Onderzoeken van veranderingen in caecum microbiota na traumatisch hersenletsel bij muizen
19 september 2019
Hier gepresenteerd is een protocol voor het opwekken van diffuse traumatisch hersenletsel met behulp van een laterale vloeistof percussie-apparaat gevolgd door de verzameling van het caecum inhoud voor gut microbiome analyse.
Gelijktijdigheid en de lijnen interacties tussen de hersenen en de darm microbiota blijft onbekend. Gebruik deze techniek, veranderingen in de darmmicrobiota na traumatisch hersenletsel bij muizen kunnen worden onderzocht. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het relatief eenvoudig en efficiënt is.
Het aantonen van de procedure zal Wendong You zijn, een afgestudeerde student van mijn laboratorium. Voor traumatische hersenletsel inductie, bevestigen een gebrek aan reactie op teen knijpen in een verdoofde muis, en van toepassing zalf op de ogen van het dier. Ontsmet de blootgestelde hoofdhuidhuid na het scheren met 70%-ethanol voordat de hoofdhuid in een sagittale vlak wordt ingesneden.
Met behulp van tangen trekt u de incisie aan beide zijden in en scheidt u het periosteum iets. Gebruik een marker om een cirkel met een diameter van drie millimeter te tekenen op het rechter pariëtale gebied van de schedel op twee millimeter afstand van de middellijn. Gebruik een elektrische boor om zorgvuldig de schedel binnen te dringen zonder de dura te beschadigen.
Verwijder de botflap om een drie millimeter botvenster bloot te leggen en plaats een plastic letsel canule over de craniotomie. Na het cementeren van de canule aan de schedel met gebits acryl, gebruik een vijf-milliliter spuit om de canule te vullen met steriele 0,9% normale zoutoplossing, waarbij u ervoor zorgt dat bellen worden vermeden. Zet de oscilloscoop en versterker aan.
Bevestig dat de hogedrukbuis van het zijdelingse vloeistofpercussieletsel apparaat vrij is van luchtbellen, en leveren ongeveer 10 testpulsen, totdat het apparaat een stabiel signaal geeft. Pas de hoek van de slinger startpositie aan om een pulsintensiteit van ongeveer twee standaard atmosfeer te bereiken en sluit de letselkanule aan op het laterale vloeistof percussie letsel apparaat. Haal de trekker over om de slinger los te laten, waardoor het hersenletsel wordt veroorzaakt.
Verkrijg en breng vervolgens een puls naar de dura door het hele gesloten, met vloeistof gevulde buizensysteem. Na hersenletsel inductie, verwijder de canule en hecht de incisie. Plaats vervolgens de muis op een verwarmingskussen met controle totdat het ambulante is, voordat u het dier terug naar zijn huiskooi met ad libitum toegang tot voedsel en water.
Op de aangegeven experimentele tijdstippen, bloot de darmen volgens standaard protocollen en gebruik atraumatische tangen om de caecum voorzichtig te scheiden van de andere darmkanaal. Wanneer het weefsel zich is gelokaliseerd, snijd u de caecum met een scherpe schaar en haal de caecuminhoud handmatig op een steriele dressing. Breng de inhoud vervolgens over naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter, voor min 80 graden Celsius opslag tot microbioomanalyse.
16S recombinant DNA sequencing toont een verminderde diversiteit in caecum microbiota bij muizen drie dagen na traumatisch hersenletsel, met de meest voorkomende taxa binnen de caecum inhoud van de sham en traumatische hersenletsel groepen weergegeven in de figuur. Verder, niet-metrische, multidimensionale schaling onthult veranderingen in de samenstelling van de caecum microbiota na traumatisch hersenletsel. Vergeet niet om dura intact te houden bij het boren van de schedel, en om voorzichtig te zijn bij het lokaliseren en scheiden van de caecum van andere darmkanaals.
Na deze procedure kunnen hematoxylin en eosine kleuring en analyse worden uitgevoerd om de histologische verandering en ontstekingsreactie in darmkanaals na traumatisch hersenletsel te onderzoeken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het induceren van diffuus traumatisch hersenletsel (TBI) bij muizen met behulp van een lateraal fluid percussion-apparaat. Na het letsel onderzoekt de studie veranderingen in de darmmicrobiota door de inhoud van het caecum te verzamelen voor analyse. De benadering is erop gericht de interacties tussen hersenletsel en de samenstelling van de darmmicrobiota te verduidelijken.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Microbioomanalyse
- Onderzoek naar traumatisch hersenletsel
Achtergrond
- Het begrijpen van de relaties tussen de hersenen en de darmmicrobiota is essentieel in het onderzoek naar TBI.
- De huidige kennis over hoe TBI de darmmicrobiota beïnvloedt is beperkt.
- Het gebruik van muizen als modelorganisme maakt gecontroleerde experimentele omstandigheden mogelijk.
Doel van de studie
- Om een betrouwbaar protocol te ontwikkelen voor het induceren van TBI en het analyseren van daaropvolgende veranderingen in het darmmicrobioom.
- Om potentiële correlaties tussen neurologisch letsel en de diversiteit van de darmmicrobiota te onderzoeken.
- Om inzicht te verschaffen in de effecten van TBI op de algemene gezondheid en interacties van het microbioom.
Gebruikte methoden
- Een lateraal vloeistofpercussieapparaat werd gebruikt om TBI op te wekken bij geanestheseerde muizen.
- Er werden zorgvuldige chirurgische procedures uitgevoerd, waaronder schedelpenetratie en canule-implantatie.
- Na de letselperiode werden de inhoud van het caecum verzameld voor microbiomanalyse en op passende wijze bewaard.
- 16S rDNA-sequencing werd toegepast om veranderingen in de diversiteit en samenstelling van het microbiota te bepalen.
Belangrijkste resultaten
- Analyse wees op een verminderde diversiteit van het microbiota in het caecum binnen drie dagen na TBI.
- Niet-metrische multidimensionale schaling toonde significante verschuivingen in de samenstelling van het microbiota na het letsel aan.
- De studie benadrukt de noodzaak van voorzichtigheid bij het hanteren van weefsels en het handhaven van steriele omstandigheden.
Conclusies
- Deze studie stelt een methodologie vast voor het onderzoeken van de darm-hersen-as in de context van TBI.
- Bevindingen suggereren dat TBI de darmmicrobiota kan verstoren, wat gevolgen kan hebben voor het herstel.
- Het uitbreiden van de kennis over darm-hersen-interacties kan toekomstige therapeutische strategieën voor TBI informeren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Dit protocol maakt mechanistische risicovermindering van de microbiota-darm-hersenas in onderzoek naar traumatisch hersenletsel mogelijk door een reproduceerbaar model te bieden voor het beoordelen van microbiome-veranderingen na letsel. Het ondersteunt targetvalidatie en de ontdekking van biomarkers door neurologisch trauma te koppelen aan kwantificeerbare verschuivingen in de samenstelling van de microbiota in het caecum. De aanpak vergroot het voorspellende vertrouwen in preklinische studies door de inductie van TBI en de workflows voor microbiome-bemonstering te standaardiseren.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van hypothesen over de darm-hersenas mogelijk door veranderingen in de diversiteit van het microbiota te meten na een gecontroleerde inductie van TBI.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerde chirurgische en bemonsteringsprocedure voor een consistente collectie van het microbiota uit het caecum over de experimentele groepen heen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve 16S rDNA-sequencingresultaten om microbiële compositorische verschuivingen in caecummonsters te profileren.
- Operationele waarde: Vestigt een reproduceerbare workflow voor microbiome-analyse die geïntegreerd kan worden in screening-pipelines voor therapeutica gericht op de darmen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt systeemmodellering van ziekten door de ernst van TBI te correleren met veranderingen in het microbioom in een muismodel.
- Operationele waarde: Maakt longitudinale monitoring van veranderingen in de microbiota mogelijk om risico-gecorrigeerde beslissingen over de voortgang in preklinische programma's te onderbouwen.
Integratie van pijplijn en workflow
De methode slaat een brug tussen discovery biology en preklinische validatie door de inductie van TBI en de analyse van het darmmicrobioom te standaardiseren voor het verminderen van risico's bij target-identificatie.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothesetoetsing naar interacties tussen microbiota, darm en hersenen via gecontroleerde letsels en microbiome-profilering.
- Screening: Levert gestandaardiseerde microbiota-monsters uit het caecum die geschikt zijn voor daaropvolgende 16S-sequencing en diversiteitsanalyse.
- Analytics: Maakt kwantitatieve vergelijking van de microbiële samenstelling mogelijk via niet-metrische multidimensionale schaling en diversiteitsstatistieken.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt neurologische letselmodellen met microbiome-biomarkers voor preklinische continuïteit.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het bestuderen van modulatie van de darm-hersen-as in neurologische ziektemodellen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in onderzoek naar de darm-hersenas door kwantificeerbare microbiota-uitlezingen na TBI te bieden.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde chirurgische, bemonsterings- en sequencingsprotocollen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door TBI-modellen te koppelen aan microbioom-gebaseerde biomarker-signaturen.
- Portefeuille-impact: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen die gericht zijn op darm-hersenasinteracties bij TBI-herstel.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in chirurgische procedures bij muizen en steriele weefselafname.
- Afhankelijk van toegang tot apparatuur voor laterale vloeistofpercussie-letsel en infrastructuur voor 16S rDNA-sequencing.
- Vereist standaardisatie tussen de teams voor neurowetenschappen en microbiomanalyse.
- Omvat overwegingen voor de aanpassing van caecum-bemonstering bij verschillende muizenstammen of letselmodellen.
- Beperkt door de noodzaak van aseptische technieken tijdens de dissectie van darmweefsel om contaminatie te voorkomen.
