Hoge doorvoer Tractiekracht microscopie met behulp van PDM'S onthult dosisafhankelijke effecten van het transformeren van groei factor-β op de epitheliale-naar-mesenchymale overgang

Mijn lab is geïnteresseerd in mechanobiologie, die onderzoekt hoe cellen uitoefenen en worden beïnvloed door mechanische krachten. Een manier waarop we mechanobiologie kunnen kwantificeren is celcontractiliteit meten. In aanhangende cellen manifesteert contractiliteit zich in tractiekrachten die op het celsubstraat worden uitgeoefend. We kwantificeren deze krachten met behulp van een methodologie die in het algemeen aangeduid wordt als traction force microscopie of TFM. En TFM's geïmplementeerd in een breed scala van verschillende methoden, maar een gemeenschappelijk aspect is dat het een nogal seriële en trage lab techniek meestal gedaan in een enkel gerecht als dit hier. Dit beperkt ons tot de evaluatie van een populatie of aandoening tegelijk. In de cel cultuur werd enige tijd geleden verbeterd, maar het creëren van multiwell gerechten en we dachten, zou het niet geweldig zijn we konden TFM met dezelfde verhoogde doorvoer en dezelfde efficiëntie van tijd en reagentia? En dit was onze oplossing. Dus creëerden we een 96 goed tractie kracht schotel. En het lijkt erg op een conventionele 96 goed weefsel cultuur schotel, maar met dit gerecht kunnen we niet alleen onderzoeken 96 verschillende celcultuur voorwaarden, maar ook kwantificeren hun cel contractiliteit. Dit presenteert een veel hogere doorvoeroplossing dan single dish benaderingen, waardoor we diverse celomstandigheden en contractiele reacties kunnen onderzoeken. Tijdens kankermetastase reizen kankercellen van hun primaire locatie naar secundaire locaties, waarbij de ziekte in ons lichaam wordt verspreid. Dit gemetastaseerd gedrag van kankercellen is goed voor 90% van de kankergerelateerde dood. Een van de voorgestelde mechanismen voor epitheliale kankercellen om een meer migrerende en invasieve fenotype te verwerven is epitheliaal-mesenchymale overgang, EMT. Tijdens EMT worden ze meer migratie en invasief, wat hun fysieke gedrag verandert. Om deze veranderingen in fysiek gedrag beter te begrijpen, gebruiken we ons zachte siliciumsubstraat om veranderingen in contractiliteit van muizenpoezogelijke kliercellen te meten met EMT-inductie door TGF-In deze studie onderzochten we hoe verschillende concentraties en incubatietijd van TGF-invloed hebben op het fysieke gedrag van cellen. Polydimethylsiloxane is een zeer compatibel rubber met de laagste Young's modulus van ongeveer 0,6 kilopascal. De stijfheid van dit materiaal kan ook tunable met behulp van verschillende concentraties van crosslink agent met inbegrip van SYLGARD 184.To meten mechanische eigenschappen van PDMS gebruiken we een rheometer. Na het mengen van deel A en deel B van het PDMS, in een gewichtsverhouding van één op één en het toevoegen van het uithardingsmiddel met het opgegeven gewichtspercentage, laadt u de bereide batch op de rheometerplaat. Zorg ervoor dat u voldoende van het monster laadt om het asgebied volledig af te dekken. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de as raakt het monster volledig met geen vrije ruimte links op de rand. Elk extra monster moet zorgvuldig worden bijgesneden en van de plaat worden afgeveegd. Meet de uiteindelijke opslagmodulus en tijdafhankelijkheid van de viscoelasticiteit van elk monster door tijd- en frequentie sweeps te doen bij een oscillatory shear strain van 0,5%Newsha]Deze grafiek is een voorbeeld van de tijd seq-test, die heeft gedaan om rheologisch gedrag van polydimethylsiloxane te meten met toegepaste oscillatory shearstam van 0,5% en temperatuur van 100