Een gids voor het bouwen van een sterk geneigd geveegd tegel Microscoop voor uitgebreide veld-of-view Single-molecuul Imaging

Onze methode stelt ons in staat om enkele moleculen te visualiseren met een 40 keer groter beeldgebied dan conventionele methoden, en heeft een sterk verminderd achtergrondsignaal. In tegenstelling tot andere technieken onze aanpak maakt gebruik van een enkele objectieve lens, vereist geen speciale steekproef kamer, en het is gemakkelijk compatibel met commerciële microscoop systemen. Na het verzamelen van de nodige componenten beginnen met het bouwen van het systeem.

Hier zijn al verschillende elementen op de bank. Gemonteerd op een aluminium blok is een microscoop lichaam met een Piëzo stadium en monster houder. Ook op de bank zijn drie lasers en optische elementen om de balken te combineren.

De gecombineerde balken zijn gekoppeld aan een enkele modus vezel zo efficiënt mogelijk. Als laatste voorstap, monteer een collimated lichtbron in een kooisysteem. Dit heeft een tijdelijke coherente lichtbron aangesloten op een enkele modus vezel, een vezel adapter, achromatische lens en iris.

Begin met werken met het detectiepad. Plaats eerst de verzamelde lichtbron in de objectieve poort van het microscooplichaam. Pas de spiegel onder de doelstellingen, zodat de output balk is ongeveer horizontaal en uitgelijnd met de gaten van de bank.

Steek een dichroic spiegel in de straal pad en weerkaatsen de balk door 90 graden. Voeg spiegels toe om het pad van de verzonden straal aan een sCMOS-camera af te stellen. Gebruik de spiegels om ervoor te zorgen dat de balk het midden van de chip raakt.

Vervolgens steek je een 300-milliliter brandpuntsafstandbuislens over een brandpuntsafstand van de camera. Verwijder de verzamelde lichtbron uit het microscooplichaam. Pas vervolgens de positie van de buislens aan om het brandpuntsvlak in te stellen.

Stop de aanpassingen wanneer de camera het patroon aan het plafond duidelijk oplost. Het detectiepad wordt in dit schema weergegeven. Let op de toevoeging van een multi-band pass filter voor de buis lens voor multicolor fluorescentie imaging.

Terug naar het microscooplichaam. Installeer daar de verzamelde lichtbron opnieuw in de objectieve houder. Na de dichroic spiegel, plaats een vouw-spiegel in het pad van de gereflecteerde balk om het te leiden door 90 graden.

Verwijder de verzamelde lichtbron uit het microscooplichaam en plaats deze in de buurt. Plaats vervolgens een brandpuntsafstandlens van 400 millimeter met ongeveer een brandpuntsafstand van de spiegel. Bij de microscoop installeert het lichaam de objectieve lens.

Stel vervolgens de positie van de spiegel langs de optische as aan. Observeer het plafond boven het doel en stop wanneer daar een perfect luchtig schijfpatroon wordt gevormd. Verwijder nu het doel en installeer de verzamelde lichtbron opnieuw met een open iris.

Bepaal waar langs het balkpad de balk het kleinst is op ongeveer 400 millimeter afstand van de spiegel. Zodra het punt is geïdentificeerd, monteer er een spiegel, een geconjugeerd beeldvlak. De status van de set-up op dit punt wordt weergegeven in dit schema.

De zojuist toegevoegde spiegel is gelabeld M5. Steek een andere spiegel om de balk 90 graden reflecteren en monteer een 150-millimeter brandpuntsafstand lens erachter. De lens moet 150 millimeter van het geconjugeerde beeldvlak zijn. Neem vervolgens tijdelijk de eerste lens in het excitatiestraalpad weg.

Met deze configuratie vind je de brandpuntspositie van de tweede lens. Plaats een enkele as galvo spiegel op dit brandpunt als een geconjugeerde rug brandpuntsvlak. Lever nul volt aan de galvospiegel en draai de houder zo dat deze de balk 90 graden weerkaatst.

Plaats vervolgens langs het balkpad een vouwspiegel die de balk op 90 graden reflecteert. Plaats de lens 100 millimeter langs het balkpad vanaf het geconjugeerde achterbrandpuntsvlak. Verwijder nogmaals de verzamelde lichtbron uit de microscoophouder.

Voeg nog een 100-millimeter collimatielens met een vezeladapter en single mode vezel samen met een iris. Gebruik vervolgens de iris, vezel en lens om een collimated beam door het beeldvormingssysteem te sturen. Steek vervolgens een cilindrische lens van brandpuntsafstand 400 millimeter net voor de laatste collimatielens in het bundelpad.

Gebruik het om de balk scherp te stellen. Plaats een 50-millimeter cilindrische lens 450 millimeter voor de eerste. Dit is een schematische weergave van de uiteindelijke setup met zowel de detectie- als excitatiepaden.

De output van de drie lasers wordt gekoppeld aan het pad door de single mode vezel. Voor het testen bereiden van een 3D hydrogel monster. Deze bestaat uit 20 nanometer karmozijnrode kralen vermengd met hydrogel.

Op de installatieplaats het hydrogelmonster in de monsterhouder. Voor monster excitatie zet de 638-nanometer laser en pas zijn vermogen aan minder dan een milliwatt. Stel de camerabesturingssoftware in de interne triggermodus in en leg video vast.

Op dit punt de galvo motor heeft nul volt toegepast. Plaats de camera zo dat het beeld zich in het midden van de lens bevindt. Pas vervolgens de spiegel aan die het afbeeldingsvlak van de conjugaat is.

Draai de horizontale knop op de spiegel om een zeer hellende verlichting te bereiken. Neem de tegelafbeelding op zoals in het monsterfluorescentiebeeld van 3D hydrogel met kralen van 20 nanometer. De schaalbalk is 20 micrometer.

Ga verder na het instellen van hardware en software om de galvo spiegel te vegen. Dit is de galvo mirror sweep software voor de setup. Zorg voor volledige field-of-view beeldvorming door Vmin in te stellen op min 500 millivolt.

Stel Vmax dan in op 500 millivolt. Schakel vervolgens over naar de camera-acquisitiesoftware. Selecteer Extern in de triggermodus.

Klik onder de vervolgkeuzelijst LightScan PLUS de optie Volgende omlaag op Snelheidbesturingselement scannen. Bepaalde controleparameters kunnen nu worden ingesteld. Voer onder Vensterhoogte 180 rijen in.

Voer onder Belichting 28 milliseconden in. Wanneer u klaar bent, keert u terug naar de spiegelbesturingssoftware. In de mirror control software schakelaar op 3D-stacks AAN. Geef het aantal stapels en de stapgrootte op.

Klik op video maken om te beginnen met het opnemen van beelden. Dit is een voorbeeld van Epi beeldvorming van enkelstrengs gelabeld DNA. Daarentegen, de zeer geneigd geveegd tegel techniek geproduceerd dit beeld.

De HIST afbeelding toont minder achtergrond in vergelijking met de Epi beeld. Het DNA zit in een 3D hydrogel, en de excitatiegolflengte is 638 nanometer. Hier is een Epi beeld van gelabeld eukaryotische vertaling rek factor 2.

Het HIST-beeld heeft een verbeterde signaal-achtergrondverhouding. Het heeft ook meer uniforme verlichting. Beide hebben dezelfde verlichtingskracht van 7,5 milliwatt.

De beeldsnelheden waren beide 2,5 frames per seconde. Het is belangrijk om constant een hoge hellingshoek te houden en de veegspiegel te synchroniseren met de uitlezing van de camera. Dit garandeert een hoge signaal-achtergrond verhouding tijdens het verwerven van afbeeldingen.

We verwachten dat HIST-microscopie verschillende toepassingen ten goede zal komen, waaronder beeldvorming met superresolutie op diepere beeldvormingsdiepten en profielprofiel van genexpressie met hoge doorvoer in dikke weefsels.