Individuele autoreactieve Germinal Centers door Photoactivation in een gemengd chimeer Model van Autoimmunity ondervragen

Dit fysiologisch relevante chimerische model van spontane autoreactieve kiemcentra maakt het mogelijk cellulaire lokalisatie in vivo te koppelen met downstream moleculaire analyses. Het belangrijkste voordeel van de gemengde chimeric model van autoreactieve kiminale centra is de veelzijdige en marginale aard, waardoor de ondervraging van vrijwel elke gewenste cellulaire subset of moleculaire route. De fysiologische relevantie van dit model van auto-immuunziekte ontwikkeling maakt nieuwe inzichten die de vooruitgang van nieuwe therapieën kunnen helpen.

Dit beenmerg chimera model kan worden gebruikt in immunologie, immuno-oncologie, en stamcelonderzoek. De fotoactiviteit component heeft breed gebruik, omdat het weefsel lokalisatie verbindt met downstream cel analyse. De beenmergvoorbereiding en reconstitutie en in vivo etiketterings- en weefseluitputtingsstappen zijn allemaal technisch complexe procedures die zich goed lenen voor visuele demonstraties.

Om de donor 564Igi muisdijbeen en scheenbeen te extraheren, verwijder de huid van een achterpoot en haal je de knie- en enkelgewrichten eruit door krachtig aan de voet te trekken. Ga verder met het breken van het enkelgewricht. Trek vervolgens de voet naar het lichaam terwijl je het scheenbeen vasthoudt, waardoor de pezen en spieren uit het scheenbeen worden gestreefd.

Breek het kniegewricht om het scheenbeen los te laten, en trek het bot naar het lichaam terwijl je vasthoudt aan het dijbeen om de pezen en spieren uit het dijbeen te strippen. Maak vervolgens een incisie op het heupgewricht en snijd de pezen voordat u het dijbeen uit de heupkas trekt. Na het verwijderen van de contralaterale achterste ledematen botten op een soortgelijke manier, wrijf de botten zorgvuldig met een grove papieren handdoek om de resterende spier en bindweefsel te verwijderen, en spoel de gestripte botten in ijskoude beenmerg buffer.

Gebruik dan Dumont nummer zeven tangen om de botten over te brengen naar een container met verse beenmergbuffer op ijs. Om de beenmergcellen te extraheren, spoelt u een mortel in ijskoude beenmergbuffer en gebruikt u een serologische pipet van 10 milliliter om de wasbuffer te vervangen door 10 milliliter verse, ijskoude beenmergbuffer. Gebruik de tangen om de botten over te dragen aan de mortel, en gebruik een stamper te verpletteren en malen de botten om het beenmerg vrij te geven.

Gebruik de 10-milliliter pipet om het beenmergextract te verzamelen voordat u de beenmergoplossing door een 70-micrometercelzeef in een conische buis van 50 milliliter op ijs passeert. Spoel vervolgens de mortel af met nog eens 10 milliliter verse, ijskoude beenmergbuffer om een volledig herstel van de cellen te garanderen. Om de donorsuspensies voor te bereiden, meng je de juiste hoeveelheden fotoactief GFP en 564Igi donormerg in een conische buis van 50 milliliter en pellet de cellen door middel van centrifugatie.

Resuspend de gemengde cel pellet met een concentratie van een keer 10 tot de acht cellen per milliliter van ijskoude beenmerg buffer, en breng de cellen naar een voorgekoelde, 1,5-milliliter microcentrifuge buis op ijs. Bevestig vervolgens een gebrek aan respons op teenknijpen in de verdoofde CD45.1-ontvangermuis en veeg de buis van donorbeenmergcellen om een adequate resuspensie te garanderen. Laad 200 microliter beenmergmix in één 0,3 milliliter, 30-meter insulinespuit en strek, met de ontvanger op zijn kant, de huid voorzichtig boven en onder het oog om het oog er iets uit te steken.

Steek de punt van de spuit voorzichtig in een hoek van ongeveer 30 graden in de voorkant van de oogkas, waarbij u ervoor zorgt dat het oog en het omliggende weefsel worden vermeden. Wanneer de punt van de naald raakt het bot onderstrepend de oogkas, trek de naald ongeveer 0,5 millimeter voordat u constante druk gebruikt om het donorbeenmerg langzaam te injecteren. Dan, de muis terug naar zijn kooi met ad libitum antibioticum water, met monitoring tot volledig herstel.

Om de popliteale lymfeklier te labelen, verdun twee microliter van fycoerythrin-gelabelde rat anti-muis CD169 antilichaam in 18 microliters van PBS, en voeg twee 10-microliter druppeltjes van het antilichaam op een stuk plastic paraffine film. Laad elke druppel in een enkele 0,3-milliliter insulinespuit met een naald van 30 meter en injecteer 10 microliter antilichaam in het voetpad van het verdoofde ontvangende dier. Voordat u de lymfeklier oogst, plaatst u een vierkante afdekking op een vlakke ondergrond en gebruikt u een vacuümvetgeladen, vijf milliliterspuit om de randen van de coverslip te traceren met vet van ongeveer één tot twee millimeter van elke rand.

Breng de kamer over op een koud, vlak oppervlak en vul de vacuümvetkamer met ijskoude beenmergbuffer. Om toegang te krijgen tot de popliteale lymfeklieren, gebruik rechte, fijne schaar om een incisie in de huid net onder de knie put van de geëuthanaseerde ontvanger dier te maken, en de snede omhoog langs de hamstring-lijn bijna uit te breiden tot het heupgewricht. Met behulp van Dumont nummer vijf of nummer zeven tangen, trek elk van de blootgestelde flappen van de huid naar buiten om het weefsel bloot in de popliteal fossa, en gebruik de tangen om zorgvuldig in de fossa gewoon medial naar de popliteal ader.

Open en sluit de tang langs de as van het been om de onderliggende popliteale lymfeklier bloot te stellen voordat u de duim en wijsvinger gebruikt om de quadricepsspier van de voorkant proximaal naar de knie te knijpen, om de lymfeklier uit de fossa te knallen. Schuif de tangen onder de lymfeklier om het knooppunt uit het omringende weefsel te bevrijden en plaats het in de vacuümvetkamer. Nadat de tweede lymfeklier is verzameld, plaatst u een tweede coverslip op de vacuümvetrand en druk zachtjes naar beneden om de kamer te sluiten, waarbij u ervoor zorgt dat alle luchtbellen worden geëxtrudeerd.

Om de kiemcentra in geoogste miltweefselmonsters te identificeren, plaatst u de beeldkamer op het podium van een fluorescerende microscoop met twee foton en gebruikt u een 3,5 milliliter plastic transferpipet om een druppel gedestilleerd water op de bovenste coverlip te plaatsen. Verlaag het doel tot het contactpunt en gebruik het uitgezonden licht om zich te concentreren op de bovenkant van het weefsel. Schakel over naar de donkere modus en twee foton excitatie, en stem de laser af op 940 nanometer.

Zoek de individuele witpulp gebieden omzoomd door de CD169 vlekken in de buurt van het oppervlak van het weefsel, en identificeren van de periarteriolar lymfoïde schede door de tweede harmonische generatie geassocieerd met de centrale arteriole. In de zone tussen de periarteriolar lymfoïde schede en de marginale zone, identificeren van de aanwezigheid van zeer autofluorescent, geactiveerd tingible-body macrofagen en, met behulp van deze oriëntatiepunten, trekken een regio van belang rond een enkele kiedele centrum gebied. Zet vervolgens een Z-stack van ongeveer 100 tot 150 micrometer diepte in, vanaf het oppervlak van het weefsel en gebruik een stapgrootte van ongeveer drie micrometer voordat u overschakelt naar een excitatiegolflengte van 830 nanometer.

Schakel alle kanalen uit of dim ze om fotoschade aan de detectoren te voorkomen en de stapel in beeld te brengen. Schakel vervolgens terug naar de 940-nanometer excitatiegolflengte en heropen de kanalen, scannen door de stapel om een efficiënte fotoactiviteit en een afwezigheid van fotoschade in de beeldstapel te bevestigen. Serotypering van de gemengde beenmerg chimeras onthult genormaliseerde B-celnummers na zes weken na de reconstructie, met een lage frequentie van 9D11-positieve circulerende B-cellen afgeleid van het 564Igi-compartiment.

Binnen de totale lymfocytenpoort was er een lage frequentie van restcellen van de ontvanger, waarvan ongeveer 6% cd45.1-afgeleid is, wat duidt op een algehele mate van chimerisme van ongeveer 94%Er was een vrijwel volledige chimerism in het B-celcompartiment en een dominantie van foto-ondrenderende GFP-beenmerg-afgeleide B-cellen, een gevolg van de negatieve zware zware selectie van 564Igi-afgeleide B-cellen. Zoals waargenomen, in vivo etikettering met CD169 vergemakkelijkt een robuuste visualisatie van de marginale zone. Het tweede harmonischensignaal is zichtbaar in collageenhoudende structurele elementen en belangrijke vaten, waaronder de centrale arteriool van de periarteriolar lymfoïde schede en zeer autofluorescent, geactiveerd tingible-body macrofagen geassocieerd met de kierale centrum activiteit.

Samen maken deze gegevens de identificatie mogelijk van een gebied van belang dat waarschijnlijk één enkel, fotoactief kiemcentrum bevat. Downstream flow cytometrische evaluatie bevestigt verder de aanwezigheid van genormaliseerde B-cel compartiment nummers, een spontane kiem centrum populatie, en een subset van fotogeactiveerde kiem centrum B cellen. Het is belangrijk om de totale doorlooptijd van explanting, fotoactivatie en weefselverwerkingsstappen te beperken tot vier tot zes uur om een voldoende cel levensvatbaarheid te garanderen.

De fotogeactiveerde cellen kunnen worden gesedorteerd en onderworpen aan eencellige sequenties om bijvoorbeeld het B-celrecepteroire van één kiemcentrum te karakteriseren. De gemengde chimaera model heeft toegestaan de exploratie van autoreactieve kiminale centrum biologie op een nieuwe diepte, bijvoorbeeld, het verstrekken van inzicht in hoe het proces van epitoop verspreiding ontvouwt. Merk op dat de lichtbron voor twee-foton microscopie zijn zeer krachtige gepulseerde Klasse 4 lasers die ernstig kan beschadigen de ogen.