Biosynthese van een Flavonol van een Flavanone door het opzetten van een One-pot Bienzymatische Cascade

Met behulp van dit protocol kunnen we gemakkelijk een flink aantal flavonolen uit flavanones in één pot produceren. Deze techniek is arbeids- en tijdbesparend, zeer kosteneffectief en gemakkelijk te controleren, dus het heeft een enorm industrialisatiepotentieel. Ja, deze methode kan inzicht geven in de economische productie van andere secundaire metabolieten, maar het moet een aantal wijzigingen wanneer toegepast op het.

Hij krijgt meestal niets of zeer lage opbrengst. Mijn advies is om recombinante enzymen op ijs te behandelen en 10% glycerine toe te voegen aan de voorraadoplossing van enzymen. Dat komt omdat alleen door middel van visuele demonstratie kan een nieuwe hand begrijpen van de belangrijke details en waarheid die de succesvolle uitvoering van het experiment.

Bereid eerst buffers voor. Maak twee keer synthetische buffer door het oplossen van de juiste hoeveelheid TRIS-base, natrium ascorbaat, alfa ketoglutaric zuur in gedeïoniseerd water, en pipet passende hoeveelheid glycerol aan de oplossing. Gebruik een pipet om zoutzuur toe te voegen om de pH aan te passen aan 7.2, en pas het volume aan door gedeïoniseerd water toe te voegen.

Bewaar de twee keer synthetische buffer op vier graden Celsius voor toekomstig gebruik. Maak vervolgens een 100 keer voorraad oplossing door het oplossen van ferrosulfaat heptahydraat in gedeïsized water. Maak een voorraadoplossing van 25 millimolar flavonoïde door flavonoïde in methanol op te lossen en bewaar de oplossing bij min 20 graden Celsius.

De meest kritische stap is het opzetten van een synthetisch systeem. Om een synthetisch systeem op te zetten om een flavanol uit een flavanone te produceren, bereidt u eerst het synthetische systeem voor in een twee milliliter buis volgens de reagentia in deze tabel. Plaats de open buis in een schuddend hitteblok op 40 graden Celsius, bij 600 tpm gedurende veertig minuten.

Daarna beëindigt u de reactie door 10 microliter azijnzuur en 100 microliter ethylacetaat toe te voegen. Twee uur later, gebruik een pipet om de bovenste organische fase te oversten naar een 1,5 milliliter buis, en plaats de buis in een kap voor het drogen van de lucht op kamertemperatuur. Om TLC-analyse uit te voeren, haal je eerst de buizen uit de kap en red je het flavanoïde poeder in 160 microliters methanol in een buis.

Bereid authentieke flavonoïde monsters met seriële concentraties, door het verdunnen van de 25 millimolar flavonoïde voorraad oplossing in methanol. Laad een microliter van het rood opgeloste reactiemonster en één microliter van het authentieke flavonoïde monster op een polyamideplaat. Doe hetzelfde voor de andere concentraties van authentieke flavonoïde op dezelfde plaat.

Dan in een rookkap, zet het monster geladen plaat in een chromatografie cilinder gevuld met een oplosmiddel systeem. Bevestig de plaat aan de onderkant van de cilinder en voer de plaat gedurende 20 minuten in het oplosmiddelsysteem. De lucht droogt de platen op kamertemperatuur.

Met een spuitfles, spray de platen met 1%ethanolic oplossing van aluminiumchloride, gevolgd door het drogen van de lucht weer op kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Visualiseer de vlekken op de platen onder een UV-licht op 254 nanometer, en maak foto's, dan op de computer, open de software ImageJ. Klik op bestand, open, om de afbeelding te openen die moet worden geanalyseerd.

Klik op het meest rechthoekige selectiegereedschap links in de gebruikersinterface van ImageJ. Schets de ROI in de afbeelding met de muis en druk er op om de eerste ROI te labelen. Verplaats de rechthoekige selectie met de muis naar rechts naar de volgende ROI en druk op twee om de tweede ROI te labelen.

Herhaal dit om alle andere ROI's te labelen door op twee te drukken. Druk op drie om profielplots voor alle ROI's te genereren, in een pop-upvenster. Gebruik vervolgens het gereedschap Selectie van rechte lijn om basislijnen te laten vallen om een gesloten gebied voor elke piek van belang te definiëren.

Activeer het toverstokgereedschap door op het bijbehorende pictogram in de gebruikersinterface van ImageJ te klikken. Klik in de piek om resultaten weer te geven voor alle pieken in een pop-upvenster. Vervolgens plot teert u in Excel de grijze waarden uit het pop-upvenster op de overeenkomstige flavonoïdeconcentraties, om een op TLC gebaseerde standaardcurve van de authentieke flavonoïde te maken.

Bereken vervolgens de opbrengst van de flavonoïde van de rente geproduceerd in dit protocol, volgens de resulterende formule. Gebruik een spuit om elk monster achtereenvolgens te verwerken via een filter van 0,45 micrometer en 0,22 micrometer. Laad de monsters in een HPLC-MS-systeem door middel van zuigmond en scheid de monsters bij 30 graden Celsius met behulp van een C18-kolom.

Elute de kolom op een milliliter per minuut door een gradiënt van 10 tot 85 volume per procent acetylnitril in water, en controleer de absorptie van het eluaat van 200 tot 800 nanometer. Voer de LC-MS-analyse uit in een negatieve ionenmodus, met een drogende stikstofstroom van 10 liter per minuut bij 300 graden Celsius, in een schedegasstroom van zeven liter per minuut bij 250 graden Celsius, en verzamel gegevens met behulp van een ingebouwde software. Als u enkele golflengtechromatografieën wilt extraheren, opent u het kwalitatieve analyseprogramma en klikt u op bestand, opent u het gegevensbestand.

Selecteer het bestand dat moet worden geanalyseerd in het venster geopende gegevensbestand en klik op openen om het bestand te openen. Klik met de rechtermuisknop op de muis in het venster chromatogramresultaten en haal chromatogrammen eruit in een pop-upmenu. Klik in de tekstlijst op andere chromatogrammen.

Selecteer DAD1 in het keuzelijstje van de detector en klik vervolgens op oke om de HPLC-resultaten weer te geven in het venster met chromatogramresultaten. Klik op het handmatige integratiepictogram dat boven aan het venster met chromatogramresultaten is gekoppeld. Teken basislijn voor de piek die nodig is voor handmatige integratieanalyse met de muis.

Klik op weergave, integratiepieklijst om de resultaten weer te geven. Kopieer de resultaten van de piekgebieden naar Excel en plot een HPLC-gebaseerde standaardcurve van de authentieke flavonoïde tegen de overeenkomstige flavonoïdeconcentraties en bereken vervolgens de opbrengst van de flavonoïde van belang die in dit protocol wordt geproduceerd volgens de resulterende formule. Herhaal vervolgens dezelfde procedures om enkele golflengtechromatogrammen te extraheren om de MS-gegevens te analyseren voor de exacte massa van flavonoïdeverbindingen.

Klik op het pictogram bereik selecteren op de werkbalk van chromatogramresultaten. Selecteer de piek van belang. Klik met de rechtermuisknop op de muis in het geselecteerde bereik en klik op het extract-MS-spectrum in het pop-upmenu om de resultaten weer te geven in het venster Ms-spectrumresultaten.

Om te bepalen of dit in-vitro systeem kan worden gebruikt voor de omzetting van een flavanon in een flavonol, werd NRN toegevoegd aan het systeem. Er waren twee nieuwe plekken ontstaan op een polyamide TLC plaat. Een plek toonde een migratie afstand vergelijkbaar met die van DHK, en de anderen vergelijkbaar met die van KMF.

Nader onderzoek door HPLC en LC-MS toonde aan dat de nieuwe chemische stof een retentietijd van respectievelijk 12 minuten en 20 minuten vertoonde, in een quasi-moleculaire ionenpiek M over Z op 287 en 285 die identiek waren aan die van DHK en KMF. Om te bepalen of het systeem kan worden gebruikt voor de omzetting van andere flavanones in hun overeenkomstige flavonolen, werd ERD toegevoegd aan het systeem. Twee nieuwe vlekken op een polyamide TLC plaat vertoonden een migratieafstand die vergelijkbaar is met die van respectievelijk DHQ en QRC.

HPLC- en LC-MS-analyses toonden aan dat deze nieuwe chemische stoffen een retentietijd van respectievelijk 10 minuten en 16 minuten aan het licht brachten, en een quasi-moleculaire ionenpiek M over Z op 303 en 301, wat precies overeenkwam met die van DHQ en QRC. Bij de voorbereiding van het synthetische systeem, moet u het enzym ten slotte toevoegen en het ferrosulfaat voorlaatste toevoegen. Ja, het biedt een gids voor de economische productie van andere secundaire metabolieten.