De Elektroforese van het DNA met behulp van Thiazole oranje in plaats van ethidiumbromide of alternatieve kleurstoffen
31 maart 2019
Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van thiazole oranje voor de opsporing van DNA in gel elektroforese experimenten. Het gebruik van thiazole oranje kunt eliminatie van ethidiumbromide en fluorescentie detectie kan worden bereikt met UV of blauw licht.
Dit protocol is een eenvoudig en goedkoop alternatief voor het gebruik van ethidium bromide voor DNA-detectie tijdens elektroforese. Door het verwijderen van ethidium bromide, ofwel UV-licht of blauw licht kan worden gebruikt voor detectie. Blauw licht is niet schadelijk voor DNA, wat de kans op succes voor downstream experimenten verbetert.
Het is echt gemakkelijk om dit uit te proberen. Je hoeft alleen maar de ethidium bromide in je gels te vervangen door thiazool oranje. Om te beginnen, bereiden 1%mini-gels door het mengen van ongeveer 0,7 gram agarose in 70 milliliter tris-acetaat-EDTA of tris-borate buffers.
Los vervolgens thiazool oranje op in DMSO om een 10,000X voorraadoplossing te maken. Hoewel niet bijzonder lichtgevoelig, bewaar thiazool oranje in het donker wanneer niet in gebruik. Voor langdurige opslag, maak aliquots van de thiazool oranje-DMSO mengsel en bevriezen.
Voeg vervolgens thiazool oranje toe aan een laatste concentratie van 1,3 microgram per milliliter en magnetron het mengsel van agarosebuffer en thiazool sinaasappel om agarose ongeveer 60 seconden op te lossen. Giet het agarosemengsel in een gelgieapparaat met een geschikte kam en laat de agarose-oplossing stollen in een gel. Om de gel te laden, plaats eerst de gel in het elektroforeseapparaat, indien niet reeds aanwezig.
Voeg vervolgens TAE of TBE running buffer toe om het oppervlak van de gel te bedekken. Vervolgens, met behulp van een lading kleurstof, laden 10 microliter van een DNA-monster. Voeg een DNA-formaat ladder ter referentie.
Bevestig de hoes en elektroden, en voer de mini-gel op 100 volt tot de lading kleurstof reist ongeveer vier tot zeven centimeter voor een mini-gel. Als thiazool sinaasappel niet werd aangebracht voorafgaand aan gel gieten, vlek de gel door het onder te dompelen in de buffer met thiazool oranje met zachte agitatie voor ongeveer 20 minuten of totdat de banden volledig zijn gedetecteerd. Om de gel te visualiseren met behulp van een UV-transilluminator, verwijdert u de gel uit het elektroforeseapparaat en plaatst u deze op de UV-transilluminator.
Om de gel te visualiseren met behulp van een blauw licht transilluminator of een zaklamp, plaats de gel op de blauwe lichttransilluminator of richt de blauwe LED-zaklamp op de gel van boven of onder. Gebruik een amber emissiefilter om het blauwe licht eruit te filteren, waardoor fluorescentie uit DNA thiazool sinaasappelcomplexen kan worden gevisualiseerd en kleurstoffen kunnen worden beschermd. Voor verdere vertering of ligatie, uitgesneden gewenste DNA-banden uit de gel en ga naar het extraheren van DNA met behulp van een direct beschikbare kit of protocol.
Selecteer de juiste excitatie- en emissie-instellingen in het gel-imaging-apparaat. Bij afwezigheid van een beeldvormingssysteem met de juiste filters, plaatst u een oranje filter tussen de camera en de gel blue-light excitatiebron. Detectie grenzen zijn vergelijkbaar tussen ethidium bromide, thiazool sinaasappel, en een gemeenschappelijke blauw-licht-detecteerbare commerciële DNA-kleurstof, met de detectie limiet voor alle drie de kleurstoffen zijn een tot twee nanogram per rijstrook in een mini-gel.
Thiazole oranje gekleurde agarose gel van een beperking verteren is detecteerbaar wanneer het wordt opgewekt met een UV of een blauw licht transilluminator of met een blauw licht zaklamp. Hoewel thiazool oranje minder gevaarlijk lijkt te zijn dan ethidium bromide, moeten standaard persoonlijke beschermingsmiddelen zoals handschoenen en brillen nog steeds worden gedragen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol presenteert een eenvoudig en goedkoop alternatief voor ethidiumbromide voor de detectie van DNA in gelelektroforese. Door thiazole orange te gebruiken, kunnen onderzoekers zowel UV- als blauw licht gebruiken voor fluorescentiedetectie, wat de veiligheid van het DNA tijdens experimenten verbetert.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Biochemie
- Moleculaire biologie
- Elektroforesetechnieken
Achtergrond
- Ethidiumbromide is een veelgebruikte DNA-kleurstof, maar vormt een risico voor de DNA-integriteit.
- Thiazole orange biedt een veiliger alternatief voor de visualisatie van DNA.
- Fluorescentiedetectie kan worden gerealiseerd met onschadelijk blauw licht.
- Deze methode is kostenefficiënt en eenvoudig te implementeren.
Doel van de studie
- Om een protocol te bieden voor DNA-detectie zonder gebruik van ethidiumbromide.
- Om de effectiviteit van thiazooloranje bij gelelektroforese aan te tonen.
- Om de voordelen van het gebruik van blauw licht voor DNA-visualisatie te belichten.
Gebruikte methoden
- Bereiding van 1% mini-gels met behulp van agarose en geschikte buffers.
- Vervanging van ethidiumbromide door thiazooloranje in geleren.
- Fluorescentiedetectie met behulp van UV- of blauw licht.
- Evaluatie van de DNA-integriteit na elektroforese.
Belangrijkste resultaten
- Thiazoline oranje kleurt DNA effectief bij gel-elektroforese.
- Detectie kan veilig worden uitgevoerd met blauw licht.
- Het protocol is eenvoudig en reproduceerbaar.
- Downstream-experimenten vertonen verbeterde succespercentages dankzij verminderde DNA-schade.
Conclusies
- Thiazole orange is een levensvatbaar alternatief voor ethidiumbromide.
- Het gebruik van blauw licht minimaliseert DNA-schade tijdens de detectie.
- Deze methode verbetert de betrouwbaarheid van opeenvolgende moleculair-biologische experimenten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
DNA-gelelektroforese blijft een fundamentele workflow bij targetvalidatie en assayontwikkeling, waarbij de integriteit van het monster een directe impact heeft op de betrouwbaarheid van downstream-analyses. Het vervangen van ethidiumbromide door thiazole-oranje vermindert het genotoxische risico terwijl de detectiegevoeligheid behouden blijft, wat veiligere pipelines voor compound-screening en lead-identificatie ondersteunt. Dit stelt biopharma R&D-teams in staat om de DNA-kwaliteit te behouden voor klonering, sequencing of functionele assays zonder concessies te doen aan de doorvoer of kostenefficiëntie.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt hypothesetoetsing via DNA-fragmentanalyse mogelijk zonder het introduceren van kleurings-geïnduceerde artefacten die de bevestiging van het doelwit kunnen beïnvloeden.
- Operationele waarde: Compatibel met bestaande UV- of blauwlicht-beeldvormingsinfrastructuur, waardoor geen herontwerp van het protocol vereist is voor laboratoria die momenteel ethidiumbromide gebruiken.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt kwantitatieve DNA-bepaling van de grootte met detectielimieten van 1-2 ng/baan, ter ondersteuning van nauwkeurige fragmentanalyse bij de validatie van clonage-efficiëntie of PCR-producten.
- Operationele waarde: Elimineert de afhandeling van gevaarlijk afval en speciale afvoereisen die verbonden zijn aan ethidiumbromide, waardoor de naleving van de laboratoriumveiligheid wordt gestroomlijnd.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Behoudt de integriteit van het DNA voor downstream-applicaties zoals ligatie, transformatie of transfectie, waardoor de succespercentages bij de generering van constructen voor preklinische modellen worden verbeterd.
- Operationele waarde: Maakt visualisatie met blauw licht mogelijk, waardoor UV-geïnduceerde schade aan monsters wordt verminderd en de reproduceerbaarheid tussen herhaalde experimenten toeneemt.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode past binnen de workflow voor discovery biology, waarbij DNA-analyse bijdraagt aan targetvalidatie, leadidentificatie en de ontwikkeling van preklinische constructen, in het bijzonder bij het beoordelen van genetische modificaties of screeningsresultaten.
- Discovery Biology: Ondersteunt nauwkeurige scheiding en bepaling van de grootte van DNA-fragmenten, wat een betrouwbare beoordeling van genbewerkingen, plasmidintegriteit of PCR-amplicons tijdens de doelbevestiging mogelijk maakt.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve bandvisualisatie die essentieel is voor het evalueren van bibliotheekdiversiteit of hitbevestiging in assays op basis van nucleïnezuren.
- Analytics: Genereert vergelijkbare fluorescentie-intensiteitsgegevens over verschillende monsters, waardoor een consistente vergelijking van DNA-opbrengst of zuiverheid onder verschillende experimentele omstandigheden mogelijk is.
- Translationeel onderzoek: Behoudt de DNA-functionaliteit voor gebruik bij transfectie van zoogdiercellen of productie van virale vectoren, wat cruciaal is voor het brengen van kandidaten naar preklinische tests.
- Enterprise Reuse: Vertegenwoordigt een direct vervangbaar reagens dat gestandaardiseerd kan worden over teams en locaties zonder dat herkwalificatie van elektroforese-hardware of -software nodig is.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanische ambiguïteit door kleurstof-geïnduceerde DNA-schade te minimaliseren, wat het vertrouwen in moleculair-biologische gegevens voor doelwitbeoordeling vergroot.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van goedkope, niet-gevaarlijke thiazole orange met eenvoudige opslag (opgedeeld in aliquoten, bevroren DMSO-voorraad), waardoor de kosten voor reagentia en de veiligheidslast worden verlaagd.
- Strategische waarde: Verbetert de betrouwbaarheid van go/no-go-beslissingen door de integriteit van monsters te behouden voor downstream sequencing, klonering of functionele assays.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde voortgang door te waarborgen dat de kwaliteit van DNA-gebaseerde gegevens voldoet aan de criteria voor lead-optimalisatie en selectie van preklinische kandidaten.
Overwegingen voor de implementatie
- Expertise in moleculaire biologie met betrekking tot de bereiding van agarosegels en elektroforese.
- Standaard elektroforeseapparatuur met een UV- of blauwlicht-transilluminator en een amberkleurig emissiefilter voor detectie.
- Consistent ontdooien en mengen van bevroren thiazole orange-DMSO aliquots om een uniforme kleuring te waarborgen.
- Validatie van de kleuringsefficiëntie in verschillende modelsystemen (bijv. plasmide, genomisch DNA) bij aanpassing aan nieuwe monster-types.
- Beperking: Vereist optimalisatie van de kleuringstijd (20 min) indien post-elektforetische kleuring wordt toegepast, wat een extra stap betekent in vergelijking met methoden met gegoten gels.
