bij een lage tot matige doorvoer

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

Cytotoxiciteit is een kritische parameter die moet worden gekwantificeerd bij het bestuderen van geneesmiddelen die therapeutische voordelen kunnen hebben. Hierdoor, veel drug screening testen maken gebruik van cytotoxiciteit als een van de kritische kenmerken worden geprofileerd voor afzonderlijke verbindingen. Cellen in cultuur zijn een nuttig model om cytotoxiciteit te beoordelen voordat ze overgaan tot het opvolgen van veelbelovende loodverbindingen in duurdere en arbeidsintensieve diermodellen. We beschrijven een strategie voor het identificeren van verbindingen die van invloed zijn op de celgroei in een tdTomato uitdrukken menselijke neurale stamcellen (NSC) lijn. De strategie maakt gebruik van twee complementaire assays om het celnummer te beoordelen. Eén test werkt via de reductie van 3-(4, 5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) naar Formazan als een proxy voor het celnummer en de andere rechtstreeks de tdTomato die NSCs uitdrukt. De twee testen kunnen gelijktijdig worden uitgevoerd in een enkel experiment en zijn niet arbeidsintensief, snel en goedkoop. De strategie beschreven in deze demonstratie getest 57 verbindingen in een verkennend primair scherm voor toxiciteit in een 96-well plaat formaat. Drie van de hits werden verder gekarakteriseerd in een zespunts dosisrespons met dezelfde assay-opstelling als het primaire scherm. Naast het verstrekken van uitstekende bevestiging voor toxiciteit, vergelijking van de resultaten van de twee assays kan effectief zijn bij het identificeren van verbindingen die andere aspecten van celgroei beïnvloeden.

De geautomatiseerde cel Count gegevens geïdentificeerd elf verbindingen met minder dan 25% levensvatbaarheid wanneer genormaliseerd naar de DMSO-besturingselement terwijl de MTT gegevens geïdentificeerd deze dezelfde verbindingen plus twee extra degenen (tabel 1 en tabel 2, gearceerd rood). De twee verbindingen bleken alleen giftig in de MTT assay (Wells F3 en G10) had 31% en 39%, respectievelijk, het aantal tdTomato-positieve cellen als de controle en de rangorde waren de volgende twee ...

Het is vaak noodzakelijk om te beoordelen van de potentiële cytotoxiciteit van een reeks van verbindingen op gekweekte cellen. Hier beschrijven we een strategie om betrouwbaar op te schermen voor giftige stoffen in een 96-well formaat.

Een strategie om verbindingen te identificeren die van invloed zijn op de celgroei en overleving in gekweekte zoogdiercellen bij een lage tot matige doorvoer

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

Dit protocol biedt een snelle en efficiënte strategie om tegelijkertijd twee tests te gebruiken om enkele honderden verbindingen te screenen op hun effecten op de celgroei. De tests kunnen ons informatie geven over de vraag of specifieke verbindingen cytotoxisch zijn, celgroei remmen of de celgroei verbeteren. Door gebruik te maken van de twee tests samen, zijn we in staat om de nauwkeurigheid te verhogen en cytotoxische verbindingen te identificeren.In gevallen waarin de resultaten van de twee tests uiteenlopen, kan deze strategie ons in staat stellen om verbinding te identificeren met unieke effecten op de cellulaire functie die verder kunnen worden onderzocht op andere manieren. Het belangrijkste voordeel van deze strategie is dat het snel, goedkoop en niet-arbeidsintensief is. Eenmaal onder de knie, het stelt onderzoekers in staat om gemakkelijk uit te voeren een primair scherm van maximaal 200 verbindingen in een week, en vervolgens een uitputtende dosis respons curve uit te voeren op 10 tot 15 verbindingen in een andere week.Het aantonen van de procedure zal ikzelf en Rohini Manickam, een stafwetenschapper en post-baccalaureaat collega van het laboratorium. Ten eerste, in een biologische veiligheidskast, kweekcellen in een T75 kolf met NSC-medium, zodat ze ten minste 80% confluent bij het begin van de test. En plaats de kolf in een celkweek incubator ingesteld op 37 graden Celsius en vijf procent kooldioxide.Zodra de cellen 80% samenvloeiing bereiken, verwijdert u de kolf uit de couveuse en haalt u het NSC-medium aan. Voeg drie milliliter celdissociatiereagenmiddel toe en incubbate gedurende vijf minuten in de couveuse. Voeg na incubatie zeven milliliter NSC-medium in de kolf toe en pipet krachtig om ervoor te zorgen dat alle cellen losraken.Breng de gescheiden celoplossing over op een buis van 15 milliliter en vercentrifuge vijf minuten op 200 keer G. Verwijder de supernatant uit de buis en schort de cellen opnieuw op in 10 milliliter NSC-medium. Gebruik een geautomatiseerde celteller of hemocytometer om de cellen te tellen en voeg NSC-medium toe aan de buis om de concentratie cellen aan te passen tot 200.000 cellen per milliliter.Dan, met behulp van zes van de acht sleuven van een acht kanaals multichannel pipettor plaat 100 microliter van de cel mengsel kolom door kolom in 60 binnenputten van drie 96 goed platen die zijn gecoat door extracellulaire matrix. Voeg 100 microliters basismedium of NSC-medium toe aan alle putten zonder cellen om potentiële verdamping van buitenste putten met cellen te minimaliseren. Onder een celcultuurmicroscoop, visueel inspecteren ten minste 10 putten op elk van de drie 96 put platen om te bevestigen dat de cellen zitten op de verwachte dichtheid.Incubeer bij 37 graden Celsius en vijf procent kooldioxide. Verwijder de celkweekplaten 16 tot 24 uur na het splitsen uit de couveuse en haal nsc-middenkolom per kolom aan met een achtkanaals multi-well pipettor, met slechts zes van de acht multi-well sleuven. Voeg 95 microliter verse NSC medium toe aan elke put van de drie repliceren platen en plaats de platen terug in de couveuse.Met een acht-kanaals multi-well pipettor, voeg 49 microliters van NSC medium in elk van het interieur 60 putten van een lege U-bottomed, V-bodem, of ronde bodem 96 put plaat. Maak de geprepareerde hoofdverzwaarplaat los. Pipette een microliter van de verbinding van de master plaat in elk van het interieur 60 putten met NSC medium, en meng de verdunde verbinding drie keer met een bank top pipettor.Verwijder vervolgens de drie 96 putplaten nscs uit de couveuse en doseer vijf microliter van de verdunde verbinding in elke put van de drie platen die cellen bevatten om een één tot 1000 verdunning te geven voor de uiteindelijke samengestelde concentratie van 10 micromoer met een DMSO-concentratie van 0,1%Incubaatcellen met verbinding gedurende 72 uur, en ga verder met cytotoxiciteitstesten. Om dosisresponstest uit te voeren, stel een 96-put in. Gebruik Kolom Twee voor zes DMSO-controlerepliceert en test drievouden van maximaal drie verschillende verbindingen bij tweevoudige seriële verdunningen, bij zes doses, te beginnen met een hoge dosis van 10 micromolar.Verdun vier microliters van 100%DMSO of testverbinding in DMSO tot 196 microliter van NSC-medium in een 0,5 of 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Voeg 25 microliter van de verdunde DMSO toe om putten en 50 microliter van de verdunde testverbindingen aan de bijbehorende putten te controleren. Pipette 25 microliters van NSC medium tot de resterende lege putten in het binnengedeelte van de 96 putplaat.Met een multichannel pipettor, breng 25 microliter van de verbinding van de 10 micromolar putten naar de vijf micromolar putten, en meng ten minste vijf keer. Vervang de pipet tips, en herhaal het proces door het mengen van de resterende rijen te genereren drieledige bij tweevoudige verdunningen voor een totaal van zes doses voor elk van de verbindingen. Breng vijf microliter van elke verdunning over in een nieuwe plaat met kweekcellen die worden getest.Plaats de plaat in de couveuse op 37 graden Celsius en vijf procent kooldioxide. Nadat cellen 72 uur zijn geïncubeerd, verwijder de plaat uit de couveuse en plaats deze in de plaatlezer. Open de imager-software om protocol- en experimentbestanden voor de studie in te stellen.Ga naar de handmatige modus imager op Taakbeheer en klik op Nu vastleggen. Kies 96 goed plaat als het type schip. Selecteer 10 keer voor de vergroting en rood fluorescerend eiwit 531 en 593 voor beeldvorming tdTomato.Klik op een put. Klik vervolgens op Autofocus om de afbeelding scherp te stellen en Automatisch bloot voor de juiste belichtingstijd. Pas indien nodig handmatig de scherpstelling en belichting aan.Klik op het camerapictogram om de foto vast te leggen. Klik vervolgens op Procesanalyse boven afbeelding om door te gaan met het bouwen van het protocol. En selecteer het tabblad Analyse.Klik rechts van de afbeelding op Cellulaire analyse in De stap Analyse toevoegen en klik op Start. De afbeelding toont gemarkeerde cellen om elke afzonderlijke cel aan te geven. Klik op de selectie Opties om parameters te wijzigen om cellen beter te selecteren op basis van de fluorescentiedrempel of celgrootte.Als de imager de cellen goed telt, klikt u onder aan het scherm op Stap toevoegen. Klik op het pictogram boven aan het scherm om een experiment te maken vanuit de afbeeldingsset. En klik in het geopende venster op Procedure onder het tabblad Protocol.Selecteer Vervolgens in het nieuwe venster dat wordt geopend de optie Lezen. Klik op Volledige plaat om alleen de 60 putten te selecteren die de cellen bevatten. Klik op OK om wijzigingen op te slaan.Klik vervolgens op OK in het venster Procedure. Klik op het pictogram Afspelen om de plaat uit te voeren. Sla in de prompt het bestand op en klik vervolgens in de prompt Laadplaat op OK. Na voltooiing van de beeldvorming, download de cel tellen gegevens van de imager software programma om een spreadsheet voor analyse.Binnen twee uur na het voltooien van tdTomato imaging, beginnen met de MTT test. Weeg 25 milligram MTT af en schort het opnieuw op in vijf milliliter NSC-medium om vijf milligram per milliliter MTT-voorraadoplossing te maken. Vortex de oplossing voor enkele minuten, totdat er geen zichtbare neerslag van MTT.Verwijder celkweekplaten uit de couveuse en aspirate off cell culture medium. Verdun MTT één tot 10 in vers NSC-medium en voeg 100 microliter van de verdunde MTT toe aan elke put cellen. Incubeercellen op 37 graden Celsius gedurende twee uur.Een paarsachtige neerslag is ongeveer zichtbaar in verhouding tot het aantal cellen in de put. Aspirate de MTT oplossing van de platen, en voeg 50 microliter van 100% DMSO aan elke put. Plaats de platen op een shaker op kamertemperatuur gedurende 10 minuten bij 400 RPM.Breng de plaat daarna over naar een plaatlezer. Lees de absorptie van elke put op de vooraf ingestelde golflengte van 595 nanometer en exporteer gegevens naar spreadsheets voor analyse, precies zoals voor de gegevens van het aantal cellen. Onderzoek van tdTomato fluorescentie beelden bleek twee putten discordant voor toxiciteit tussen de MTT en cel telling test.Voor een goed, cel telling gegevens suggereerde geen toxiciteit. Maar MTT gegevens wel. Een andere put had overschat cel telling door MTT ten opzichte van tdTomato tellen, en leek te hebben grotere cellen, terwijl in putten waar MTT onderschat cel telling ten opzichte van tdTomato, de cellen bleek te zijn kleiner.Samengevat, de tdTomato test geclassificeerd 11 verbindingen als giftig, 11 als groei remmende, en een als groei te verbeteren, met 34 met geen duidelijk effect op de celgroei. De MTT-test geclassificeerd 13 verbindingen als giftig, twee als groei remmende, en een als groei te verbeteren, met 41 met geen duidelijk effect op de celgroei. De grafiek van levensvatbare cellen voor de verbinding WP1066 toont een relatief vlakke curve zonder toxiciteit voor de vier laagste concentraties.De curve valt snel bij de vijf micromolar dosis, en daalt tot bijna volledige toxiciteit op 10 micromolar, wat leidt tot de dodelijke dosis 50 als 4,4 en 6,0 micromolar voor de tdTomato test en de MTT test. Het is van cruciaal belang dat verbindingen goed worden verdund in het doseerscherm van de dosisrespons, zodat de juiste dosisresponscurve wordt gegenereerd. Verbindingen die door deze procedure worden geïdentificeerd om celgroei te beïnvloeden, kunnen verder worden gekenmerkt door functionele tests om potentieel nieuwe signaleringstrajecten te identificeren die de celgroei controleren.Verbindingen die giftig zijn voor neurale stamcellen zijn getest als potentiële therapeutische middelen voor hersenkanker, zoals glioblastoom en neuroblastoom. Draag altijd handschoenen en een labjas bij het hanteren van zoogdiercellen, DMSO en MTT. Gooi DMSO en MTT volgens de richtlijnen voor chemisch afval van uw instelling.

a-strategy-to-identify-compounds-that-affect-cell-growth-survival

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Hier beschrijven we een celgebaseerde reportergen-test als waardevol hulpmiddel om chemische bibliotheken te screenen op verbindingen die post-transcriptionele controlemechanismen moduleren die worden uitgeoefend via 3’ UTR.

High-throughput screening voor Chemische Modulators van Post-transcriptioneel gereguleerde genen

Hier documenteren we het gebruik van de zachte agar-kolonievormingstest om de effecten van een peptidylarginine deiminase (PADI) enzymremmer, BB-Cl-amidine, op de tumorigeniteit van borstkanker in vitro te testen.

Gebruik van de zachte agar Colony Formation Assay aan Remmers van tumorigeniciteit in borstkankercellen Identificeer

Geneesmiddelresistentie voor gerichte therapeutica is wijdverbreid en de noodzaak om resistentiemechanismen te identificeren - voor of na de eerste klinische verschijnselen - is essentieel voor het geleiden alternatieve klinische strategieën. Hier presenteren we een protocol te koppelen afleiding van resistente lijnen in vitro sequentiebepaling ontdekking van deze mechanismen te bespoedigen.

Invoer van<em&gt; In Vitro</em&gt; Drug Resistance Testen: maximaliseren van het potentieel voor het blootleggen van klinisch relevante resistentiemechanismen

Dit artikel beschrijft de high-throughput assay die met succes heeft bewezen grote bibliotheken van kleine moleculen te screenen op hun potentiële vermogen om cellulaire niveaus van cyclisch di-GMP manipuleren Pseudomonas aeruginosa, die een nieuw krachtig hulpmiddel voor antibacteriële geneesmiddelen en beproeving in.

Oprichting van een High-throughput Setup voor het screenen van kleine moleculen die Moduleer c-di-GMP Signalering in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Er werd een doorvoer, real-time test ontwikkeld om gelijktijdig (1) eukaryotische cel-penetrante antibiotica te identificeren die zich richten op een intracellulair bacterieel pathogeen, en (2) de cytotoxiciteit van eukaryotische cellen te beoordelen. Een variatie op dezelfde technologie werd vervolgens gecombineerd met digitale doseertechnologie om gemakkelijke, hoge resolutie, dosis-respons en twee- en driedimensionale synergiestudies mogelijk te maken.

High Throughput, real-time, Dual-uitlezing Het testen van intracellulaire antimicrobiële activiteit en eukaryote cel cytotoxiciteit

Over een breed scala van indicaties van de ziekte, meer fysiologisch relevante modellen worden ontwikkeld en uitgevoerd in drug discovery-programma's. Het nieuwe modelsysteem hier beschreven demonstreert hoe driedimensionale tumor spheroïden kunnen worden gekweekt en vertoond in een high-throughput 1536-well plaat-gebaseerd systeem om te zoeken naar nieuwe oncologie drugs.

Generatie van High-Throughput driedimensionale Tumor spheroïden voor Drug Screening

Cellulaire senescentie is de belangrijkste factor in de ontwikkeling van chronische leeftijdsgebonden pathologieën. Identificatie van therapeutische middelen die gericht zijn op senescentie cellen tonen belofte voor het verlengen van gezonde veroudering. Hier presenteren we een nieuwe assay voor de identificatie van senotherapeutica op basis van meting van senescentie geassocieerde β-galactosidase activiteit in enkelvoudige cellen.

Op SA-β-galactosidase gebaseerde screeningstest voor de identificatie van Senotherapeutische geneesmiddelen

De farmacologische targeting van ionkanalen is een veelbelovende benadering voor de behandeling van solide tumoren. Gedetailleerde protocollen worden verstrekt voor het karakteriseren van ionkanaalfunctie in kankercellen en het testen van de effecten van ionkanaalmodulatoren op de levensvatbaarheid van kanker.

Screening van ionkanalen in kankercellen

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het gebruik van een op luciferase gebaseerde reportertest in een semi-geautomatiseerd screeningsformaat met hoge doorvoer.

Celgebaseerde geneesmiddelenscreening op remmers van autofagie-gerelateerde 4B-cysteïnepeptidase

Dit protocol introduceert een fluorometrische screeningsmethodologie die geoptimaliseerd is voor het identificeren van natuurlijke product- of kleinmolecuulremmers van eiwitsynthese. De praktische bruikbaarheid maakt het geschikt voor zowel bacheloronderwijs in geneesmiddelenontdekkingstechnieken als voor implementatie in medicinale chemiecampagnes.

Een op fluorescentie gebaseerd protocol voor voorlopige screening van eiwitsyntheseremmers uit natuurlijke bronnen

Hier presenteren we een protocol om potentiële anti-tuberculose-geneesmiddelkandidaten te identificeren via fenotypische screening, waaronder de chemische synthese van een 4-aminoquinolineverbinding, het bepalen van de minimale remmende concentratie tegen Mycobacterium tuberculosis en de beoordeling van de cytotoxiciteit in zoogdiercellijnen.

Identificatie van potentiële anti-TB-kandidaten: Een stapsgewijze gids voor synthese, MIC-bepaling en cytotoxiciteitsbeoordeling in zoogdiercellen

Leer een snelle en efficiënte strategie voor het screenen van verbindingen op hun effect op celgroei in gekweekte zoogdiercellen met behulp van twee assays tegelijk. Deze methode identificeert cytotoxische stoffen en beoordeelt zowel groei-inhibitie als -versterking.

Een strategie om verbindingen te identificeren die van invloed zijn op de celgroei en overleving in gekweekte zoogdiercellen bij een lage tot matige doorvoer (Video) | JoVE Journal

Een strategie om verbindingen te identificeren die van invloed zijn op de celgroei en overleving in gekweekte zoogdiercellen bij een lage tot matige doorvoer

Meer video's verkennen