Hoge-resolutie 3D-beeldvorming van rabiës virus infectie in solvent-geklaard hersenweefsel

Dit protocol maakt de visualisatie van virusinfectie mogelijk en biedt diepgaande inzichten in spatiotemporale resolutie van de infectieomgeving en de omringende cellulaire context. De toepasbaarheid van immunostaining op diepe weefselbeeldvorming maakt niet alleen de detectie van virussen mogelijk, maar maakt in feite ook de differentiatie van verschillende cellulaire subpopulaties mogelijk met behulp van hun respectieve celmarkers. Om het weefsel vast te stellen voor immunostaining plaats de hersenmonsters in een verhouding van 1 tot 10 van 4% paraformaldehyde in PBS om weefselvolume gedurende ten minste 48 uur bij vier graden Celsius te bemonsteren.

Aan het einde van de fixatieperiode wassen de weefselmonsters drie maal in PBS gedurende ten minste 30 minuten per wasbeurt alvorens de monsters over te brengen naar 02% natriumaveide in PBS bij vier graden Celsius. Gebruik vervolgens een vibratome ingesteld op een 0,3 tot 0,5 millimeter per seconde blade feed rate om de weefsels sectie in een millimeter dikke secties. Bewaar de secties in verse 02% natriumaed in PBS op vier graden Celsius.

Voor methanol voorbehandeling dompel de monsters onder in een opgaande methanolserie zoals aangegeven voor een uur per incubatie bij kamertemperatuur met zachte oscillatie. Na de laatste incubatie koelen de monsters tot vier graden Celsius. Vervang de 100% methanol door vier milliliter voorgekoelde bleekoplossing voor een nachtelijke incubatie bij vier graden Celsius.

De volgende ochtend vervangen de bleekoplossing met vier milliliter verse 80% methanol voor een uur incubatie bij kamertemperatuur. Dan onderdompelen de monsters in een dalende reeks van methanol in omgekeerde van wat net werd aangetoond, het wassen van de monsters een keer voor een uur in vier milliliter PBS na de 20% methanol onderdompeling. Voor immunosmetting van de hersenweefselsecties was je de monsters twee keer gedurende een uur in vier milliliter van 0,2%Triton X-100 in PBS, gevolgd door permeabilisatie gedurende twee dagen bij 37 graden Celsius in vier milliliter van 0,2%Triton X-100, 20%dimethylsulfoxide en 0,3 molar glycine in PBS.

Blokkeer elke niet-specifieke binding met vier milliliter van 0,2%Triton X-100, 10%dimethylsulfoxide en 6% normaal serum in PBS gedurende twee dagen bij 37 graden Celsius. Aan het einde van het blokkecatielabel worden de monsters gedurende vijf dagen bij 37 graden Celsius met twee milliliter primaire antilichaamoplossing vernieuwd, waarbij de antilichaamoplossing na twee en 1/2 dagen wordt vernieuwd. Vervolgens was de monsters voor een dag in vier milliliter van 0,2%Tween 20 en 10 microgram per milliliter heparine in PBS het uitwisselen van de wasbuffer ten minste vier tot vijf keer in de loop van de dag en het verlaten van de laatste wassen op 's nachts.

De volgende dag, incubeer de monsters in twee milliliter secundaire antilichaam oplossing gedurende vijf dagen bij 37 graden Celsius. Dan was de monsters in vier milliliter verse 0,2%Tween 20 en 10 microgram per milliliter heparine in PBS zoals aangetoond. Voor het ontsteken van de monsters worden de monsters gedurende vijf uur in vier milliliter van de nucleïnezuurvlek TO-PRO-3 tegen licht beschermd.

Aan het einde van de incubatie was de monsters in 0,2%Tween 20 en 10 microgram per milliliter heparine in PBS, gevolgd door uitdroging in een opgaande tert-butanol serie gedurende twee uur per onderdompeling. Na de 90% onderdompeling brengen de monsters 's nachts over naar een 96%tert-butanoloplossing. De volgende ochtend, dehydrateren de monsters verder in 100% tert-butanol gedurende twee uur voor het opruimen van de weefselsecties in vers bereide BABB-D15 gedurende twee tot zes uur totdat ze optisch transparant zijn.

De monsters kunnen vervolgens worden opgeslagen in BABB-D15 beschermd tegen licht tot hun montage en beeldvorming. Voor monstermontage gebruikt u een 3D-printer om een beeldkamer en deksel af te drukken. Monteer een 30-millimeter diameter coverslip op de beeldkamer met een-component kamertemperatuur vulkaniseren siliconen rubber.

Ook monteren een 22-millimeter coverslip op het deksel. Gebruik een water-bevochtigde wattenstaafje om het overtollige siliconen rubber op beide ringen te verwijderen alvorens het rubber om 's nachts te genezen. De volgende dag, plaats een monster in de beeldkamer en voeg een klein volume van BABB-D15 aan de kamer voor het invoegen van het deksel.

Vul de kamer met behulp van een injectienaald met BABB-D15 door de inlaat en sluit de inlaat aan voordat de beeldkamer wordt afgesloten met siliconenrubber. Als u de beeldverwerving wilt instellen, selecteert u de juiste laserlijnen voor de gebruikte fluorofooren en past u de detectiebereiken van elke detector aan om overlap tussen kanalen te voorkomen. Stel vervolgens de acquisitieparameters in om de boven- en onderrand van de Z-stack te vinden en de afbeeldingsstack te verwerven.

Als u 3D-projecties van de afbeeldingsstack wilt genereren, opent u de afbeeldingsbestanden in Fiji en selecteert u Hulpmiddel Afbeeldingskleurkanalen Meer en Gesplitste kanalen om de samengevoegde afbeeldingen op te splitsen in afzonderlijke kanalen. Selecteer voor bleekmiddelcorrectie van de afbeeldingen voor elk kanaal Afbeeldingscorrectie aanpassen en selecteer Eenvoudige verhouding. Gebruik de schuifregelaars om de helderheid en het contrast voor elk kanaal aan te passen en selecteer Afbeeldingskleur en Samenvoegkanalen.

Vink de optie Composiet maken aan. Converteer de afbeelding naar RGB-indeling en selecteer Afbeeldingsstapels en 3D-project om een 3D-projectie te genereren. Selecteer Helderste punt als projectiemethode en stel de segmentafstand in op de grootte van de Z-stap van de overgenomen afbeeldingsstapel.

Stel voor een maximale kwaliteit de verhoging van de rotatiehoek in op één en schakel interpolatie in. Wijzig de totale rotatie, transparantiedrempels en Dekking indien nodig. Sla vervolgens de 3D-projectie op als zowel tiff- als AVI-bestandsindelingen.

Met behulp van immunostaining van rabiës virus fosfoprotein complexe lagen van geïnfecteerde neuronale cellen kunnen worden gevisualiseerd in dikke delen van de muis hersenweefsel monsters. Vervolgens kunnen naadloze 3D-projecties van de verworven beeldstapels worden gereconstrueerd. Vanwege de hoge resolutie waarmee de beeldstapels worden verworven, kan de infectie worden beoordeeld tot een enkelcellig niveau, waardoor beweringen over bijvoorbeeld de overvloed en distributie van antigeen binnen een cel van belang.

Naast muis hersenweefsel, kan het protocol worden toegepast op hersenweefsel monsters van andere diersoorten. Bijvoorbeeld, secties verkregen uit verschillende compartimenten van een geïnfecteerde fret hersenen onthullen een verschillende mate van rabiës virusinfectie. Astrocyten kunnen worden onderscheiden via de expressie van gliafibrillair zuur eiwit, terwijl neurites specifiek kunnen worden gekleurd voor microtubuli-geassocieerde eiwit II.Tegelijkertijd kunnen virale eiwitten worden mede-gekleurd om de relatie tussen de geïnfecteerde cellen en de gemarkeerde cellulaire subpopulatie te beoordelen.

Voor immunostaining is de keuze van antilichamen om de proteïnen van belang te detecteren van cruciaal belang. Hoewel standaard immunohistochemieconcentraties vaak een goed uitgangspunt zijn, kunnen sommige antilichamen extra moeten worden aangepast. Veel van de chemische stoffen die in dit protocol worden gebruikt, hebben schadelijke eigenschappen.

Voer het desbetreffende experiment uit in een rookkap met passende persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder een labjas en handschoenen.