Methode om het patroon van de ademhaling in senescente muizen te verkrijgen door ongebreidelde barometrische plethysmografie

Dit protocol kan worden gebruikt om patronen van ademhaling in muizen te meten. Belangrijk is dat het de impact van actief gedrag in genetisch gemodificeerde stammen kan minimaliseren die resultaten kunnen verstoren. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het niet-invasief is en dat het niet het gebruik van verdovings- of stressverwekkende beperkingen vereist.

Begin met ervoor te zorgen dat alle slangen en buizen zijn aangesloten op de barometerplethysmograafkamer en door een gasinstroombuis en een vacuümuitstroombuis rechtstreeks aan te sluiten op de barometrische plethysmografiekamer. Als u de lage stroom in de kamer wilt kalibreren, stelt u de stroom in en uit de kamer op nul en verwijdert u de stroombuis in de kamer. Zet het vacuüm uit en voer een nul in de lage eenheidscel om de nulstroom op te nemen in de 7700 versterkeropstelling van de barometerplethysmograafsoftware.

Sluit vervolgens de instroombuis opnieuw aan en zet de vacuümstroom aan om de hoge stroom te kalibreren en om 20,93% zuurstofgebalanceerd stikstofgas door de barometerplethysmografiekamer van de gasmixer te laten stromen. Zet vervolgens de instroomwaarde gemeten vanaf de stroommeter van liters per minuut om in milliliters per seconde en klik op de cel met hoge eenheden om de waarde in milliliters per seconde in te voeren. Dubbelklik op hoog cal, verander de tijd in drie seconden en klik op Meten.

Laat vervolgens het 7700 versterker setup tab open om de metabolische analyzers te kalibreren naar de barometrische plethysmografie software. Om de metabole analyzer te kalibreren, in het gasmixerprogramma, zet de gasmixer op 20,93% zuurstof en 79,07%-stikstof. En op de metabole analyzer, stel het zuurstofkalibratieniveau in op 20,93%en de kooldioxide op 0%Draai de wijzerplaat terug om te bemonsteren zodra de juiste waarden zijn ingevoerd op de gasanalyzers om het hoge zuurstof- en koolstofarme percentage in te stellen.

Klik op het ABCD 4-tabblad van de barometrische plethysmografiesoftware en voer 20,93 in onder een hoge eenheid van de C2-lijn voor zuurstof. Verander onder hoge cal de tijd in drie seconden en klik op Meten. Voer nul onder lage cal van de C3-lijn voor kooldioxide.

Verander vervolgens de tijd in drie seconden en klik op Meten onder lage cal. In het gasmixerprogramma wijzigt u de zuurstofwaarde naar 10% en de koolstofdioxidewaarde tot 5% en wacht enkele minuten tot de gasstroom zich aan deze waarden aanpast. Op de metabole analyzers, draai de aanpassing knoppen om de kooldioxide te kalibreren tot 5%, het verzorgen van de wijzerplaat terug te draaien naar monster zodra de waarden zijn gekalibreerd.

Na het controleren van de analysereer metingen stabiel zijn, klik op hoge eenheid onder C3 en voer vijf voor kooldioxide. Verander vervolgens high cal in drie seconden en klik op Meten. Klik op lage eenheid onder de C2-optie en voer 10 in voor zuurstof en klik op lage cal, voer drie seconden in en klik op Meten.

Verander de gasmixer terug naar 20,93% zuurstof en 79,07% stikstof en wacht enkele minuten tot de kamer zich aan deze waarden aanpast. Routinematig uitvoeren van extra kalibraties met gecertificeerde gastanks om te bevestigen dat de stroommixer en zuurstof-kooldioxide-analysers goed presteren. Wanneer de metabolische analysers zijn gekalibreerd, controleer dan de stroommeters die zijn aangesloten op de barometerplethysmograafkamer opnieuw en pas de luchtstroom in en uit de kamer aan de tarieven die geschikt zijn voor het experiment.

Wanneer alle instellingen zijn toegepast op de barometrische plethysmografiesoftware, klikt u op Sluiten op het tabblad Acquisitie. Druk op Startacquisitie, geef het bestand een naam en klik op OK om te beginnen met opnemen. Voor ongebreidelde barometrische plethysmografie registreert u het gewicht en de initiële lichaamstemperatuur van de muis voordat u de muis terugstuurt naar zijn thuiskooi.

Wacht 10 minuten om de achtergrond zuurstof en kooldioxide gegevens te verzamelen uit de lege kamer voor het plaatsen van de muis in de kamer. Documenteer tijdens het eerste uur het gedrag van het dier dat gedetailleerde notities maakt die de specifieke waarden van de in- en uitstroom van de kamer bevatten. Aan het einde van de gewenning van de kamer, kijk voor segmenten van stille ademhaling voor de komende 60 minuten het nemen van lichaamstemperatuur metingen om de 10 minuten bij het gebruik van een implanteerbaar apparaat.

Zorg ervoor dat u vertrouwd raakt met het algemene muisgedrag, zodat gevallen van kalme ademhaling zonder snuiven, verzorgen of verkennen op de juiste manier kunnen worden geïdentificeerd. Aan het einde van het experiment, breng de muis terug naar zijn kooi en grondig schoon en veeg de apparatuur. Voor een metabolismeanalyse, open het metabolische paneel in de software en verkrijg het gemiddelde van de eerste 10 minuten van de zuurstof- en kooldioxideniveaus vanaf het moment dat de kamer leeg was.

Bekijk het stroompaneel van de barometrische plethysmografiesoftware en klik met de rechtermuisknop Op Kenmerk analyseren om de juiste parameters in te stellen. Voor een patroon van ademhalingsanalyse, bevestig de tijden voor de 15 seconden van stille ademhaling met behulp van notities over dierlijk gedrag en de flow panel tracing. Voer vervolgens de tijden onder open parserdialoog in op het tabblad gegevensparser en klik op Parser-weergavemodus om alleen de specifieke 15-secondensegmenten van belang weer te geven.

Als u apneu en verhoogde adem wilt analyseren, sluit u in het geopende controlebestand de parserweergavemodus af en klikt u op P3-instelling en grafiekinstellingen instellen om paginaweergave als type en vijf als het aantal deelvensters te selecteren. Voer min twee in de doos met het label laag en twee in de doos die hoog is gelabeld voor de stroommaatjes in milliliters per seconde en pas de wijzigingen toe. Schuif vervolgens naar de markering van 30 minuten op het deelvenster stroomtracingen en tel handmatig de apneu en verhoogde ademhalingen voor de periode van 30 tot 60 minuten nadat de muis in de kamer is geplaatst.

Voor deze analyse zijn perioden van zwevende ademhaling langer dan of gelijk aan 0,5 seconden indicatief voor een apneu. Augmented ademhalingen worden aangegeven door een sterke stijging van het ademhalingsspoor boven 1,25 milliliter per seconde, gevolgd door een scherpe daling onder min 0,75 milliliter per seconde. Deze representatieve stroomtracering van stille ademhaling in een 22 maanden oude muis is typerend voor een patroon waarbij de ademhaling consistent is zonder actief ademhalingsgedrag.

Dit ademhalingspatroon komt uit een actiever segment waarin de muizen de kamer snuiven en/of verzorgen en is niet ideaal voor het type ademhalingscollectie dat voor deze methode wordt gebruikt. De parameter die werd geselecteerd voor de beoordeling van mogelijke ademhalingsverschillen tussen de twee tijdstippen waren ademhalingsfrequentie, getijdenvolume, minieme ventilatie, inspiratoire tijdsverhouding en minieme ventilatie verdreven koolstofdioxideverhouding. Verdere analyse werd uitgevoerd met elk van de vier 15-seconden basissegmenten voor frequentie, getijdenvolume, minieme ventilatie, getijdenvolume inspiratoire tijdsverhouding, en minuten ventilatie verdreven kooldioxide ratio.

Er werden geen significante verschillen gevonden tussen een van de tijdstippen en geen verschillen in de variabiliteit tussen een van de vier tijdsegmenten voor een patroon van ademhalingsmeting. Kwantificering van het aantal apneu en verhoogde ademhalingen waargenomen voor elk dier tijdens minuten 30 tot 60 van de ongebreidelde barometrische plethysmografie protocol bleek dat oude dieren tentoongesteld een hoog aantal apneu en de aanwezigheid van verhoogde ademhalingen binnen een 30-minuten span. Onderzoekers kunnen ook gebruik maken van gas uitdagingen zoals hypoxie of hypercapnie om eventuele veranderingen in het ademhalingspatroon als gevolg van een interventie of therapie document.

Deze techniek biedt een middel voor het karakteriseren van patronen van ademhaling bij kleine knaagdieren en genetisch gemodificeerde dierlijke stammen die verschillende gedragsverschillen kunnen vertonen.