Met behulp van Caenorhabditis elegans voor het bestuderen van trans-en multi-generationele effecten van toxicantia

Het gepresenteerde protocol zal studies vergemakkelijken over de trans en de multi-generationele effecten van eiwitten die lange tijd in het milieu kunnen bestaan. We gebruikten een vrijlevende nematode met 99,5 als hermafrodieten om tijd en moeite te besparen bij het bestuderen van trans- en multigenerationele effecten. Deze techniek kan worden gebruikt om de effecten op lange termijn van einddrugs aan te tonen, omdat de aaltjes in het huidige protocol veel conservatieve mechanismen of paden met de mens delen.

Deze methode kan inzicht geven op het gebied van farmaceutische synthese en milieubeheer, omdat ze feedback nodig hebben van mogelijke gevaren van chemische stoffen. Deze methode kan worden toegepast op Daphnia magna met meer focus op aquatische toxiciteit. Ook Drosphila melanogaster om de invloed op gender verder te onderzoeken.

Hij of zij zou worden geplakt met het idee dat het bestuderen van effecten over generaties is tijd en energie-verbruiken. Maak je niet bang bij de eerste indruk. Het volgen van het protocol zal je vruchtbare uitkomst opleveren.

Om E.coli te te verkweeken, pipette 200 microliters van de bacteriële suspensies in 50 milliliter LB-medium in een kolf. Of gebruik een inentrulerende lus om een kleine kolonie uit NGM-agars te halen en deze in het LB-medium te plaatsen. Aan cultuur C.elegans, onder een microscoop, tel de aaltjes op het stapelen NGM agars die vroeger worden voorbereid.

Wanneer het aantal bijna 2, 000 bereikt, gebruik dan een steriele punt om 1/6 van de NGM agar te snijden en over te dragen op nieuw voorbereide NGM agars met bacteriële gazon. Houd de NGM agars ondersteboven in een 22 graden Celsius incubator voor de daaropvolgende cultuur. Na ongeveer 36 uur worden de aaltjes aangetrokken.

Gebruik twee milliliter steriel water om de gravidaalen en nieuw geproduceerde eieren op elke NGM-agar af te spoelen in steriele centrifugebuizen. Plaats de buizen op een rek voor 30 minuten te regelen van de aaltjes, en gooi 85% van de supernatants door pipetting. Het is erg belangrijk om te beoordelen of de aaltjes voldoende worden aangetrokken voor synchronisatie.

Anders zou de leeftijdssynchronisatieoperatie tevergeefs zijn. Meng de pellets met zeven volumes natriumhypochlorietoplossing en schud de centrifugebuizen vijf tot acht keer om de larven en volwassen aaltjes te lyseren. Centrifugeren de buizen op 700 keer G gedurende drie minuten op 20 graden Celsius en gooi vervolgens de supernatants door pipet.

Schort de pellets opnieuw op in vijf volumes steriel water om de leeftijdsgesynchroniseerde eieren te wassen. Centrifuge op 700 keer G gedurende drie minuten bij 20 graden Celsius. Herhaal de was met steriel water, twee maal.

Voeg vervolgens een volume steriel water toe aan de buizen om de leeftijdsgesynchroniseerde eieren opnieuw op te schorten. Verdeel de eissuspensies door vijftig microliter op elk nieuw NGM-agars met bacterieel gazon te pipetten. Houd de NGM agars bovenzijde omhoog in een 20 graden Celsius incubator gedurende 30 minuten, waardoor het water te verdampen of worden geabsorbeerd door de bacteriële gazon.

Draai dan de NGM agars op zijn kop, ondersteboven, voor de daaropvolgende cultuur, en markeer de tijd als de eitijd. 36 uur na de eiertijd bereiken de aaltjes het L3-larvenstadium. Gebruik twee milliliter steriel water om de aaltjes van elke NGM-agar in centrifugebuizen te spoelen.

Na 30 minuten te hebben geregeld, vervang je 85% van de supernatants door K Medium om het voedsel twee uur in de ingewanden te verteren. Gooi vervolgens de supernatants weg. Gebruik K Medium om de nematode suspensies aan te passen op ongeveer 200 nematoden per 100 microliter voor latere experimenten.

Om randeffecten te voorkomen, voeg in het middelste gebied van een 96-goed steriele microplaat 100 microliter voorbereide controle- of chemische oplossingen toe in 10 putten, zoals in zes groepen wordt gerepliceerd. Voeg 100 microliter van de voorbereide nematode K Medium toe aan elk van de 60 putten. Markeer de tijd als T0. Voer de belichting gedurende 24 tot 96 uur uit.

Gebruik na de blootstelling een pipet om aaltjes uit vijf putten in elke groep te verzamelen, in zes 1,5 milliliter centrifugebuizen. Vereffen de aaltjes gedurende 30 minuten en vervolgens pipette om de supernatants weg te gooien. Was de aaltjes aan de onderkant met een milliliter gesteriliseerd water.

Vereffen de aaltjes gedurende 30 minuten. Gooi de supernatanten weg en gebruik de aaltjes onderaan voor indicatormetingen van de blootgestelde oudergeneratie, gemarkeerd als F0. Verzamel de aaltjes uit de resterende vijf putten in elke groep. Vereffen en was de aaltjes zoals voorheen.

Voeg vervolgens 100 microliter steriel water toe om de aaltjes in elke buis opnieuw op te schorten en breng de nematodesuspensies gelijkmatig over op drie nieuw voorbereide NGM-agars met bacterieel gazon. Incubeer de aaltjes gedurende 36 uur om aangetrokken te worden en voer leeftijdssynchronisatie uit, zoals voorheen. Na het uitbroeden van de gesynchroniseerde eieren op NGM agars met bacteriële gazon voor 36 uur, spoel de aaltjes in zes centrifuge buizen.

Na het regelen en wassen met een milliliter gesteriliseerd water, gebruik de aaltjes aan de onderkant voor indicatormetingen van de nakomelingengeneratie gemarkeerd als T1. Meng 99 milliliter van de warme NGM agars met een milliliter controle of chemische oplossingen. Na het bereiden van de agars met bacteriën suspensies volgens het manuscript, in de bio-veiligheidskast, zet de bovenste deksels van de petrischaaltjes opzij en stel het bacteriële gazon gedurende 15 minuten bloot aan UV-licht. Pipette de leeftijdsgesynchroniseerde eieren op de UV-behandelde agars.

Markeer het begin van de blootstelling aan de bovenliggende generatie, F0, als dag nul. Broed de agars drie dagen lang bij 20 graden Celsius. Gebruik vervolgens de volwassen aaltjes om effecten in F0 te meten. Ook, op dag drie, gebruik maken van een glazen staaf uitgerust met een kunstmatige vezeldraad gebogen in een ring om F0 volwassen aaltjes te plukken, en schuif op het oppervlak van nieuwe UV-behandelde NGM agars.

Op dag vier, pick out en gooi de volwassen F0 aaltjes van NGM agars. Gebruik op dag zes de F1-volwassen aaltjes die gedurende drie dagen blootstelling hebben ervaren voor indexenmeting. In dit protocol toonden de transgenerationele effecten van cadmium, koper, lood en zink op de lichaamsbuigende frequentie aan dat de remmingen in de nematodeouder, F0, na prenatale blootstelling minder waren dan in hun nageslacht, T1. De multi-generationele resteffecten van sulfamethoxazool op de levensduur en voortplanting van de aaltjes toonden aan dat de voortplanting aanzienlijk werd beïnvloed bij blootstelling aan kiembaan, en de toxiciteiten bleven bestaan in niet-blootgestelde generaties van T3 tot T6-generaties.

Multi-generationele blootstelling en multi-generationele resteffecten van lindane op de biochemische en genetische indexen van aalpersoonlijkheid vertoonden obesogene effecten met stoornissen in de insulinesignaalregulatie. Bovendien gaven de veranderingen tussen sgk-1 en akt-1 signalering aan dat aematoden van verschillende blootstellingsgeneraties verschillende responsstrategieën voor tolerantie en vermijding vertoonden. Controleer de woonstatus van de aaltjes vóór elke bewerking en wijzig de volgende stappen dienovereenkomstig.

Andere effecten, bijvoorbeeld, obesogene effecten van chemische stoffen, kunnen worden opgenomen om verder te beantwoorden aan de toenemende prevalentie van obesitas over generaties. Op basis van de methode kunnen verdere mechanismen worden onderzocht. Bijvoorbeeld de erfelijke epigenetische signalen tussen generaties.

De chloor oplossingen hebben sterke oxidatatieve mogelijkheden, en vermijd direct contact van de huid om het.