Menselijke Colonoid Monolayers studie van interacties tussen ziekteverwekkers, Commensals en Host intestinaal epitheel

3D-darmorganoïde cultuur beperkt de studie van gastheer epitheliale-pathogene interactie, omdat het lumen niet direct toegankelijk is voor bacteriën of virulentiefactoren. Bovendien kunnen uitgescheiden materialen zoals kleine moleculen, eiwitten of slijm niet gemakkelijk worden bemonsterd uit de 3D-cultuur voor downstream-analyse. Om deze beperkingen aan te pakken, presenteren we een aangepast protocol voor het omzetten van 3D menselijke enteroïden of colonoïden naar een monolayer.

Colonoïde monolagen scheiden een dikke, apicale slijmlaag af, waardoor ex vivo-studies van pathogene slijminteractie mogelijk zijn. Deze methode is bedoeld om een tractable model te bieden om de vroegste darmhost-pathogene interacties bij infectie te bestuderen. Colonoïde monolagen zal zorgen voor een nieuwe manier om slijm biologie te bestuderen, die belangrijk is in gastheer-pathogen interactie, microbioom studies, en inflammatoire darmziekte.

Deze methode kan worden toegepast op andere slijm-afscheidende organen zoals de bovenste GI-darmkanaal, ademhalingssysteem, en vrouwelijke reproductieve systeem. Visuele demonstratie zal de gebruiker helpen met slijm behoud tijdens monolayer groei en tijdens fixatie voor immunostaining. Het aantonen van de procedure zal Karol Dokladny zijn, een stafwetenschapper van ons laboratorium.

Na het uitbroeden van de gecoate celcultuur, aspirate het cultuurmiddel van de 24-put plaat en vervang door één milliliter ijs-koude oogstende oplossing per goed. Gebruik een mini-cel schraper te verjagen en breken de kelder membraan matrix pellet. Besteed bijzondere aandacht aan alle materialen in de buurt van de put randen.

Vervolgens roer de plaat op een orbitale shaker op ongeveer 200 omwentelingen per minuut bij vier graden Celsius gedurende 30 tot 45 minuten. Gebruik een P200 single channel pipet voorzien van steriele filter tips om de cel suspensie triturate. Lever de celsuspensie af in een conische flaconische flaconale van 15 milliliter.

Gebruik meerdere flesjes als het totale suspensievolume groter is dan zes milliliter. Voeg daarna in de flacon een gelijk volume van Advanced DMEM/F12 medium toe dat 10 millimolar HEPES, L-alanyl-L-glutamine dipeptide en penicilline-streptomycine bevat. Dit is het wasmiddel.

Keer de flacon drie tot vier keer om te mengen. Centrifuge op 300 keer g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Voorafgaand aan de celbeplating, equilibrate de gecoate inserts in een weefsel cultuur incubator voor ten minste 30 minuten.

Voor elke insert te worden verguld, warm een milliliter expansiemedium in een 37-graden-Celsius waterbad en voeg twee remmers. Voeg vervolgens het mengsel toe aan de putten. Spoel het wasmiddel aan uit de buis met de celpellet en vervang het door expansiemedium met een volume dat voldoende is om ten minste 100 microliter per wisselplaat en resuspend op te leveren.

Vervolgens, aspirate de collageen IV oplossing van elke insert en was twee keer met 150 microliters van het wasmedium per insert. Pipette 600 microliters van expansiemedium in de ruimte onder elke wisselplaat. Pipette 100 microliter van celsuspensie van de flacon in elke insert.

Breng de plaat terug naar de weefselkweek incubator en laat minstens 12 uur ongestoord. Vermijd het schudden of scherp kantelen van de plaat. Na het uitbroeden, plaats de plaat op een fase contrast lichtmicroscoop met een 2,5 keer tot 10 keer objectief lens.

Vernieuw met kweekmedium zonder remmers om de remmingsbehandeling te staken. Blijf het medium elke twee tot drie dagen vernieuwen tot confluent. Til de celcultuur inzetstukken van de 24-put plaat met fijngepuntige tang of pincet.

Voorzichtig omkeren op een laboratorium tissue papier om het apicale medium te verwijderen en veeg externe vloeistof vastklampen aan de insert. In een nieuwe 24-put plaat, dompel de inzetstukken in een een tot drie oplossing van glaciale azijnzuur en absolute ethanol gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Vervolgens, op de bank, omkeren van de insert op tissue papier om de fixatieve te verwijderen.

Plaats de wisselplaten in een plastic container gevuld met 1X PBS gedurende 10 minuten om de cellen te hydrateren voordat u verdergaat met standaard immunostaining protocollen. Om te behouden, gebruik een scheermesje te snijden rond de omtrek van de insert membraan. Breng het membraan met behulp van tangen over op een glazen microscoopdia.

Voeg vervolgens het montagemedium toe en breng een afdekglas aan. In dit experiment worden menselijke enteroïde en colonoïde culturen gekweekt als 3D-structuren, vervolgens gescheiden en gefragmenteerd voor beplating op menselijke collageen-IV-gecoate celkweek inserts. De voortgang van monolagenvorming wordt dagelijks gemonitord via heldere veldmicroscopie en immunofluorescentiekleuring.

Colonoïde fragmenten gezaaid op mens-collageen-IV-gecoate filters vormen een meervoudige monolaag eilanden twee tot vier dagen na het zaaien. Zowel de projectie met maximale intensiteit als de confocale optische Z-sectie met de overeenkomstige orthogonale projecties tonen aan dat celvrije gebieden herkenbaar zijn aan de afwezigheid van zowel nucleaire als apicale F-actine-vlekken. Een confluent colonoid monolayer met ononderbroken apicale oppervlakte werd ontdekt door F-actin immunostaining ongeveer één week na het zaaien.

Hoge vergroting van een representatieve projectie met maximale intensiteit en confocale optische sectie met de bijbehorende orthogonale projecties tonen aan dat cellen in samenvloeiende colonoïde monolagen de F-actin perijunctional ringen en een onrijpe apicale borstelrand vormen. EdU-integratie toont een progressief verlies van proliferatie aan tijdens jejunale monolaagdifferentiatie. Ongedifferentieerde jejunale monolagen hebben bredere, kortere cellen en een minder volwassen apicale actine-gebaseerde penseelrand in vergelijking met jejunale monolagen na vijf dagen van differentiatie.

Het fragmenteren van de colonoïden is van cruciaal belang. Als de fragmenten te groot zijn, zullen ze niet hechten aan de gecoate filter, maar zal in plaats daarvan hervorming in een 3D-colonoïde. We presenteerden een aangepaste methode om slijmbiologie te bestuderen op colonoïde monolagen.

Andere host-pathogene studies kunnen worden uitgevoerd om te kijken naar de interactie tussen de ziekteverwekker en het darmapicale oppervlak.