Isolatie en kleuring van de muis huid keratinocyten voor celcyclus specifieke analyse van cellulaire eiwit expressie door massa Cytometrie

Dit protocol is belangrijk om twee belangrijke redenen. Nummer een, het stelt een gebruiker in staat om de celcyclus toestanden van huidcellen die zijn geïsoleerd van een diermodel te bepalen. Het stelt ons ook in staat om eiwitexpressie te analyseren in de discrete fasen van de celcyclus.

In vergelijking met eerdere methoden voor het bepalen van celproliferatie, onze methode maakt een meer nauwkeurige bepaling van de verschillende fasen in de celcyclus, en we kunnen ook analyseren meer dan 40 verschillende markers in de verschillende stadia van celdeling. Dit verbetert sterk de toepassing en veelzijdigheid van de methode. Dit protocol kan worden gebruikt in kankeronderzoek en bij elk ander type ziekte waar het nodig is om celcyclusspecifieke eiwitexpressiepatronen te bepalen.

Bovendien kan dit protocol worden gewijzigd in andere celtypen en in andere modelorganismen. De eerste keer gebruiker moet zich richten op het verkrijgen van de beste kwaliteit celvoorbereiding mogelijk. Dit vereist de tijdige verwerking van de experimentele huid met behulp van verse reagentia, minimale weefselvertering tijd, en zorgvuldige verwijdering van de supernatant na centrifugatie om de integriteit en de hoeveelheid cellen te behouden.

Om te beginnen ontwerp je een met metaal getagd antilichaampaneel met behulp van een gratis online paneelontwerpsoftware, zoals beschreven in het manuscript. Bereid vervolgens een IdU-voorraadoplossing voor door IdU-poeder op te lossen met 10 milligram per milliliter in 0,1 normale natriumhydroxide bij 60 graden Celsius. Na het aliquoting IdU voorraad oplossing in microcentrifuge buizen, bevriezen ze op min 20 graden Celsius voor langdurige opslag.

Pas onmiddellijk voor gebruik de pH van de IdU-oplossing aan op 7,5 met 12 normaal zoutzuur en test met een pH-strook op een teruggooi aliquot om ervoor te zorgen dat de oplossing zich op pH 7.5 bevindt. Om een twee x paraformaldehyde bevestigingsoplossing te bereiden, combineert u vijf milliliter van 10 x PBS en één milliliter van 16%PFA met 44 milliliter zuiver moleculair gedestilleerd water. Los 300,5 milligram cisplatinepoeder op in 10 milliliter DMSO.

Voor experimenten die meer dan één dag moeten worden gebruikt, moet u een cisplatinewerkoplossing van 10 millimolar voorbereiden. Weeg muizen af en bepaal vervolgens een dosis op 0,1 milligram IdU per gram lichaamsgewicht. Beheer de berekende dosis IDU door een intraperitoneale injectie en wacht twee uur voordat cellen worden geoogst.

Gebruik een chirurgische kwaliteit schaar om chirurgisch te verwijderen van het oor van de geëuthanaseerde muis eerder geïnjecteerd met IdU aan de basis van het oor. Plaats het oor op een droge petrischaal van 100 millimeter. Scheid de voorste voorzichtig van de achterste huid door fijne tangen te gebruiken om een zak in het midden of de rand van het snijgebied te creëren, trek vervolgens de twee huidflappen uit elkaar en ga verder met zowel de voorste als achterste huiden.

Plaats voorzichtig de voorste en achterste huiden van een oor in een put van een 12-well cultuurplaat, gevuld met een milliliter vers bereide dispase / collagenase oplossing, met de derma kant van de huid het aanraken van de oplossing. Incubeer op 37 graden Celsius gedurende een uur om de huid te verteren. Plaats het verteerde oor of neonatale huid in een schone petrischaal met de opperhuid kant het aanraken van het oppervlak van de schotel.

Met behulp van tangen, plat uit de huid en zachtjes schuif de dermis uit de opperhuid door te werken van het centrum naar de randen in een cirkelvormig patroon. Met tangen, pak de opperhuid aan de randen en til het voorzichtig af door het van het oppervlak van de petrischaal te pellen. Plaats de opperhuid voorzichtig op de voorverwarmde cellossingsoplossing in een put van een plaat.

Vijf minuten lang incubeer maken bij 37 graden Celsius of 20 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik steriele tangen om de opperhuid te grijpen en te schrobben door de opperhuid tegen de bodem van de schotel te slepen om cellen te scheiden. Voeg een milliliter DMEM met 1%FBS toe en ga door een celzeef van 40 micrometer in een opvangbuis.

Spoel goed met nog eens twee milliliter DMEM en voeg toe aan de celsuspensie. Na het centrifugeren op 120 keer g gedurende vijf minuten, zorgvuldig aanzuigen van de supernatant. Resuspend de cel pellet in een tot twee milliliter van DMEM met 1%FBS, en pellet de cellen weer zoals voorheen.

Om cellen te labelen om levende en dode cellen te bepalen, wordt één tot drie miljoen cellen opnieuw opgetrokken in één milliliter DMEM met 25 micromolar cisplatine en incubate gedurende één minuut. Blus door te pipetten met een gelijk volume FBS. Na het centrifugeren op 120 keer g gedurende vijf minuten, decanteren de supernatant in een beker met verdund bleekmiddel, en omkeren de buizen om de resterende oplossing drain op een papieren handdoek.

Resuspend de cel pellet in twee milliliter barium kation-vrije PBS, en centrifuge ze opnieuw zoals eerder beschreven. Om de cellen te repareren, resuspend de cel pellet in een milliliter van barium kation-vrij PBS. Vortex de cellen onder continu laag vermogen en voeg een milliliter van de twee x PFA fixatie buffer drop-wise.

Plaats op een schommelplatform en broed 10 minuten op kamertemperatuur. Na het centrifugeren op 500 keer g gedurende vijf minuten, voorzichtig decanteren de supernatant. Was de cellen met twee milliliter bariumvrije PBS, centrifuge opnieuw onder dezelfde omstandigheden en herhaal de wasstap.

Tot slot, resuspend de pellet in twee milliliter barium kation-vrij PBS. Centrifugeer de cellen op 500 keer g gedurende vijf minuten en decanteer de supernatant voorzichtig. Resuspend de cellen in een milliliter van een x fixatie buffer, en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en herhaal de centrifugatie.

Om de cellen te wassen, voeg een milliliter barcode permeabilisatie buffer. Bereid tijdens celcentrifugatie op 500 keer g gedurende vijf minuten barcodes door 100 microliters barcodepermeabilisatiebuffer aan hen toe te voegen en meng ze onmiddellijk. Resuspend de cel pellet in 800 microliters van barcode permeabilisatie buffer.

Voeg barcodeoplossing toe aan de cellen, meng en broed gedurende 30 minuten op kamertemperatuur. Centrifuge op 500 keer g gedurende vijf minuten. Was cellen in twee milliliter van cel vlekken buffer en centrifuge weer.

Vervolgens, resuspend een tot drie miljoen cellen in een milliliter van nucleaire antigeen kleuring buffer werken oplossing, en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Na het centrifugeren op 500 keer g gedurende vijf minuten, voorzichtig decanteren de supernatant. Resuspend de cellen in een milliliter van nucleaire antigeen kleuring permeabilisatie buffer en centrifuge weer.

Na herhaalde resuspensie en centrifugatie, resuspend de celpellet in het resterende volume met zachte vortexing. Voeg 50 microliter intracellulaire antilichaamcocktail toe, meng en broed gedurende 45 minuten op kamertemperatuur. Voeg twee milliliter celvlekken buffer.

Centrifuge opnieuw onder dezelfde omstandigheden als in de vorige stap, en verwijder de supernatant. Resuspend de pellet in twee milliliter van cel vlekken buffer, centrifuge op 500 keer g gedurende vijf minuten, en herhaal de resuspending en centrifugatie. Resuspend de cellen in een milliliter van intercalatie oplossing, en op te slaan voor een tot drie dagen op vier graden Celsius.

Na het centrifugeren van de cellen opnieuw, was de pellet met twee milliliter cel vlekken buffer, centrifuge onder dezelfde omstandigheden, en voer twee extra wasbeurten met twee milliliters water, met dezelfde centrifugatie. Resuspend de cel pellet op een concentratie van een miljoen cellen per milliliter met verdunde EQ kraal oplossing, en voer vervolgens de monsters op de massa cytometer. De verwachte celopbrengsten en levensvatbaarheid van volwassen muizenoor en neonatale huid worden bepaald.

De geschatte opbrengst is afhankelijk van het oppervlak van de huid. Neonatale huid is een betere keuze voor experimenten die grotere aantallen cellen vereisen. De basisgating strategie om te selecteren voor intacte, enkele en levensvatbare cellen, na normalisatie en deconvolutie van barcoded massa cytometrie gegevens, wordt getoond.

Het percentage levensvatbare cellen kan wijzen op de kwaliteit of conditie van de cellen voorafgaand aan het bevlekken. Verschillen in levensvatbaarheid tussen gekweekte carcinoomcellen versus geïsoleerde muis oorcellen worden getoond, ook. Levensvatbare cellen werden gated op gebeurtenislengte versus CD45 om hematopoietische cellen uit te sluiten.

De opname van afstammingmarkers maakt de selectie van celpopulaties van belang in verschillende celcyclusfasen mogelijk. Het basiscelcyclusprofiel wordt verkregen door de detectie van BrdU versus PI in fluorescerende stroomcytometrie. Echter, opname van andere proliferatie markers met massa cytometrie, maakt een meer nauwkeurige identificatie van celcyclus fasen.

Volgens deze benadering kunnen celcyclusprofielen worden geconstrueerd voor verschillende celtypen of experimentele omstandigheden, zoals de profielen voor CD45-negatieve versus CD45-positieve cellen uit hetzelfde experiment. In een ander voorbeeld, analyse van markers die de EGFR en mTOR PI3K signalering trajecten in de G-one fase te definiëren, bleek soortgelijke expressie profielen in CD45 negatieve cellen, weergegeven in oranje, en CD45 positieve cellen, weergegeven in blauw. Massacytometrie vereist veel cellen van hoge kwaliteit.

Als een gebruiker geïnteresseerd is in een zeldzame celpopulatie, kunnen hogere aantallen cellen nodig zijn. Geïsoleerde levende cellen kunnen worden gebruikt voor DNA- of RNA-analyse, biochemische studies, of kunnen worden gebruikt in de weefselkweek voorafgaand aan de fixatie en kleuring voor massacytometrie. De gebruiker moet persoonlijke beschermingsmiddelen en een veiligheidskast gebruiken wanneer dat nodig is, wanneer hij werkt met paraformaldehyde, zoutzuur of natriumhydroxide.