Nieuw protocol voor het genereren van fysiologische immunogeen dendritische cellen

Fysiologische dedritische antigeen-presenterende cellen, phdc genoemd, zijn de immuunmaster-switches die antigeenspecifieke T-celimmuniteit en tolerantie initiëren. Dit document beschrijft een efficiënte methode voor de productie van PhDC. Klinisch gebruik van dendritische cellen wordt belemmerd door de niet-fysiologische cytokine methoden die worden gebruikt om ze te produceren.

Onze methode overwint dat probleem via efficiënte bloedplaatjessignalering van monocyte-naar-DC-conversie bij mensen en muizen. Deze PhDC zijn niet afhankelijk van cytokine voorwaarden niet beschikbaar in vivo, zodat ze krachtige klinische anti-tumor T-celreacties kunnen genereren bij zowel mensen als muizen met gevestigde kankers. Soorten-onafhankelijke bloedplaatjes initiatie van monocyte-to-PhDC rijping heeft brede experimentele toepasbaarheid.

PhDC toestaan dissectie van dendritische celfysiologie, vergemakkelijken inductie van therapeutische anti-kanker immuniteit tegen immunogene kanker, en bieden belofte voor gepersonaliseerde antimicrobiële vaccinatie. Dit experimentele systeem is nieuw, en meerdere aspecten ervan, zoals coating van de plastic kamer, tumorcelbehandeling met 8-MOP/UVA, stroomomstandigheden en afgifte van monocyten zijn het best visueel vertegenwoordigd. Het aantonen van de procedure zal Eve Robinson zijn, een technicus van mijn laboratorium.

Om perifere bloedmononucleaire cellen te verzamelen, zet eerst een buis van 15 milliliter op met vier milliliter lymfocyten isolatiemedium per vijf tot 10 gebloede muizen. Dan langzaam laag bloed verzameld van tumor-dragende muizen op de top van het medium. Draai de cellen op 1.000-1, 500-keer-G gedurende 20 minuten om de PBMCs te scheiden van rode bloedcellen.

Aan het einde van centrifugatie, het verzamelen van de bovenste plasmalaag, waardoor 0,5 milliliter blijven boven de buffy jas, en op te slaan op vier graden Celsius voor later gebruik. Verzamel vervolgens de buffy-laag in een schone buis van 15 milliliter gevuld met PBS tot 15 milliliter en draai 10 minuten in een standaard weefselkweekcentrifuge om de PBMC te verzamelen. Aan het einde van centrifugatie, voorzichtig pipette uit de supernatant en flick de buis om de pellet resuspend.

Voeg vervolgens twee milliliter ACK rode bloedcel lyse buffer aan de buis om de resterende rode bloedcellen te verwijderen uit de PBMC. Broed het PBMC 10 minuten in het ijs. Vul de buis met PBS tot 15 milliliter en spin naar beneden op 250-keer-G in een standaard weefselkweekcentrifuge gedurende 10 minuten om de PBMC te verzamelen.

Voorzichtig pipette uit de supernatant en flick de buis om de pellet los te maken. Resuspend de pellet in 300 microliters van FBS. Om YUMM1.7 tumorcellen per behandelingsgroep voor te bereiden, wordt de tumorcelpellet in FBS eerst opnieuw opgetrokken bij 2,5 miljoen cellen per 300 microliters.

Met weefsel cultuur kap lichten uit, voeg 8-methoxypsoralen voor een laatste concentratie van 100 nanogram per milliliter aan de YUMM1.7 tumorcel suspensie. Meng vervolgens de cellen, wikkel de celcontainer in folie en broed gedurende 20 minuten uit op 37 graden Celsius. Om een 12-well weefselkweekplaat voor te coaten, voeg je een milliliter FBS toe aan één put voor elke behandelingsgroep van vijf muizen en koel je de plaat op vier graden Celsius gedurende 20 minuten.

Na 20 minuten, onder een weefselkweekkap, verwijder FBS uit de putten en voeg 300 microliters van methoxypsoralen-blootgestelde tumorcellen per put toe. Stel vervolgens de celhoudende plaat bloot aan het voorverwarmde ultraviolet A lichtbron voor totale bestraling van vier joules per vierkante centimeter. Om 8-methoxypsoralen/UVA-behandelde tumorcellen van elke put te verzamelen, wervelt de plaat en pipet zorgvuldig om volledig celherstel te garanderen.

Voor het uitvoeren van transimmunisatieplaatpassage voor elke behandelingsgroep van vijf muizen, combineer 300 microliter van de juiste PBMC en 300 microliters van 8-methoxypsoralen/UVA-behandelde tumorcellen in een 1,5-milliliter conische buis en meng de cellen. Open vervolgens de in- en uitstapbuizenklemmen van de TI-plaat. Gebruik een spuit van 10 milliliter om de TI-slang te vullen met FBS, waardoor de klemmen worden gesloten terwijl de slang wordt gevuld om FBS in de slang te behouden.

Koppel de spuit los. Plaats een P1000 pipet tip stevig in de TI plaat inname. Houd de plaat in een hoek van 45 graden en vul de plaat langzaam met PBMC en tumorcelmix, waardoor bellen worden vermeden.

Haal de pipetpunt uit de inlaat voordat u de pipetzuiger loslaat. Breng de resterende cellen terug naar de 1,5 milliliter conische buis. Broed de FBS gevulde slang, de met cellen gevulde TI-plaat en de 1,5 milliliter conische buis met de resterende cellen in de weefselkweek incubator op 37 graden Celsius gedurende een uur.

Laat na incubatie de klemmen los en leg de TI-slang leeg door de zwaartekracht. Steek vervolgens een P1000 pipettip met de zuiger ingedrukt in de plaatpoort om de cellen uit de TI-plaat te verwijderen. Houd de plaat in een hoek van 45 graden en vul de P1000 pipetpunt.

Plaats cellen terug in hun originele 1,5-milliliter conische buis. Om de TI-plaat uit te voeren, sluit u de uitgangsbuis aan op de plaat en bevestigt u de TI-plaat in het plaatloopsysteem. Vervolgens, met behulp van een een-milliliter spuit, opstellen van die 600 microliter van PBMC en tumorcel mix van de 1,5-milliliter conische buis.

Bevestig de spuit met de klem open aan de instapbuis en vul langzaam tot de vloeistof het einde van de slang bereikt. Bevestig het vrije uiteinde van de ingangsbuis aan de TI-plaat en blijf het resterende volume voorzichtig laden. Sluit de ingangsklem als u klaar bent.

Maak de spuit van één milliliter los en sluit de ingangsbuizen aan op de spuitpomp. Zet de uitgangsbuizen vast aan een schone conische buis van 1,5 milliliter voor celopvang. Pas de stroomsnelheid van de spuitpomp aan op 0,09 milliliter per minuut.

Kantel de TI-plaat ongeveer 30 graden naar de kant van de spuitpomp met behulp van een TI-plaat loopplatform. Laat de klem voorzichtig los op de ingangsbuizen. Start de spuitpomp en observeer zorgvuldig hoe de TI-plaat zich vult.

Zodra de TI-plaat volledig is gevuld, kantel het ongeveer 30 graden in de tegenovergestelde richting als het leegt. Wanneer alle cellen in de vloeistof zich in de 1,5 milliliter conische opvangbuis bevinden, stop dan de pomp. Om de TI-plaat te wassen, koppelt u de ingangsbuizen los van de spuitpomp en sluit deze aan op een spuit van één milliliter gevuld met 600 microliters FBS.

Vul totdat FBS volledig is geladen. Koppel vervolgens de spuit los en bevestig de slang aan de spuitpomp. Pas de stroomsnelheid van de spuitpomp aan op 0,49 milliliter per minuut.

Laat de ingang klem, en voer de TI-plaat, het verzamelen van de was in dezelfde 1,5-milliliter conische buis. Veeg of tik de HELE tijd zachtjes op de TI-plaat om te helpen bij het losmaken en eluteren van aanhangende cellen terwijl de plaat leegraakt. Koppel de collectie 1,5 milliliter conische buis los van de TI-plaatopstelling.

Draai de opvangbuis in de benchtop microfuge op 250 keer-G gedurende acht minuten en gooi de supernatant weg. Om 's nachts co-incubatie van PBMC met antigeen uit te voeren, wordt eerst de PBMC en tumorcelpellet opnieuw opgetrokken in twee milliliter heldere RPMI aangevuld met 15% autolog muizenserum. Dan plaatcellen in een 35-millimeter niet-weefsel-cultuur behandeld steriele schotel, en incubeer 's nachts onder standaard weefsel cultuur voorwaarden.

Op de volgende dag, zorgvuldig los te maken van alle aanhangende cellen van de bodem van de schotel met een weefsel cultuur schraper. Draai de schotel tijdens het schrapen om een gelijkmatige celinzameling te garanderen. Verzamel de cellen in een buis van 15 milliliter.

Voeg twee milliliter PBS aan de schotel, en herhaal de schraapstap, het verzamelen van de cellen in dezelfde buis. Spoel de 35-millimeter schotel met een milliliter PBS, en voeg de spoeling aan dezelfde buis. Draai op 250-keer-G in een standaard weefselkweek centrifuge gedurende 10 minuten om de cellen te verzamelen.

Voorzichtig pipette uit de supernatant, dan veeg de buis om de pellet resuspend. De therapie toonde vermindering van YUMM1.7 tumorgroei in meer dan 100 behandelde versus controlemuizen, zoals waargenomen in de cumulatieve tumorgroeigegevens van negen onafhankelijke experimenten die over twee jaar werden uitgevoerd. De representatieve tumorgroeicurven voor individuele dieren binnen één experiment geven een gevoel van variabiliteit in het systeem.

Wanneer monocyten of bloedplaatjes uit de PBMC-fractie worden uitgeput of wanneer de plaatpassage wordt weggelaten, wordt het therapeutische effect niet meer waargenomen. De behandeling is niet effectief bij afwezigheid van de immuuncellen of een antigeenbron, of in aanwezigheid van een niet-overeenkomend antigeen, zoals YUMM1.7-tumoren behandeld met MC38-coloncarcinoomcellen. Voor een immuniserende uitkomst is het ook van cruciaal belang om pbmc-blootstelling aan 8-methoxypsoralen te voorkomen.

FACS-analyse van de wijziging van de aangegeven markers van overeenkomstige IgG-controles in menselijke CD11c+-cellen bij vers geïsoleerde PBMC, TI-behandelde PBMC, TI-behandelde PBMC zonder plaatpassage, uitgeputte bloedplaatjes voorafgaand aan de plaatpassage, of beide van de bovenstaande, toonde aan dat dc-activering afhankelijk is van de aanwezigheid van bloedplaatjes in de PBMC en van de TI-passage. De TI-geactiveerde menselijke DC's kunnen effectief peptideanten of antigenen van hele 8-methoxypsoralen-blootgestelde menselijke tumorcellen verwerken en kruisen om menselijke antigeenspecifieke T-cellijnen in vitro-tests te activeren op een TI-en bloedplaatjesafhankelijke manier. Specificiteit van T-celreacties is afhankelijk van de bron van de verwerkte antigenen.

Bij het induceren van anti-kanker immuniteit, apoptose van elke kankercellijn moet worden getitreerd om immunogeniciteit te maximaliseren. Aangezien geïnduceerde immuniteit specifiek zal zijn voor het immuniseren van antigenen, zal gedetailleerde dissectie van elk systeem mogelijk zijn. Elke experimentele of klinische kanker, en elke antimicrobiële respons, zal uniek informatief zijn.

Elke individuele menselijke kanker heeft zijn eigen array van tumor-specifieke antigenen. De PhDC voert de nodige sortering en presentatie van tumorantigenen uit, zonder dat hun voorafgaande laboratoriumidentificatie vereist is. Houd er rekening mee dat 8-MOP- en UVA-licht kankerverwekkende stoffen zijn.

Gebruik de juiste beschermingsmiddelen en volg veiligheidsprocedures bij het hanteren van 8-MOP en bij het werken met UVA-lichtbronnen.