Evaluatie van Keratinocyt proliferatie op twee - en drie - dimensional Type I collageen substraten

Deze video laat zien hoe je twee verschillende soorten celkweeksubstraten voorbereiden met behulp van collageen van type I en tweedimensionale en driedimensionale kweekmethode. De driedimensionale cultuurmethode wordt beschouwd als de biologische omgeving, waaruit blijkt hoe gemakkelijk een driedimensionaal cultuursubstraat voor te bereiden is nuttig voor studies. In tal van celtypen, ondanks het gebruik van hetzelfde collageen, celgedrag varieert aanzienlijk tussen twee-dimensionale en driedimensionale substraten.

Met behulp van driedimensionale cultuur substraat, celgedrag dat meer lijkt op die van levende organismen kan gemakkelijk worden onderzocht. Deze methode is zeer eenvoudig en vereist minimale speciale reagens. Visuele demonstratie is van cruciaal belang, want hoewel we willen aantonen dat deze methode gemakkelijk kan worden geprobeerd, is de driedimensionale gel kwetsbaar en is het erg belangrijk om er goed mee om te gaan.

Om te beginnen, de voorbereiding van de juiste cultuur medium. Om te beginnen met de voorbereiding van het collageen, plaats 10x PBS, gedeïmiseerd water, collageen, een 96-well cultuurplaat, en een lege twee-milliliter buis op ijs. Voeg met behulp van een pipet 1,12 milliliter gedeïsized water toe aan de lege buis van twee milliliter.

Voeg 200 microliter van 10x PBS toe aan het gedeïioneerde water en schud de buis meerdere keren voorzichtig. Voeg onmiddellijk voor gebruik 0,66 milliliter collageen toe aan de buis van twee milliliter. Schud de buis voorzichtig en snel meerdere keren.

Giet 100 microliter van deze collageenoplossing in elke put van de 96-put kweekplaat, om ervoor te zorgen dat het hele oppervlak van de putten te dekken. Schud de plaat voorzichtig met een beweging van links naar rechts. Broed de kweekplaat in een koolstofdioxide incubator op 37 graden Celsius gedurende een uur.

Dan kantelen van de plaat om de gelatie van het collageen te bevestigen, en verplaats de cultuurplaat naar een schone bank. Giet voorzichtig 150 microliter K110 op de gels door langs de muur van de put te pipetten. Incubeer in een koolstofdioxide incubator op 37 graden Celsius gedurende een uur.

Verplaats hierna de cultuurplaat naar een schone bank. Onmiddellijk voorafgaand aan de celcultuur, gebruik een pipet om de K110 voorzichtig weg te gooien. Gebruik eerst een pipet om vier microliter collageen toe te voegen aan 1,2 milliliter van een millimolar zoutzuur in een buis van 1,5 milliliter, en voorzichtig mengen.

Giet 100 microliter van dit collageenmengsel in elke put van een nieuwe 96-put kweekplaat. Schud de plaat voorzichtig in een beweging van links naar rechts en 1000 uur lang bij kamertemperatuur. Gooi hierna de collageenoplossing weg.

Met behulp van een pipet, was elk goed met PBS. Voeg 150 microliter van 1%BSA en PBS toe aan elke put van de kweekplaat en broed een uur lang bij kamertemperatuur uit. Gooi de 1%BSA-oplossing voor de celcultuur weg.

Om te beginnen, bereid de FEPE1L-8 cellen en de K110, trypsine, en trypsine remmer zoals beschreven in het tekstprotocol. Verwijder het medium voorzichtig uit de kweekschaal en gebruik een pipet om drie milliliter van 0,05% trypsine toe te voegen. Plaats de schotel terug in de koolstofdioxide incubator, en uitbroeden op 37 graden Celsius gedurende vijf minuten.

Gebruik vervolgens fasecontrastmicroscopie bij 10x vergroting om te controleren op celloslating van het oppervlak van de kweekschaal. Voeg drie milliliter trypsine remmer, en gebruik een pipet om de losgemaakte cellen te verzamelen in een 15-milliliter centrifuge buis. Centrifuge op 200 keer g gedurende vijf minuten.

Gooi hierna de supernatant weg en verleg de pellet in 10 milliliter K110. Gebruik fasecontrastmicroscopie bij 10x vergroting om de cellen te tellen en verdun de cellen met K110 tot een celdichtheid van 50.000 cellen per milliliter. Voorzichtig zaad 0,1 milliliter van de cel suspensie in elke put van de cultuur plaat door pipetten langs de muur van de put.

Incubeer in een koolstofdioxide incubator bij 37 graden Celsius voor de juiste tijd. Meng eerst 130 microliter tetrazoliumzout en WST-8 met 1,3 milliliter voorverwarmde K110 in een buis van twee milliliter. Verplaats de kweekplaat naar een schone bank en gebruik een pipet om de K110 voorzichtig uit de putten te gooien.

Spoel voorzichtig weg en niet-loodhoudende cellen met K110. Voeg vervolgens 110 microliter K110 gemengd met WST-8 aan elke put. Incubeer in een koolstofdioxide incubator op 37 graden Celsius gedurende twee uur.

Verplaats hierna de cultuurplaat naar een schone bank. Verzamel 100 microliter van het geconditioneerde medium van elke put, en verplaats het in de putten van een nieuwe 96-put cultuurplaat. Met behulp van een microplate-lezer meet u de absorptie op 450 nanometer en schat u het aantal levensvatbare cellen.

De celmorfologie wordt waargenomen op de niet-vezelige en fibril vormen worden hier getoond. In de eerste twee uur van het kweken, de cellen hechten en verspreiden op beide vormen van collageen. Drie dagen na het zaaien, blijven de cellen op de niet-vezelige vorm zich uitspreiden, en de celaantallen stijgen, terwijl de cellen op de fibrilvorm beperkte verspreiding tonen.

FEPE1L-8 cellen blijven zich vermenigvuldigen op de niet-vezelige vorm van type I collageen en op de onbehandelde schotel oppervlakken. In tegenstelling, de cellen niet vermenigvuldigen op de fibril vorm. Bij het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat de driedimensionale gel is zeer kwetsbaar.

Men moet ervoor zorgen dat de oplossing of tips niet in direct contact komen met de gels. Deze methode kan op tal van manieren worden gewijzigd. Bijvoorbeeld, om specimen membraan componenten te mengen, kan men een cel cultuur substraat die een kelder membraan na te bootsen.

In tal van gevallen zijn de functies van de extracellulaire matrix in levende lichamen onbekend. Om cellen op de driedimensionale cultuur te kweken, kan men de functie van extracellulaire matrixcomponent onderzoeken die meer op het levende lichaam lijkt. Door het toepassen van driedimensionale gel cultuur technieken, kan men effectief testen van de concentratie van geneesmiddelen in cellen.

Dit protocol, gebaseerd op iemands doel, kan worden gebruikt om complexe driedimensionale cultuursubstraten te ontwikkelen door andere EGM-componenten of groeifactoren te mengen tijdens gelaties.