Een arbeidsbesparende en herhaalbare Touch-Force signalering Mutant screen protocol voor de studie van Thigmomorphogenesis van een model plant Arabidopsis thaliana
6 augustus 2019
Een zachte touch-Force laad machine is opgebouwd uit menselijke haar borstels, robotarmen en een controller. De haar borstels worden aangedreven door robotarmen die op de machine zijn geïnstalleerd en bewegen periodiek om touch-Force op planten toe te passen. De sterkte van machinaal aangedreven haar aanrakingen is vergelijkbaar met die van handmatig aangebrachte aanrakingen.
We bouwen een automatische touch force machine om het plantensignaal morfogenese te observeren. De robotarmen die ik installeerde met menselijke haarborstels om zachte aanraakkracht op planten aan te brengen. In vergelijking met menselijke vinger aanraking, kan de automatische menselijke haar aanrakingsmachine meer arbeidsbesparing, een eenvormige aanrakingskrachtlading aanbieden.
De tijd die nodig is voor een ronde van kracht laden kan worden beperkt binnen enkele minuten. In vergelijking met een paar uur vinger aanraking en een wattenstaafje raken, de robot machine kan grotendeels verbeteren van de plant mercantile response onderzoek. Door de efficiëntie en populatie van behandelde planten te verhogen, verwachten we dat de automatische aanraakmachine zal worden toegepast in een vier signalering mutant schermen en de mercantile response studies in zowel planten als dieren.
Om te beginnen test u de kiemsnelheid van elk genotype na het verzorgen van zaden op een 8%agarplaat met MS-medium gedurende zeven dagen. Volgens de kiemsnelheid, bereiden zaden vier tot vijf keer meer dan het gewenste aantal planten te produceren. Dompel zaden onder in koud water in 1,5 milliliter plastic buizen en bedek met aluminiumfolie om in het donker te blijven.
Bewaar op vier graden celsius voor zaad imbibition. Vijf tot zeven dagen na de imbibition, selecteer de juiste bodem voor plantengroei. Vermijd grote klonten en gebruik een vork om ze homogeen te mengen.
Bereid 24 207 milliliter plastic bekers met een bovenste velgdiameter van 7,4 centimeter. Boor drie ronde gaten aan de onderkant van de kopjes voor irrigatiedoeleinden. Vul deze plastic bekers met gemengde grond.
Laat de grond zich opstapelen tot ongeveer een centimeter hoger dan de bekerrand en gebruik een liniaal om het oppervlak van de opgestapelde grond zacht plat te maken. Breng 24 kopjes in een plastic dienblad. Stel de lichtintensiteit van de groeikamer tussen 180 en 240 microeinsteins per seconde per vierkante meter, wat hoger is dan de fotosynthetische actieve straling voor snelle groei van de planten.
Stel de lichtconditie in op 24 uur constant. Stel de temperatuur van de groeikamer in op een 23,5 plus of min 1,5 graden Celsius en vochtigheid tussen 35 en 45%Voeg 2,5 liter water toe aan elke lade. Laat de grond absorberen het water uit de gaten gelegen aan de onderkant van de kopjes en wacht tot het oppervlak van de bodem te laten vallen tot de beker velg niveau.
Twee uur later, zaaien drie tot vier zaden op een enkele plek en vier gelijkmatig verdeelde plekken in een beker. Plaats een transparante plastic deksel boven elke lade en laat zaden ontkiemen voor een week. Verwijder vervolgens de hoes en laat zaailingen nog een week groeien.
Irrigeer planten met 1,5 liter water om de andere dag na de zaden ontkiemen. Negen tot 10 dagen na het zaaien van zaad, verwijder extra scheuten door dunner te worden. Gebruik kleine schaar om de parachutes te snijden en te voorkomen dat het trekken van de hele plant uit de bodem direct.
Drie tot vier plantaardige individuen van vergelijkbare grootte in elk kopje. Om aanraakhaarborstels op de robotarmen te installeren, gebruik je eerst lijm om een laag menselijk haar gelijkmatig op een 330 millimeter lange stalen liniaal te bevestigen. De lengte van het haar is 126 millimeter.
Met twee metalen klemmen, bevestig die stalen linialen op de robotarmen. Stel in het bedieningspaneel de hoogte van de machinearmen in langs de verticale dimensie door op Jog F plus te drukken om te verhogen en Jog R min om de robotarmen en borstels te verlagen. Houd het puntje van haarborstels 5 centimeter lager dan de cup rand.
Druk op de Inc F plus of R min om de machine een tot twee cycli voor te draaien om ervoor te zorgen dat alle plantaardige individuen worden aangeraakt. Gebruik voor het officiële experiment een elektronische weegschaal om de aanraakkracht te meten. Pas de hoogte van de machinearmen aan om de aanraakkracht tussen één tot twee millinewtons te behouden.
Stel vervolgens handmatig de startpositie van machinearmen langs de horizontale dimensie in. Laat de haarborstels aan de rand van elke lade hangen. Druk op Jog F plus of Jog R min om de machinearm beetje bij beetje horizontaal te bewegen om ervoor te zorgen dat er geen plant wordt aangeraakt voordat het aanraakexperiment begint.
Stel de rijafstand van de haarborstel in de horizontale dimensie in op 365 millimeter door op de reisknop te drukken. Druk op Inc F plus of R min om de machine armen te verplaatsen om een volledige reisafstand te verkrijgen en ervoor te zorgen dat alle van de behandelde planten worden aangeraakt. Druk vervolgens op de automatische snelheidsknop om de bewegingssnelheid langs de x-as van de machinearmen in te stellen op 5000 millimeter per minuut.
Druk op de kleine fietsknop om de aanraaktijd in te stellen op 20 proeven gelijk aan 40 aanrakingen per ronde. Stel het herhalingsinterval van de aanraakronde in op 480 minuten per dag door op de belangrijke periodeknop te drukken waarmee haarborstels drie rondes per dag planten kunnen raken met een intervaltijd van acht uur. De machine start automatisch een nieuwe ronde van aanraking wanneer het aftellen in nul draait.
Stel de belangrijkste cyclus op 12 proeven om de machine in staat te stellen planten aan te raken gedurende 12 rondes binnen een periode van vier dagen. Druk op de startknop om het vooraf ingestelde programma te starten. Pas en kalibreer de borstels en haartips elke dag op dezelfde hoogte tijdens de gehele aanrakingsperiode.
Om de boutdag van elke plant te volgen in een ontroerend experiment, observeer je de eerste bloeisterige stam van elke plant elke dag. Meet de lengte en noteren de duur van de groei wanneer deze een centimeter bereikt, wat betekent dat het is overgestapt van de vegetatieve fase naar de voortplantingsfase. De maat van de rozet straal, neem foto's van de hele lade vanaf de top.
Gebruik een beeldverwerkingssoftware om de afstand van het rozetcentrum tot het puntje van het langste blad te meten met de bekerrand als liniaal. Om het rozetgebied te meten, moet u eerst de bloeiwijze verwijderen zonder de rest van de rozetorganen te beïnvloeden. Maak foto's vanaf de bovenkant van elke plant samen met een schaal liniaal in de buurt geplaatst.
Meet in de beeldverwerkingssoftware het horizontale tweedimensionale oppervlak van de rozetbladeren. In dit experiment wattenstaafje handmatige touch behandeling werd vergeleken met machine gedreven haar touch behandeling op wilde type controle Columbia nul planten. Bouten vertraagd 1,7 dagen na continue wattenstaafje touch behandeling.
Ook voor de automatische machine aangedreven haar aanraking, vertraagde bouten werd waargenomen. De univariate Cox gevaren analyse toont het boutrisico van planten in de touch groep is 31%en 52% in vergelijking met planten in de controlegroep, respectievelijk. Deze vertraging werd echter niet waargenomen bij tDNA insertional mutanten, NKK één en NKK twee.
De univariate Cox proportionele gevaren model toont alleen wilde type Columbia nul tentoongesteld een significant verschil tussen controle en touch planten met een geschatte HR van 41. Voor morfologische veranderingen, het wilde type Columbia nul plant toonde aanzienlijk kleinere rozet straal en kortere bladlengte na drie dagen van constante en repetitieve automatische machine aangedreven haar aanraking. Het geprojecteerde rozet gebied werd veranderd van 20 tot 16 vierkante centimeter na 13 dagen van aanraking.
Om ervoor te zorgen dat de aanraakkracht lading niet zal leiden tot de wond, moet de juiste aanraakkracht zorgvuldig worden ingesteld. Een reeks van de juiste groei voorwaarden nodig zijn om een geschikte Arabidopsis plant te produceren voor touch response assay. Zo is bijvoorbeeld 24 uur lichtintensiteit tussen 180 en 240 microeinstein per vierkante meter per seconde nodig om het signaal morfogenese waar te nemen.
Om uit te breiden tot de andere vormen van mechanische krachtbelasting, kan de machine ook worden aangepast met waterberegeningsmond of windblazers om regen- of windeffecten na te bootsen, respectievelijk in de toekomst.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een geautomatiseerde machine voor het aanbrengen van aanrakingskracht, die gebruikmaakt van penselen van menselijk haar en robotarmen om de signaalmorfogenese van planten te onderzoeken. Het apparaat maakt een uniforme toepassing van aanrakingskracht op planten mogelijk, wat de efficiëntie aanzienlijk verhoogt in vergelijking met handmatige methoden.
Belangrijkste studieonderdelen
Onderzoeksgebied
- Plantensignalering en respons
- Automatisering in biologisch onderzoek
- Efficiënte methodologieën voor plantbehandeling
Achtergrond
- Traditionele methoden voor het uitoefenen van aanrakingskrachten op planten zijn arbeidsintensief en tijdrovend.
- De ontwikkeling van robotische systemen kan de experimentele consistentie en snelheid verbeteren.
- Deze studie heeft tot doel de reacties van planten op mechanische stimuli te verbeteren door middel van automatisering.
Gebruikte methoden
- Ontwikkeling van een robotische aanraakkrachtmachine met borstels van menselijk haar voor een consistente krachttoepassing.
- Onderzoek gericht op Arabidopsis-planten tijdens hun ontwikkelingsstadia.
- Technologische benaderingen omvatten geautomatiseerde aanraakcycli en gecontroleerde omgevingscondities.
Belangrijkste resultaten
- Het geautomatiseerde systeem levert aanraakkrachten die vergelijkbaar zijn met handmatige toepassing.
- Er zijn verbeteringen in de efficiëntie opgemerkt, zowel in de behandelingstijd als in de responspopulaties van de planten.
- De succesvolle implementatie toonde het potentieel aan voor bredere toepassingen in screenings van signaleringsmutanten.
Conclusies
- Deze studie benadrukt de effectiviteit van robotische automatisering in het plantenfysiologisch onderzoek.
- De bevindingen suggereren dat gemechaniseerde aanraking onderzoeksprocessen aanzienlijk kan stroomlijnen, wat bijdraagt aan genetische en signaleringsstudies.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Geautomatiseerde platforms voor mechanische stimulatie lossen knelpunten op bij het fenotypische screenen van mechanotransductiepaden, waardoor een hogere doorvoer en reproduceerbaarheid in studies naar target-validatie mogelijk wordt. Door arbeidsintensieve handmatige krachttoepassing te verminderen, ondersteunt deze methode de schaalbare beoordeling van genetische mutanten in mechanosensitieve signaleringsnetwerken. Dit positioneert de technologie als een faciliterend instrument voor vroege discovery-workflows die gericht zijn op krachtsensormechanismen in modelsystemen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar touch-force signaleringsmutanten zoals MKK1 en MKK2 om mechanistische rollen in mechanotransductie te verduidelijken.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare, kwantificeerbare toepassing van touch-force, waardoor variabiliteit door handmatige manipulatie wordt verminderd.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt fenotypische vergelijking van wildtype- en mutantlijnen onder gestandaardiseerde mechanische stress om hypothesen over targets te valideren.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantificeerbare morfologische resultaten (bijv. rosette-radius, timing van het schieten) voor high-content fenotypische screening.
- Operationele waarde: Maakt onbeperkte aanrakingsrondes mogelijk met instelbare kracht, wat experimentele ontwerpen naar analogie van dosis-responsstudies mogelijk maakt.
- Klaar voor assay: Compatibel met alternatieve aanraakmaterialen (bijv. dierlijk haar, zijde) en omgevingssimulatoren (regen, wind) voor flexibiliteit in de assay.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt moleculaire mutanten met fenotypische veranderingen op organismeniveau onder mechanische stress, wat bijdraagt aan de validatie van signaalpaden.
- Mechanische risicoreductie: Maakt statistische evaluatie mogelijk van verschillen in aanrakingsrespons tussen genotypen, wat bijdraagt aan de betrouwbaarheid van het target.
- Relevantie van het model: Maakt gebruik van Arabidopsis thaliana als een genetisch hanteerbaar systeem om geconserveerde mechanosensitieve signaleringsprincipes te bestuderen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode kan worden geïntegreerd in vroege discovery-pipelines door een gestandaardiseerde mechanische stimulus te bieden voor fenotypische screening van signaleringsmutanten voorafgaand aan inspanningen voor lead-identificatie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing van kinase-afhankelijke aanrakingssignaalpaden door middel van gecontroleerde krachttoepassing en fenotypische read-outs.
- Screening: Maakt reproduceerbare, high-throughput toediening van aanrakingskracht mogelijk voor screeningscampagnes van mutanten met meetbare groeien en ontwikkelingsuitkomsten.
- Analytica: Faciliteert kwantitatieve meting van de vertraging in schachttrekking, rozetareaal en bladlengte voor statistische vergelijking tussen genotypen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt moleculaire fenotypen (bijv. MKK1/MKK2-mutanten) aan mechanomorfogene reacties van de gehele plant, wat doelwitvalidatie ondersteunt.
- Herbruikbaarheid binnen de onderneming: Het platformontwerp maakt aanpassing aan andere mechanische stimuli (wind, regen) en modelsystemen mogelijk, wat het nut over verschillende projecten heen ondersteunt.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in krachtsensitiviteitsroutes door gestandaardiseerde, reproduceerbare fenotypische assays.
- Operationele waarde: Verhoogt de experimentele doorvoer door de tijd voor het aanbrengen van aanrakingskracht per ronde te verminderen van uren naar minuten.
- Strategische waarde: Verbetert het vertrouwen in go/no-go beslissingen bij targetvalidatie door vals positieven als gevolg van handmatige variabiliteit in kracht te minimaliseren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van mechanosensitieve targets mogelijk op basis van reproduceerbare fenotypische uitkomsten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in plantengroeicondities, mechanische stimulatieprotocollen en op beelden gebaseerde fenotypering.
- Vereist een robotarmsysteem, op maat gemaakte armaturen met aanraakmateriaal en kamers voor omgevingsbeheersing voor reproduceerbare resultaten.
- Vereist standaardisatie van de aanraakkracht (1–2 mN), tijdsintervallen en omgevingscondities tussen gebruikers en locaties.
- Overwegingen voor aanpassing omvatten het wisselen van aanraakmaterialen (haar, zijde, katoen) en het toevoegen van spuitmonden voor regen-/windsimulatie.
- Praktische beperkingen omvatten de afhankelijkheid van een consistente plantgrootte en ontwikkelingsstadium voor vergelijkbare metingen van de aanraakrespons.
