Hoge doorvoer Tractiekracht microscopie met behulp van PDM'S onthult dosisafhankelijke effecten van het transformeren van groei factor-β op de epitheliale-naar-mesenchymale overgang
1 juni 2019
We presenteren een hoge doorvoer tractiekracht assay gefabriceerd met silicone rubber (PDMS). Deze nieuwe assay is geschikt voor het bestuderen van fysieke veranderingen in cel contractiliteit tijdens verschillende biologische en biomedische processen en ziekten. We demonstreren het nut van deze methode door het meten van een TGF-β afhankelijke toename van de contractiliteit tijdens de epitheel-naar-mesenchymale overgang.
Mijn lab is geïnteresseerd in mechanobiologie, die onderzoekt hoe cellen uitoefenen en worden beïnvloed door mechanische krachten. Een manier waarop we mechanobiologie kunnen kwantificeren is celcontractiliteit meten. In aanhangende cellen manifesteert contractiliteit zich in tractiekrachten die op het celsubstraat worden uitgeoefend. We kwantificeren deze krachten met behulp van een methodologie die in het algemeen aangeduid wordt als traction force microscopie of TFM. En TFM's geïmplementeerd in een breed scala van verschillende methoden, maar een gemeenschappelijk aspect is dat het een nogal seriële en trage lab techniek meestal gedaan in een enkel gerecht als dit hier. Dit beperkt ons tot de evaluatie van een populatie of aandoening tegelijk. In de cel cultuur werd enige tijd geleden verbeterd, maar het creëren van multiwell gerechten en we dachten, zou het niet geweldig zijn we konden TFM met dezelfde verhoogde doorvoer en dezelfde efficiëntie van tijd en reagentia? En dit was onze oplossing. Dus creëerden we een 96 goed tractie kracht schotel. En het lijkt erg op een conventionele 96 goed weefsel cultuur schotel, maar met dit gerecht kunnen we niet alleen onderzoeken 96 verschillende celcultuur voorwaarden, maar ook kwantificeren hun cel contractiliteit. Dit presenteert een veel hogere doorvoeroplossing dan single dish benaderingen, waardoor we diverse celomstandigheden en contractiele reacties kunnen onderzoeken. Tijdens kankermetastase reizen kankercellen van hun primaire locatie naar secundaire locaties, waarbij de ziekte in ons lichaam wordt verspreid. Dit gemetastaseerd gedrag van kankercellen is goed voor 90% van de kankergerelateerde dood. Een van de voorgestelde mechanismen voor epitheliale kankercellen om een meer migrerende en invasieve fenotype te verwerven is epitheliaal-mesenchymale overgang, EMT. Tijdens EMT worden ze meer migratie en invasief, wat hun fysieke gedrag verandert. Om deze veranderingen in fysiek gedrag beter te begrijpen, gebruiken we ons zachte siliciumsubstraat om veranderingen in contractiliteit van muizenpoezogelijke kliercellen te meten met EMT-inductie door TGF-In deze studie onderzochten we hoe verschillende concentraties en incubatietijd van TGF-invloed hebben op het fysieke gedrag van cellen. Polydimethylsiloxane is een zeer compatibel rubber met de laagste Young's modulus van ongeveer 0,6 kilopascal. De stijfheid van dit materiaal kan ook tunable met behulp van verschillende concentraties van crosslink agent met inbegrip van SYLGARD 184.To meten mechanische eigenschappen van PDMS gebruiken we een rheometer. Na het mengen van deel A en deel B van het PDMS, in een gewichtsverhouding van één op één en het toevoegen van het uithardingsmiddel met het opgegeven gewichtspercentage, laadt u de bereide batch op de rheometerplaat. Zorg ervoor dat u voldoende van het monster laadt om het asgebied volledig af te dekken. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de as raakt het monster volledig met geen vrije ruimte links op de rand. Elk extra monster moet zorgvuldig worden bijgesneden en van de plaat worden afgeveegd. Meet de uiteindelijke opslagmodulus en tijdafhankelijkheid van de viscoelasticiteit van elk monster door tijd- en frequentie sweeps te doen bij een oscillatory shear strain van 0,5%Newsha]Deze grafiek is een voorbeeld van de tijd seq-test, die heeft gedaan om rheologisch gedrag van polydimethylsiloxane te meten met toegepaste oscillatory shearstam van 0,5% en temperatuur van 100
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een high-throughput traction force assay vervaardigd uit siliconenrubber (PDMS), ontworpen om fysieke veranderingen in de celcontractiliteit tijdens diverse biologische processen te onderzoeken. Het nut van de methode wordt aangetoond door de meting van TGF-β afhankelijke toenames in contractiliteit tijdens de epitheliaal-mesenchymale transitie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Celbiologie
- Biomechanica
- Biomedische techniek
Achtergrond
- Celcontractiliteit is cruciaal in diverse biologische processen.
- Inzicht in veranderingen in de contractiliteit kan aanwijzingen geven over ziekten.
- Traditionele methoden kunnen tekortschieten in doorvoersnelheid en gevoeligheid.
- PDMS is een veelzijdig materiaal voor het creëren van assays.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een high-throughput assay voor het meten van celcontractiliteit.
- Het beoordelen van de impact van TGF-β op de contractiliteit tijdens de epitheliale-naar-mesenchymale transitie.
- Het bieden van een betrouwbare methode voor het bestuderen van celgedrag onder verschillende omstandigheden.
Gebruikte methoden
- Fabricage van een tractiekrachtmeting met behulp van PDMS.
- Meting van de celcontractiliteit als reactie op TGF-β.
- High-throughput analyse voor de evaluatie van meerdere monsters.
- Beoordeling van de dynamiek van de epitheliale-mesenchymale transitie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle meting van veranderingen in de contractiliteit van cellen.
- Aangetoonde TGF-β afhankelijke toenames in contractiliteit.
- Validatie van het nut van de op PDMS gebaseerde assay.
- Inzichten geboden in de mechanica van celtransitieprocessen.
Conclusies
- De PDMS-tractiekrachtassay is effectief voor het bestuderen van celcontractiliteit.
- Een toename van de contractiliteit tijdens de epitheliaal-mesenchymale transitie werd bevestigd.
- Deze methode kan worden toegepast in diverse biologische en biomedische studies.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Dit high-throughput platform voor tractiekrachtmicroscopie maakt een kwantitatieve beoordeling van de cellulaire contractiliteit in een schaalbaar formaat mogelijk, wat mechanistische risicoreductie in vroege discovery-fasen ondersteunt. Door TGF-β-geïnduceerde epitheliale-naar-mesenchymale transitie te koppelen aan meetbare biofysische veranderingen, biedt de methode voorspellende waarde voor targetvalidatie in onderzoek naar fibrose en metastase. Het op PDMS gebaseerde systeem biedt reproduceerbaarheid en compatibiliteit met bestaande multi-well workflows, wat het hergebruik binnen de organisatie over discovery biology- en assay-ontwikkelingspipelines verbetert.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar TGF-β als modulator van cellulaire contractiliteit tijdens EMT mogelijk, ter ondersteuning van het testen van doelhypothesen.
- Operationele waarde: Levert dosisafhankelijke en tijdopgeloste contractiliteitsgegevens om mechanistische doelwitten in fibrose- en kankerroutes te prioriteren.
- Predictieve waarde: Kwantificeert biofysische fenotypen die gekoppeld zijn aan EMT, wat helpt bij de preklinische selectie van doelwitten en het verminderen van risico's in signaalroutes.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantitatieve, substraat-onafhankelijke contractiliteitsmetingen voor assay-standaardisatie in mechanobiologische screening.
- Operationele waarde: Compatibel met 96-wells formaten, wat parallelle screening van verbindingenbibliotheken of cytokinedoseringen mogelijk maakt.
- Klaarheid voor assay: Maakt gebruik van stabiele, inerte PDMS-substraten met een instelbare modulus (0,4–100 kPa) en een onbeperkte houdbaarheid, waardoor batchvariabiliteit wordt verminderd.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt TGF-β dosis en duur met de contractiele output, wat preklinische modellen van EMT ondersteunt die zijn afgestemd op biomarkers.
- Mechanistische risicoreductie: Maakt evaluatie van veranderingen in contractiliteit mogelijk als functionele readout in ziekterelevante systemen voorafgaand aan in vivo validatie.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Ondersteunt go/no-go beslissingen door moleculaire interventie te correleren met modulatie van het biofysische fenotype.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van target-validatie tot lead-identificatie en levert biofysische resultaten die de besluitvorming in de vroege fase ondersteunen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing van de effecten van TGF-β-signalering op cellulaire mechanica en contractiliteit.
- Screening: Maakt high-throughput, reproduceerbare kwantificering van tractiekrachten in multi-well formaten mogelijk voor dosis-responsanalyses.
- Analytica: Genereert contractiliteitsmetrieken (krachtmagnitude, distributie) die vergelijking van TGF-β-concentraties en blootstellingstijden mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt in vitro EMT-inductie met meetbare biomechanische veranderingen, wat de relevantie van preklinische modellen ondersteunt.
- Bedrijfmatige herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbaar platform voor tractiekracht dat toepasbaar is op verschillende celtypen en mechanobiologische targets binnen de oncologie en fibrose.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door ambiguïteit in mechanobiologische fenotypes te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid door gestandaardiseerde PDMS-substraten en compatibiliteit met multi-well platen.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door parallelle conditietests mogelijk te maken en het reagensverbruik per datapunt te verminderen.
- Impact op portfolio: Faciliteert risico-gecorrigeerde prioritering van targets op basis van kwantitatieve verschuivingen in contractiliteit tijdens pathogene transities.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in celkweek, TFM-beeldanalyse en de bereiding van PDMS-substraten.
- Is afhankelijk van rheometrie voor substraatkarakterisering en fluorescentiemicroscopie voor de kwantificering van tractiekrachten.
- Vereist standaardisatie van de zaaidichtheid, substraatfunctionalisatie en beeldvormingscondities over de wells.
- Aanpassing aan verschillende celtypen kan optimalisatie van de substraatstijfheid en adhesieliganden vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten de uniformiteit van de substraatdikte en potentiële autofluorescentie van PDMS bij bepaalde golflengten.
