Afleidbare, cel Type-specifieke uiting in Arabidopsis thaliana via LhGR-gemedieerde Trans-activering

Het belangrijkste doel in de ontwikkelingsbiologie is om de contextspecifieke rol van een gen te begrijpen. En dit kan moeilijk te bereiken zijn door conventionele knock-out mutanten of door constitutieve overexpressie lijnen. We gebruikten het modulaire groene poortkloonsysteem om een bron te genereren voor inducible cyto-specifieke expressie in de drie belangrijkste meristems van de modelplant Arabidopsis thaliana.

Met behulp van dezelfde modulaire kloonstrategie kan deze methode worden toegepast op andere plantensoorten die onveranderlijk zijn voor transformatie. Visuele demonstratie van deze procedure is waardevol omdat het analyseren van het effect van trans-activering in de meristems van de stam en de korte top dissectie vereist voor beeldvorming, wat behoorlijk uitdagend kan zijn. Om te beginnen steriliseren de zaden zoals beschreven in het tekstprotocol.

Bereid vervolgens het medium Half-Sterkte Murashige en Skoog voor op pH 5,8 en voeg 1 procent sacharose en 0,9% agar toe. Voeg Na autoclaving Dex opgelost in DMSO toe aan de inductieplaten bij een uiteindelijke concentratie tussen 10 en 30 micromolar. Voeg een gelijke hoeveelheid DMSO toe aan de controleplaten.

Zet de zaden voor wortel beeldvorming op platen en stratificatie ze voor 48 uur in het donker en op vier graden Celsius. Zet de platen in een verticale positie in een plantenbroedmachine en laat ze vijf dagen groeien. Vijf dagen na de ontkieming, gebruik confocale laser scanning microscopie om de zaailingen beeld.

Om te beginnen, bereiden en groeien de zaden zoals beschreven in het tekstprotocol. Zes tot zeven dagen na de ontkieming, breng elke zaailing naar de bodem in een aparte pot. Als u de planten door water geeft, gebruikt u een DEX-oplossing van 25 micromolar in water, bereid uit een voorraad van 25 millimolar DEX opgelost in ethanol.

Water om de twee tot drie dagen tot de gewenste tijd van inductie. Als u dompelen door dompelen, bereiden een een-liter beker met 750 milliliter water met 0,02%Silwet L77 en DEX bij 25 micromolar definitieve concentratie of een gelijkwaardige hoeveelheid DMSO voor de DEX en mock behandeling. Dompel een enkele plant gedurende 30 seconden in de inductie- of schijnoplossing.

Herhaal elke twee tot drie dagen, tot de gewenste tijd van beeldvorming. Om te beginnen, bereiden en groeien de zaden zoals beschreven in het tekstprotocol. Zes tot zeven dagen na de ontkieming, breng elke zaailing naar de bodem in een aparte pot.

Wanneer de stengel ongeveer een centimeter lang is, spuit de influorescente SAM met tussen de 10 en 50 micromolar DEX-oplossing in water. Voor inductie en beeldvorming in latere stadia van ontwikkeling, induceren SAM's van langere stengels of zijscheuten. 24 tot 48 uur na inductie ontleedt u de SAM's en gaat u over tot beeldvorming.

Breng eerst de zaailingen van de plaat naar een 10 microgram per millileteroplossing van propidiumjodide en houd ze gedurende vijf minuten tegen. Plaats de wortels in een microscoop beeldkamer en beeld ze met behulp van een confocale laser scanning microscoop met een 63x water onderdompeling doelstelling. Om propidium jodidefluorescentie te visualiseren, gebruik je een excitatiegolflengte van 488 nanometer en verzamel je de uitstoot tussen 590 en 660 nanometer.

Gebruik voor mTurquoise2 fluorescentie 458 nanometer excitatie en verzamel de uitstoot tussen 460 en 615 nanometer met behulp van sequentiële scanning. Bevestig eerst een steel met een vinger aan de andere kant van de gewenste sectie. Met behulp van een scheermesje, snijd een segment van ongeveer drie centimeter en het uitvoeren van verschillende fijne bezuinigingen.

Spoel het scheermesje in een petrischaaltje met kraanwater en verzamel de stengelsecties. Ofwel vlekken op de secties of direct monteren op microscoop dia's. Voor het bevlekken, bereiden een milliliter van een 250 microgram per milliliter oplossing van propidium jodide in een reactiebuis.

Haal het kraanwater uit de petrischaal met een pipet en vervang het gedurende vijf minuten door de propidium jodideoplossing en vlek. Verwijder vervolgens de propidium jodideoplossing en spoel af met water. Met behulp van fijne tangen of een fijne penseel, breng de gekleurde secties naar microscoop dia's.

Gebruik een confocale laser scanning microscoop met een 25x dompelen water onderdompeling lens om de monsters beeld. Gebruik een laserlicht van 561 nanometer om propidium jodidefluorescentie op te wekken en de uitstoot van 570 tot 620 nanometer te verzamelen. Gebruik een laserlicht van 405 nanometer om de mTurquoise2 fluorofofofeffector te prikkelen die door de bestuurderslijn is gecodeerd en de uitstoot van 425 tot 475 nanometer te verzamelen.

Gebruik eerst tangen om de steel twee centimeter onder de schietpunt te snijden. Houd de steel in één hand en gebruik fijne tangen om de bloemknoppen en grote primordia te verwijderen. Om jonge primordia te verwijderen, bevestigt u de SAM rechtop in een petrischaaltje met drie procent agarose.

Gebruik vervolgens een verrekijker en tangen om een jonge primordia dicht bij de SAM te verwijderen. Breng de ontleed SAM over op een buis met een 250 microgram per milliliter oplossing van propidium jodide. Laat het monster vijf tot tien minuten vlekken terwijl u ervoor zorgt dat het monster tijdens de kleuringsprocedure volledig onder water blijft.

Plaats de gekleurde SAM in een kleine petrischaal met drie procent agarose medium. Bedek de SAM met dubbel gedestilleerd water. Gebruik een confocale laser scanning microscoop uitgerust met een 25x dompelen water onderdompeling lens om het beeld van de ontleed SAM's.

Gebruik een laserlicht van 561 nanometer om propidium jodidefluorescentie op te wekken en emissies te verzamelen van 570 tot 620 nanometer. Gebruik een laserlicht van 405 nanometer om de mTurquoise2 fluorofoof op te wekken en de uitstoot van 425 tot 475 nanometer te verzamelen. Neem beeldstapels van 50 micrometer in de Z-richting op met een stapgrootte van 0,5 micrometer.

Inductie met DEX leidt tot cel-type specifieke mTurquoise2 expressie in de wortel endodermis de phloem precursoren en cambium, en de stamcellen in de shoot apicale meristem. Als testcase voor transactivering wordt een effectorregel gegenereerd die de secundaire celwandmastertranscriptiefactor VND7 fused naar het V16-activeringsdomein zingsel. Na vijf dagen van enkele behandeling met ofwel 15 microliters van DEX of DMSO, worden stamsecties voorbereid op de visualisatie van de buitenbaarmoederlijke lignificatie in de beginschede.

De start schede cellen in geïnduceerde monsters tonen een sterk signaal voor de propidium jodide kanaal en sommige cellen tonen de typische reticulate verdikking van de celwand in xylem cellen. Na het bekijken van deze video, moet u een duidelijk begrip van hoe genexpressie in verschillende weefsels induceren en hoe u uw monsters voor te bereiden op beeldvorming. Na deze procedure kunnen de gevestigde bestuurderslijnen worden gebruikt met een breed scala aan effectorconstructies die door andere gebruikers worden gegenereerd op basis van hun onderzoeksinteresses.

Deze snelkoppeling moet plantenonderzoekers helpen om snel het effect van celtypespecifieke expressie of knockdown van een gen van belang op een tijd gereserveerde manier te beoordelen. Dit celspecifieke inductiesysteem vereist het gebruik van de corticosteroïde dexamethasone. Direct contact moet worden vermeden, dus het is belangrijk om handschoenen en een gezichtsmasker te dragen tijdens de behandeling.