Een in vitro 3D-model en computationele pijpleiding om het Vasculogenic potentieel van door iPSC afgeleide Endotheelprogenitors te kwantificeren

Ons protocol maakt unieke inzichten in de moleculaire en bulk weefsel niveau mechanismen van vasculogenese die kunnen helpen bij de engineering functionele vasculatuur voor hart-en vaatziekten therapie in modellering. Dit protocol maakt het mogelijk om robuuste, driedimensionale vasculaire netwerken te creëren voor het evalueren van het vasculogene potentieel van verschillende platforms, en biedt ook een gratis, open source computationele pijplijn voor het analyseren van de uiteindelijke netwerktopologie. Begin met het toevoegen van 250 microliter celloslatingsoplossing per put van de D5D6 gedifferentieerde celcultuur gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius.

Gebruik aan het einde van de incubatie een P1000 pipettip om de cellen te scheiden in suspensies met één cel. Bundel de celoplossingen in een enkele conische buis van 15 milliliter voor centrifugatie. We schorten de pellet op in 200 microliters van ijskoude sorteerbuffer en labelen de cellen met vijf microliters geconcentreerde fluorescentie geconjugeerd CD34-antilichaam gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.

Aan het einde van de incubatie, was de cellen in vijf mililiter van ijskoude sorteerbuffer. Filter de suspensie door een 40 micrometer giet zeef in een vijf milliliter fluorescentie geactiveerd cel sorteren, of FACS, buis. Sorteer voor het uitvoeren van het monster een keer 10e van de vierde niet-gelabelde cellen op de fluocitometer, waarbij een gebied met een hoge fluorescentieintensiteit wordt afgesloten dat geen van de niet-gelabelde cellen bevat om als negatieve controle te dienen.

Sorteer vervolgens het gelabelde monster endotheelvererlingen die zijn afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen op basis van hun hoge CD34-expressie. Breng aan het einde van het soort de endotheelverercellen over naar een microcentrifugebuis voor centrifugatie. Voor collageenhydrogel inkapseling van de voorlopercellen schorten we de gesorteerde celpellet op in 200 microliter van Endothelial Growth Medium 2, aangevuld met 10 micromiliter van de ROCK Inhibitor Y-27632.

Voeg de cellen toe aan 400 microliter van het zaaimedium in een 1,8 mililiter microcentrifugebuis op ijs. Meng 350 microliter collageen in de celsuspensie. De oplossing wordt lichtgeel.

Meng vervolgens tien microliters natriumhydroxide van 1 muller in de collageen- en celoplossing. De oplossing wordt nu felroze. Pipette 56 microliters van deze geneutraliseerde collageenceloplossing in individuele putten van een 96 goed ultra-lage bevestiging U-bodem cel kweekplaat voor een 30-minuten incubatie bij 37 graden Celsius.

Aan het einde van de incubatie, onderzoeken de putten onder een helder veld microscoop om te controleren of de cellen gelijkmatig zijn verdeeld. Voeg vervolgens 100 microliters vers bereide Endothelial Growth Medium 2 toe, aangevuld met ROCK Inhibitor en Vascular Endotheel Growth Factor aan elke put en breng de plaat terug naar de 37 graden Celsius incubator. Voeg na een week cultuur 250 microliter van 4% paraformaldehyde toe aan een put van een 48 putplaat per hydrogel en verwijder het medium uit de hydrogels.

Gebruik vervolgens fijngepunte pincet om de hydrogels over te brengen naar het paraformaldehyde met putten. Na 10 minuten op kamertemperatuur, snel wassen de hydrogels met PBS en permeabiliseren de 3-D culturen met 250 microliters van een 0,5% niet-ionische oppervlakteactieve soort gedurende vijf minuten op kamertemperatuur. Was de hydrogels met twee wasbeurten van vijf minuten bij kamertemperatuur met 250 microliter PBS, aangevuld met 300 milliliter glycine per wasbeurt, gevolgd door de onderdompeling van elke hydrogel in 250 microliter blokkeerbuffer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.

Label de cellen met de juiste primaire antilichamen verdund in het blokkeren buffer 's nachts op vier graden Celsius, gevolgd door twee wasbeurten in 0,5%emulgerende reagens en Dulbecco's PBS. Na de tweede wasbeurt etiketteren de cellen met de juiste soortspecifieke secundaire antilichamen gedurende twee uur bij kamertemperatuur beschermd tegen licht, voordat u de 3D-culturen twee keer in 0,5% emulgeert, en Dulbecco's PBS, zoals aangetoond. Om de celkernen te visualiseren, voegt u DAPI, verdund met een concentratie van één tot 10000 in PBS, toe aan de monsters voor een incubatie van twee minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door twee wasbeurten in 0,5% emulgerende reagens en PbS van Dulbecco.

Gebruik vervolgens een pincet met fijne puntjes om elk monster over te brengen naar een geschikt kijkvat. Na differentiatie, sorteren en inkapseling in collageenhydrogels, blijven de cellen meestal 24 uur afgerond, voordat ze beginnen te migreren en de eerste lumen te vormen. Na ongeveer zes dagen van cultuur, zal een primitieve capillaire plexus zichtbaar zijn in de hydrogel wanneer bekeken met heldere veldmicroscopie.

Na beeldvorming van de vaste, gekleurde, cel beladen hydrogels op een confocale microscoop, worden de voorbewerkte beelden omgezet in een skelet dat een analyse van de totale lengte en connectiviteit van het netwerk mogelijk maakt. Het is noodzakelijk om antibiotica toe te voegen na FACS, omdat het steriliseren van het interieur van dit instrument moeilijk is, en om de antibiotica 24 uur na celinkapseling te verwijderen. Met behulp van deze techniek konden we bepalen welke fysische en chemische kenmerken extracellulaire matrix die biomaterialen nabootsen het vasculogene potentieel van afgeleide endotheelverervers van iPSC regelen.