Een strategie om verbindingen te identificeren die van invloed zijn op de celgroei en overleving in gekweekte zoogdiercellen bij een lage tot matige doorvoer

Dit protocol biedt een snelle en efficiënte strategie om tegelijkertijd twee tests te gebruiken om enkele honderden verbindingen te screenen op hun effecten op de celgroei. De tests kunnen ons informatie geven over de vraag of specifieke verbindingen cytotoxisch zijn, celgroei remmen of de celgroei verbeteren. Door gebruik te maken van de twee tests samen, zijn we in staat om de nauwkeurigheid te verhogen en cytotoxische verbindingen te identificeren.

In gevallen waarin de resultaten van de twee tests uiteenlopen, kan deze strategie ons in staat stellen om verbinding te identificeren met unieke effecten op de cellulaire functie die verder kunnen worden onderzocht op andere manieren. Het belangrijkste voordeel van deze strategie is dat het snel, goedkoop en niet-arbeidsintensief is. Eenmaal onder de knie, het stelt onderzoekers in staat om gemakkelijk uit te voeren een primair scherm van maximaal 200 verbindingen in een week, en vervolgens een uitputtende dosis respons curve uit te voeren op 10 tot 15 verbindingen in een andere week.

Het aantonen van de procedure zal ikzelf en Rohini Manickam, een stafwetenschapper en post-baccalaureaat collega van het laboratorium. Ten eerste, in een biologische veiligheidskast, kweekcellen in een T75 kolf met NSC-medium, zodat ze ten minste 80% confluent bij het begin van de test. En plaats de kolf in een celkweek incubator ingesteld op 37 graden Celsius en vijf procent kooldioxide.

Zodra de cellen 80% samenvloeiing bereiken, verwijdert u de kolf uit de couveuse en haalt u het NSC-medium aan. Voeg drie milliliter celdissociatiereagenmiddel toe en incubbate gedurende vijf minuten in de couveuse. Voeg na incubatie zeven milliliter NSC-medium in de kolf toe en pipet krachtig om ervoor te zorgen dat alle cellen losraken.

Breng de gescheiden celoplossing over op een buis van 15 milliliter en vercentrifuge vijf minuten op 200 keer G. Verwijder de supernatant uit de buis en schort de cellen opnieuw op in 10 milliliter NSC-medium. Gebruik een geautomatiseerde celteller of hemocytometer om de cellen te tellen en voeg NSC-medium toe aan de buis om de concentratie cellen aan te passen tot 200.000 cellen per milliliter.

Dan, met behulp van zes van de acht sleuven van een acht kanaals multichannel pipettor plaat 100 microliter van de cel mengsel kolom door kolom in 60 binnenputten van drie 96 goed platen die zijn gecoat door extracellulaire matrix. Voeg 100 microliters basismedium of NSC-medium toe aan alle putten zonder cellen om potentiële verdamping van buitenste putten met cellen te minimaliseren. Onder een celcultuurmicroscoop, visueel inspecteren ten minste 10 putten op elk van de drie 96 put platen om te bevestigen dat de cellen zitten op de verwachte dichtheid.

Incubeer bij 37 graden Celsius en vijf procent kooldioxide. Verwijder de celkweekplaten 16 tot 24 uur na het splitsen uit de couveuse en haal nsc-middenkolom per kolom aan met een achtkanaals multi-well pipettor, met slechts zes van de acht multi-well sleuven. Voeg 95 microliter verse NSC medium toe aan elke put van de drie repliceren platen en plaats de platen terug in de couveuse.

Met een acht-kanaals multi-well pipettor, voeg 49 microliters van NSC medium in elk van het interieur 60 putten van een lege U-bottomed, V-bodem, of ronde bodem 96 put plaat. Maak de geprepareerde hoofdverzwaarplaat los. Pipette een microliter van de verbinding van de master plaat in elk van het interieur 60 putten met NSC medium, en meng de verdunde verbinding drie keer met een bank top pipettor.

Verwijder vervolgens de drie 96 putplaten nscs uit de couveuse en doseer vijf microliter van de verdunde verbinding in elke put van de drie platen die cellen bevatten om een één tot 1000 verdunning te geven voor de uiteindelijke samengestelde concentratie van 10 micromoer met een DMSO-concentratie van 0,1%Incubaatcellen met verbinding gedurende 72 uur, en ga verder met cytotoxiciteitstesten. Om dosisresponstest uit te voeren, stel een 96-put in. Gebruik Kolom Twee voor zes DMSO-controlerepliceert en test drievouden van maximaal drie verschillende verbindingen bij tweevoudige seriële verdunningen, bij zes doses, te beginnen met een hoge dosis van 10 micromolar.

Verdun vier microliters van 100%DMSO of testverbinding in DMSO tot 196 microliter van NSC-medium in een 0,5 of 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Voeg 25 microliter van de verdunde DMSO toe om putten en 50 microliter van de verdunde testverbindingen aan de bijbehorende putten te controleren. Pipette 25 microliters van NSC medium tot de resterende lege putten in het binnengedeelte van de 96 putplaat.

Met een multichannel pipettor, breng 25 microliter van de verbinding van de 10 micromolar putten naar de vijf micromolar putten, en meng ten minste vijf keer. Vervang de pipet tips, en herhaal het proces door het mengen van de resterende rijen te genereren drieledige bij tweevoudige verdunningen voor een totaal van zes doses voor elk van de verbindingen. Breng vijf microliter van elke verdunning over in een nieuwe plaat met kweekcellen die worden getest.

Plaats de plaat in de couveuse op 37 graden Celsius en vijf procent kooldioxide. Nadat cellen 72 uur zijn geïncubeerd, verwijder de plaat uit de couveuse en plaats deze in de plaatlezer. Open de imager-software om protocol- en experimentbestanden voor de studie in te stellen.

Ga naar de handmatige modus imager op Taakbeheer en klik op Nu vastleggen. Kies 96 goed plaat als het type schip. Selecteer 10 keer voor de vergroting en rood fluorescerend eiwit 531 en 593 voor beeldvorming tdTomato.

Klik op een put. Klik vervolgens op Autofocus om de afbeelding scherp te stellen en Automatisch bloot voor de juiste belichtingstijd. Pas indien nodig handmatig de scherpstelling en belichting aan.

Klik op het camerapictogram om de foto vast te leggen. Klik vervolgens op Procesanalyse boven afbeelding om door te gaan met het bouwen van het protocol. En selecteer het tabblad Analyse.

Klik rechts van de afbeelding op Cellulaire analyse in De stap Analyse toevoegen en klik op Start. De afbeelding toont gemarkeerde cellen om elke afzonderlijke cel aan te geven. Klik op de selectie Opties om parameters te wijzigen om cellen beter te selecteren op basis van de fluorescentiedrempel of celgrootte.

Als de imager de cellen goed telt, klikt u onder aan het scherm op Stap toevoegen. Klik op het pictogram boven aan het scherm om een experiment te maken vanuit de afbeeldingsset. En klik in het geopende venster op Procedure onder het tabblad Protocol.

Selecteer Vervolgens in het nieuwe venster dat wordt geopend de optie Lezen. Klik op Volledige plaat om alleen de 60 putten te selecteren die de cellen bevatten. Klik op OK om wijzigingen op te slaan.

Klik vervolgens op OK in het venster Procedure. Klik op het pictogram Afspelen om de plaat uit te voeren. Sla in de prompt het bestand op en klik vervolgens in de prompt Laadplaat op OK. Na voltooiing van de beeldvorming, download de cel tellen gegevens van de imager software programma om een spreadsheet voor analyse.

Binnen twee uur na het voltooien van tdTomato imaging, beginnen met de MTT test. Weeg 25 milligram MTT af en schort het opnieuw op in vijf milliliter NSC-medium om vijf milligram per milliliter MTT-voorraadoplossing te maken. Vortex de oplossing voor enkele minuten, totdat er geen zichtbare neerslag van MTT.

Verwijder celkweekplaten uit de couveuse en aspirate off cell culture medium. Verdun MTT één tot 10 in vers NSC-medium en voeg 100 microliter van de verdunde MTT toe aan elke put cellen. Incubeercellen op 37 graden Celsius gedurende twee uur.

Een paarsachtige neerslag is ongeveer zichtbaar in verhouding tot het aantal cellen in de put. Aspirate de MTT oplossing van de platen, en voeg 50 microliter van 100% DMSO aan elke put. Plaats de platen op een shaker op kamertemperatuur gedurende 10 minuten bij 400 RPM.

Breng de plaat daarna over naar een plaatlezer. Lees de absorptie van elke put op de vooraf ingestelde golflengte van 595 nanometer en exporteer gegevens naar spreadsheets voor analyse, precies zoals voor de gegevens van het aantal cellen. Onderzoek van tdTomato fluorescentie beelden bleek twee putten discordant voor toxiciteit tussen de MTT en cel telling test.

Voor een goed, cel telling gegevens suggereerde geen toxiciteit. Maar MTT gegevens wel. Een andere put had overschat cel telling door MTT ten opzichte van tdTomato tellen, en leek te hebben grotere cellen, terwijl in putten waar MTT onderschat cel telling ten opzichte van tdTomato, de cellen bleek te zijn kleiner.

Samengevat, de tdTomato test geclassificeerd 11 verbindingen als giftig, 11 als groei remmende, en een als groei te verbeteren, met 34 met geen duidelijk effect op de celgroei. De MTT-test geclassificeerd 13 verbindingen als giftig, twee als groei remmende, en een als groei te verbeteren, met 41 met geen duidelijk effect op de celgroei. De grafiek van levensvatbare cellen voor de verbinding WP1066 toont een relatief vlakke curve zonder toxiciteit voor de vier laagste concentraties.

De curve valt snel bij de vijf micromolar dosis, en daalt tot bijna volledige toxiciteit op 10 micromolar, wat leidt tot de dodelijke dosis 50 als 4,4 en 6,0 micromolar voor de tdTomato test en de MTT test. Het is van cruciaal belang dat verbindingen goed worden verdund in het doseerscherm van de dosisrespons, zodat de juiste dosisresponscurve wordt gegenereerd. Verbindingen die door deze procedure worden geïdentificeerd om celgroei te beïnvloeden, kunnen verder worden gekenmerkt door functionele tests om potentieel nieuwe signaleringstrajecten te identificeren die de celgroei controleren.

Verbindingen die giftig zijn voor neurale stamcellen zijn getest als potentiële therapeutische middelen voor hersenkanker, zoals glioblastoom en neuroblastoom. Draag altijd handschoenen en een labjas bij het hanteren van zoogdiercellen, DMSO en MTT. Gooi DMSO en MTT volgens de richtlijnen voor chemisch afval van uw instelling.