Het uitvoeren van de spectroscopie op Plasmonic nanodeeltjes met transmissie-gebaseerde Nomarski-type differentiële interferentie contrast microscopie

DIC microscopie is superieur aan donker veld bij imaging plasmonische nanodeeltjes in complexe omgevingen. DIC vereist echter ook meer kennis en vaardigheden om reproduceerbare resultaten te verkrijgen. DIC-microscopie biedt zowel een hoge zijdelingse resolutie als een ondiepe scherptediepte.

Beide eigenschappen zijn uiterst belangrijk bij het monitoren van nanodeeltjes in cellen of in complexe omgevingen. Gebruik om te beginnen een krabbelsde pen om een ondiepe en korte krasmarkering op het midden van elke glazen coverslip te plaatsen en maak het glas vervolgens schoon zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Gebruik vervolgens een micropipet om 100 microliter van een 05-milligram-per-milliliter goud nanodeeltjesoplossing uit de oorspronkelijke opslagcontainer te verwijderen en de oplossing uit te werpen in een 1,5 milliliter centrifugebuis.

Centrifugeren het monster gedurende 10 minuten bij 6.000 keer zwaartekracht. Wanneer u klaar bent, verwijder de supernatant met een micropipet om zich te ontdoen van de overtollige oppervlakteactieve uit de nanodeeltjesoplossing. Voeg vervolgens 100 microliter ultrazuiver water toe aan de centrifugebuis.

Kort vortex het monster te breken van de pellet, en vervolgens sonicate het voor 20 minuten onmiddellijk daarna volledig resuspend de nanodeeltjes aggregaten. Met behulp van een micropipet, dropcast zes microliters van nanodeeltjes oplossing op de gereinigde en bekraste glazen coverslip. Draai vervolgens voorzichtig de coverslip en plaats het op de top van een tweede groter stuk microscoopglas.

De druppel moet snel gelijkmatig verspreid tussen de twee stukken glas. Zorg ervoor dat u geen luchtbellen krijgt die tussen de twee stukken glas vastzitten. Gebruik een smalle lijn nagellak om de randen van de coverslip af te sluiten om verdamping van de vloeistof te voorkomen.

Plaats het monster op het microscoopstadium en lijn de doelstelling en condensor van de microscoop uit. Pas de focus aan om het brandpuntsvlak te vinden met het voorbeeld erop en zoek het eerder gemaakte krasteken. Focus erop en stem de focus af tot de nanodeeltjes in beeld komen.

Om de nauwkeurige plaatsing van de condensor te bepalen, gebruikt u de Kohler-verlichtingsmethode door te beginnen met de 20x-doelstelling en vervolgens over te stappen op hoge vergrotingen zoals 80 of 100x. Selecteer vervolgens een interessegebied in het voorbeeld voor beeldvorming. Centreer de regio in het gezichtsveld van de camera en pas de focus zo nodig aan.

Als de microscoop het ontwerp van De Senarmont heeft, begin dan met de polarisator die zich in de buurt van maximale achtergronduitsterving afspeelt en draai de polarisator geleidelijk naar afnemende achtergrondex extinctie. De achtergrondintensiteit zal geleidelijk toenemen. De ideale instelling wordt bereikt wanneer de nanodeeltjes hun grootste intensiteitsverschil bereiken in vergelijking met het lokale achtergrondgemiddelde.

Voor plasmonische nanodeeltjes wordt het grootste contrast meestal bereikt met een relatief donkere achtergrond op of nabij de maximale achtergronduitsterving. Schakel kamerverlichting uit om te voorkomen dat verdwaalde verlichting in contact komt met het proces. Plaats een 10-nanometer volledige breedte bij half-maximale band-pass filter met zijn centrale golflengte co-gelegen met de belangrijkste gelokaliseerde oppervlakte plasmon resonantie golflengte om het gebied van belang te bekijken.

Pas vervolgens de lampintensiteit of belichtingstijd aan totdat het achtergrondniveau 5% tot 40% van het maximale capaciteitsniveau van de camera bedraagt. Geen objecten binnen het interessegebied mogen signaalintensiteiten vertonen die meer dan 90% van het maximale intensiteitsniveau van de camera bedragen. Beeld het monster met een reeks band-pass filters die elk een volledige breedte heeft op een half-maximum van 10 nanometer, en dat als geheel imaging mogelijk maken over de gehele golflengte bereik van belang.

Zorg ervoor dat de achtergrondintensiteit in de beelden binnen 5% van elkaar blijft door de belichtingstijd aan te passen en niet het lampvermogen. Nadat u van filters hebt geschakeld, moet u het voorbeeld opnieuw scherpstellen voordat u afbeeldingen vastlegt. Sla de afbeeldingen op als niet-gecomprimeerde TIFF-bestanden en/of in de oorspronkelijke bestandsindeling van de software om alle relevante informatie te bewaren.

Open de afbeelding met ImageJ om met de analyse te beginnen. Gebruik het rechthoeksgereedschap om een rechthoek rond het belangrijkste interessegebied te tekenen. Selecteer vervolgens op de werkbalk de afbeelding, ga naar zoomen en selecteer selecteren om te selecteren.

Het beeldvenster zoomt in op het geselecteerde gebied. Selecteer vervolgens de afbeelding, ga naar aanpassen en selecteer helderheid/contrast. Als u de weergave van het voorbeeldgebied wilt verbeteren, past u het minimum, het maximum, de helderheid en het contrast van de afbeelding aan.

Deze aanpassingen veranderen de wetenschappelijke gegevens niet, maar maken alleen een betere zichtbaarheid van het monstergebied mogelijk. Gebruik nu het rechthoeksgereedschap opnieuw en teken een doos rond het eerste nanodeeltje dat moet worden gemeten. De doos mag slechts iets groter zijn dan de luchtige schijf van de nanodeeltjes.

Ga na de geselecteerde opties naar analyseren en selecteer meten. Er verschijnt een nieuw venster dat de minimum-, maximum- en gemiddelde intensiteiten rapporteert voor de pixels die zich in het geselecteerde vak bevinden. Met behoud van de oorspronkelijke grootte van de doos, sleep de doos naar een gebied direct grenzend aan het deeltje waar het achtergrondcontrast relatief gelijkmatig is, en er geen deeltjes of verontreinigingen aanwezig zijn.

Gebruik het meetgereedschap opnieuw om de gemiddelde intensiteit voor het achtergrondgebied te bepalen. Herhaal dit proces voor elk deeltje in alle afbeeldingen in de serie. Exporteer vervolgens de gegevens naar een spreadsheet om het contrast of de intensiteit van elk deeltje over alle golflengten en hoeken te berekenen.

Voer in de volgende vergelijking het contrast van elk deeltje in. Ten slotte, grafiek het spectrale profiel op een bepaalde nanodeeltjes positie door het plotten van gegevens met de golflengte langs de X-as en het contrast of de intensiteit langs de Y-as. Om de optimale beeldvormingsinstelling te bepalen, werden deze gouden nanosferen afgebeeld op verschillende polarisatorinstellingen.

Bij nul graden, de deeltjes lijken meestal wit met een donkere streep loopt over hun buik. Dit is indicatief voor kruispolarisatie voor nanosfeermonsters. Wanneer de polarisator wordt gedraaid naar verschillende hoeken, de deeltjes werpen donkere schaduwen naar een hoek.

De contrastwaarden van het deeltje veranderen echter drastisch. Voor dit monster is de optimale beeldvormingsinstelling met een polarisatorverschuiving van 10 graden. Hier wordt de golflengte uitgezet tegen contrast van gouden nanosferen.

Elk gegevenspunt vertegenwoordigt een gemiddelde van 20 nanosferen voor elke deeltjesdiameter. Het piekcontrast voor elk deeltje verschuift licht afhankelijk van de grootte. De intensiteit en rotatie is nog belangrijker met anisotropische vormen zoals deze gouden nanorod.

Hier wordt de golflengte uitgezet tegen intensiteit bij twee verschillende polarisatorinstellingen. In elk geval is de intensiteit van de zonnige kant veel sterker dan die van de donkere kant. De intensiteit profiel van een enkele gouden nanorod op het gelokaliseerde oppervlak plasmon resonantie golflengte tijdens de rotatie van het podium toont een grote intensiteit verschil tussen de donkere en heldere zijden als het monster wordt gedraaid door middel van 180 graden.

Voorbeeldbeeldvorming is uiterst belangrijk. Het vereist zowel ijver en geduld van de kant van de microscopist. Als u een experiment uitvoert waarvoor het monster gedurende een reeks dagen opnieuw moet worden ontworpen, zijn oriëntatiepunten zoals de krasmarkeringen van cruciaal belang bij het verplaatsen van uw interessegebied.

DIC microscopie groeit in interesse van onderzoekers die nanodeeltjes bestuderen, vooral in dynamische en cellulaire omgevingen. Omdat DIC een optimale ruimtelijke resolutie biedt, vooral in complexe bemonsteringsomgevingen.