Name: Ex vivo doorbloeding van de knaagdieren placenta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Leer ex vivo doorbloeding van de knaagdieren placenta voor farmacologisch onderzoek. Deze methode evalueert de overdracht van xenobiotica en farmaceutische stoffen door de placenta.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het Nationaal Instituut voor milieu-gezondheidswetenschappen (R00-ES024783), Rutgers Center for environmental exposures and Disease (P30-ES005022), en Rutgers joint Graduate Program in Toxicologie (T32-ES007148). Ook willen we drs. Michael Goedken, Marianne Polunas en Pedro Louro bedanken voor hun technische expertise en Dr. Adam goodwill voor zijn hulp bij het ontwerpen van ons doorbloed schema (Figuur 5).

Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de instelling van het Comité van de Dierenzorg en het gebruik van de Universiteit Rutgers.
1. voorbereiding voor het experiment
Opmerking: deze stappen kunnen worden uitgevoerd binnen dagen/weken voorafgaand aan het experiment.
<ol><li>De schip kamer te wijzigen. Opmerking: Figuur 1a, B toont de gewijzigde enkele schip kamer.<ol>
<li>Verplaats de thermistor sensor van onder de clip en buig het zodat deze vrij in het bad van de bloed doorbloeding hangt (Figuur 1b).</li>
		<li>Installeer twee 4-inch stompe-Tip roestvrijstalen naalden met standaard Luer-aansluiting hubs, 1 25 G en 1 23 G beveiligd onder de thermistor clip en voeg een 3-weg wegkraan toe te staan voor canulatie van de navel vasculatuur (Figuur 1b). Opmerking: de Luer aansluitingen van verschillende maten zijn kleur gecodeerd. Dit vergemakkelijkt de identificatie van vaartuigen tijdens en na het experiment.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Installeer twee 70 − 100 µm glazen micropipetten. Raadpleeg voor meer informatie over deze procedures de volgende verwijzingen10,11. Opmerking: de tip diameter vaak gebruikt in deze experimenten is in het bereik van 70 − 100 µm. Tip diameters groter dan dit bereik kan moeilijkheid toe te voegen aan het canulatie proces, terwijl Tip diameters kleiner dan 60 µm kan punctie de vaatwand tijdens canulatie.</li>
	<li>Bereid banden van steriele nylon hechting (voor proximale en distale uiteinden van de baarmoeder slagader) en van zwart gevlochten zijde niet-steriele hechting (voor de navelstreng schepen). Maak enkele banden door lus hechting als een vierkante knoop te starten of een schoen te binden, zoals eerder beschreven11. Opmerking: enkele banden worden vaak gemaakt en bewaard in een Petri schaaltje gevuld met een kleine laag van siliconen rubber te helpen werken op een kleverige achtergrond.</li>
	<li>Bereid 2 L fysiologische zoutoplossing (PSS) voor die, in mmol/L, 129,8 NaCl, 5,4 KCl, 0,5 NaH2po4, 0,83 MgSO4, 19 NaHCO3, 1,8 CaCl2, en 5,5 glucose. Pas de pH aan 7,40 ± 0,02 door langzaam toe te voegen een paar druppels zuur (1 M zoutzuur) of Base (1 N natriumhydroxide) aan de oplossing en wacht ten minste 20 s voor het lezen van de aangepaste pH-meting. Store PSS tot klaar voor gebruik in de koelkast om verontreiniging te verminderen, maar niet op te slaan voor meer dan 2 weken.</li>
	<li>Label microcentrifuge tubes voor het verzamelen van "moeders" en "foetale" effluenten op elk tijdstip, dat wil zeggen, "MBaseline, M10, M20,..." tot 180 min timepoint. Bereid hetzelfde voor op foetale effluenten (FBaseline, M10, M20,....).</li>
	<li>Kalibreer alle apparatuur die wordt gebruikt in het systeem, met inbegrip van de circulerende Bad temperatuur en bloeddrukmeters in verband met het behoud van de baarmoeder (80 mmHg) en de navelstreng (50 mmHg) perfusaat druk.</li>
	<li>Bereid een dissectie kamer (4 "diameter x 1" diep) of een circulerende kachel schotel door het vullen van een laag (< 0,25 ") van siliconen rubber. Deze wijziging moet vooraf worden gedaan en als het duurt 12 − 24 uur voor de rubber te drogen. Opmerking: het gebruik van een Recirculerende kachel/koeling schotel wordt aanbevolen voor beginnende chirurgen, als de schotel zal niet bewegen en het weefsel zal een consistente temperatuur te handhaven.</li>
</ol>2. voorbereiding van het chirurgisch station en evenwicht van apparatuur
<ol><li>Zet alle apparatuur die het transfusie systeem ondersteunt om te controleren of de juiste functie. Verwijder de PSS van de koeling en warm tot kamertemperatuur. De PSS wordt gebruikt als een perfusaat en een superfusate.</li>
	<li>Plaats een kleine borrelende steen om een gasmengsel in het superfusate reservoir te leveren. Veelgebruikte mengsels zijn 21% O2, 8% o2, 3% o2, en 0% o2. Zet het gas om kleine bubbels te bieden aan de superfusate oplossing. Pas de levering van gas om spatten te voorkomen.</li>
	<li>Schik de dieren ontleden station door het controleren van verdoving, het regelen van chirurgische apparatuur, en de voorbereiding hechting banden. Bereid het ontleden van de kamer door het verzamelen van ontleden pennen, draaien op de Chiller (of het ophalen van ijs), en het vullen van de ontleden kamer (bekleed met rubberen siliconen) met koude PSS.</li>
	<li>Vul alle kamers, naalden, glazen micropipetten, slangen en reservoirs met verwarmde PSS, zorgvuldig te kijken voor en het elimineren van luchtbellen door zuigen ze uit met een fijne tip Transfer pipet. Draai alle 3-weg gasmonster tot drieweg met "uit" tegenover de richting van de pipet om de vloeistof in de pipet te beveiligen.</li>
	<li>Plaats een enkele stropdas op elk van de twee glazen micropipetten voorbereid voor de baarmoeder canulatie en op de twee stompe Tip naalden aangewezen voor de navelstreng canulatie. Veilige banden met de pipetten en stompe Tip naalden om verlies tijdens kamer bewegingen te voorkomen (figuur 1c).</li>
</ol>3. het oogsten van de placenta
<ol><li>Verdoven een zwangere vrouwelijke rat op zwangerschapsduur dag 20 met 5% Isofluraan voor ongeveer 4 min of totdat het dier tentoongestelde voorwerpen gezwoegd ademhaling. Verplaats het dier naar de neuskegel en het beheer van 2,5% − 3% Isofluraan om anesthesie te handhaven. Bevestig bewusteloosheid door een gebrek aan teen pinch reflex. Opmerking: het gebruik van een rat op zwangerschapsduur dag 20 wordt gepresenteerd in dit protocol. Echter, het Protocol blijft hetzelfde als experimentele voorwaarden vereisen placentale evaluatie plaats te vinden eerder in de dracht.</li>
	<li>Identificeren en isoleren van de baarmoeder hoorn (rechts of links) van de keuze door het optillen en verspreiden van lange manieren buiten de rat karkas. Met behulp van een gevlochten zijden hechtdraad, Das uit de baarmoeder slagader aan de eierstokken einde en vaginale einde van de hoorn. Omvatten de eierstokken binnenkant van de hechting met de baarmoeder hoorn.</li>
	<li>Met behulp van chirurgische schaar, accijns weg de baarmoeder hoorn door het maken van bezuinigingen op de proximale kant van de eierstokken stropdas en distale kant van de vaginale stropdas, waardoor de baarmoeder hoorn afgebonden met de hechtingen aan beide uiteinden. Breng de baarmoeder hoorn in de ontleden schotel bekleed met siliconen rubber en gevuld met koude (4 °C) PSS. Ongeacht of de rechter of linker hoorn is gekozen, handhaven die dezelfde kant voor de selectie in elk experiment voor consistentie. Opmerking: voor foetale anesthesie worden pups in ijskoude PSS gehouden. Daarom wordt de PSS temperatuur in de ontleden kamer onderhouden door gekoeld Circulerend bad of ontleden kamer moet worden gehouden op ijs. Opmerking: op dit punt verdoofd dam kan worden euthanized per laboratorium dec protocol goedkeuring. In dit geval, euthanasie gebeurt via pneumothorax (door het snijden van het middenrif) en de verwijdering van het moeders hart.</li>
	<li>Duw voorzichtig een ontledende pin door de baarmoeder hoorn in de siliconen rubber, met de eierstokken kant naar links en vaginale kant naar rechts om de baarmoeder vasculatuur te visualiseren. Dit zal stabiliseren de baarmoeder en het voorkomen van beweging van het weefsel tijdens dissectie van de foetale compartiment. Selecteer een moeder-placenta-foetale eenheid centraal in de hoorn en binden de baarmoeder slagader en ader met chirurgische schaar. Snijd de baarmoeder spier proximale en DISTAAL aan de geselecteerde placenta en foetus. De baarmoeder spier kan worden ingetrokken door te trekken naar de zijkant; het is belangrijk om het intact te laten, maar weg te trekken uit de dekking van de foetale pup. Opmerking: selectie van de moeder-placenta-foetale eenheid moet worden gebaseerd op de lengte van de baarmoeder slagader segment aan beide zijden van de gebogen slagader. Langere segmenten zal toelaten meer succesvolle canulatie.</li>
	<li>Gebruikend fijne Tang en schaar, verwijder het vrucht vlies van de foetale oppervlakte van de placenta, die zorg neemt om de navelstreng te vermijden.</li>
	<li>Ontrafel en binden de navelstreng om de foetale pup te scheiden.</li>
	<li>Identificeer de navelstreng slagader (dikkere vaartuig) en ader (dunnere vaartuig). Markeer de navelstreng voor eenvoudige identificatie door het te snijden iets korter dan de navelstreng slagader.</li>
	<li>Zachtjes scheiden de navelstreng slagader en ader van elkaar.</li>
	<li>De gehele placenta-eenheid met inbegrip van de baarmoeder vasculatuur, baarmoeder spier, placenta, en de navelstreng, kunnen worden gesneden en verwijderd.</li>
</ol>4. placentale doorbloeding
<ol><li>Handhaven anatomische bloedstroom behoud van de juiste distale-naar-proximale oriëntatie van de baarmoeder slagader, plaats de placenta-eenheid (samengesteld uit de baarmoeder vasculatuur, baarmoeder spier, placenta, en de navelstreng) in de gewijzigde geïsoleerde schip kamer gevuld met een warme, zuurstofrijk PSS.</li>
	<li>Met behulp van een paar fijne Tang in elke hand, cannulate de proximale en distale uiteinden van de baarmoeder slagader op het glas micropipetten.</li>
	<li>Stevig veilig de baarmoeder slagader met behulp van de steriele nylon hechting band eerder bevestigd op de micropipet. Opmerking: twee-tie lussen (knoop) kan nodig zijn; echter, een enkele tie lus zorgt voor een grotere aanpassing.</li>
	<li>Cannulate de navelstreng (foetale-aan-moederbloed stroom) op de 23 G (grotere) naald en Beveilig het met zwarte gevlochten zijde hechting.</li>
	<li>Cannulate de navelstreng (moeder-naar-foetale bloedtoevoer) op de 25 G (kleinere) botte naald en veilig met zwarte gevlochten zijde hechting.</li>
	<li>Verplaats naar de placenta en aanvulling alle gasmonster tot drieweg en slangen om luchtbellen te voorkomen. Sluit alle slangen volgens Figuur 2.</li>
	<li>Plaats kleine weeg boten onder de distale canulatie van de moeder baarmoeder slagader en de naald canulatie van foetale navelstreng om het effluent dat zal ontstaan tijdens de procedure te vangen.</li>
	<li>Zet de peristaltische pomp, drukregelaar, en de druk monitor en open de wegkraan om vloeistof stroom door de slang in de richting van de druk transducer, maar nog niet aan de placenta. Verhoog langzaam de druk tot 80 mm Hg.</li>
	<li>Langzaam draai de wegkraan naar de placenta te openen en te kijken voor lekken in de kamer en rond de banden. Opmerking: als de peristaltische pomp draait op een hoge snelheid, opnieuw evalueren van de proximale baarmoeder canulatie en banden voor vloeistof lekken. Indien geïdentificeerd, moeten lekken worden verholpen. Merk ook op, terwijl de gemiddelde baarmoederslagader druk constant zal blijven (ingesteld op 80 mmHg), de vloeistof debiet kan variabel zijn afhankelijk van de vasculaire en placenta fysiologische reacties. Kwantificering van de vloeistof stroom kan worden geïdentificeerd als een experimentele variabele in reactie op xenobiotische blootstelling.</li>
	<li>Draai de wegkraan om vloeistof stroom in de navelstreng slagader mogelijk te maken. Zet de druk op ongeveer 50 mmHg, die kan worden uitgevoerd met een peristaltische pomp (Figuur 3) of een hydrostatische kolom.</li>
	<li>Vul alle reservoirs (baarmoeder, navelstreng, en superfusate) om vocht volume te handhaven gedurende het experiment. Opmerking: zodra de doorbloeding is geïnitieerd en experiment is aan de gang, verdoofd pups nog in het ontleden gerecht kan worden beoordeeld op levensvatbaarheid door het aanraken van de pups met een tang om een neurologische reactie te lokken. Exsanguination van de pups zal plaatsvinden door middel van hysterectomie van de baarmoeder hoorn; de verdere euthanasie kan door goedgekeurde dec protocollen worden voltooid. In dit geval, het openen van het vruchtwater sac in de koude PSS en het creëren van een pneumothorax door het snijden van de ribben.</li>
</ol>5. mock experiment
<ol><li>Na canulatie en initiatie van de PSS-bloeding, laat weefsels equilibrate gedurende 30 minuten om de vasculatuur aan te passen aan de nieuwe vloeistof stroom. Zuig het effluent door een pipet en sla het op in een overeenkomstige gelabelde micro centrifugebuis.</li>
	<li>Na evenwicht, vast te stellen de baseline bloeding door het verzamelen van effluenten voor 10 min van beide wegen boten in microcentrifuge buizen en het meten van het volume van de vloeistof die naar voren komt door de baarmoederslagader en de navelstreng.</li>
	<li>Initiëren sample collectie met intervallen van 10 minuten door het verzamelen van de effluenten uit de distale baarmoeder slagader en de navelstreng ader. Bijvoorbeeld, het beheer van een 900 µ L bolus dosis van 20 nm Rhodamine-gelabelde polystyreen nanodeeltjes (8 x 1014 deeltjes/ml) geschorst in 0,01% oppervlakteactieve stof aan de lijn perfusing de baarmoeder slagader te identificeren de tijd cursus passage van xenobiotische nanodeeltjes over de placenta barrière. Opmerking: deze effluent monsters zal zorgen voor de meting van verontreinigende stoffen in de vloeistof (hetzij xenobiotische, farmacologische, of metaboliet) en bieden de snelheid van de vloeistof door de baarmoederslagader of over de placenta en in de foetale compartiment ( Figuur 4).</li>
	<li>Na bolus infusie, verzamelmonsters van de distale baarmoeder slagader en foetale navelstreng effluent elke 10 min voor een totaal van 180 min na infusie.</li>
</ol>6. reiniging van de apparatuur
<ol><li>Na elk experiment, verwijder de placenta-eenheid uit de pipetten. Alle hechtingen kunnen worden opgeslagen om te worden hergebruikt in toekomstige experimenten. Het placentale weefsel kan worden opgeslagen voor extra histologische of mechanistische studies.</li>
	<li>Reinig alle slangen en canules van het doorbloedings systeem met 70% ethanol gevolgd door gedistilleerd water en vacuüm droog. Opmerking: als slangen of pipetten beginnen te verkleuren of beschadigd lijken, vervang dan voorafgaand aan het volgende experiment. Verder, na een experimentele cohort is voltooid (bijv. alle studies met betrekking tot een enkele verontreiniging), vervangt alle buizen in de kamer om kruisbesmetting te voorkomen.</li>
</ol>

<ol><li>Troen, P., Gordon, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+studies+of+the+human+placenta.+I.+Effect+of+estradiol+and+human+chorionic+gonadotropin+on+citric+acid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Perfusion studies of the human placenta. I. Effect of estradiol and human chorionic gonadotropin on citric acid metabolism.</a> Journal of Clinical Investigation. 37, 1516-1523 (1958).</li>
<li>Alexander, D. P., Huggett, A. S., Nixon, D. A., Widdas, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+placental+transfer+of+sugars+in+the+sheep%3A+the+influence+of+concentration+gradient+upon+the+rates+of+hexose+formation+as+shown+in+umbilical+perfusion+of+the+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The placental transfer of sugars in the sheep: the influence of concentration gradient upon the rates of hexose formation as shown in umbilical perfusion of the placenta.</a> Journal of Physiology. 129, 367-383 (1955).</li>
<li>Alexander, D. P., Andrews, R. D., Huggett, A. S., Nixon, D. A., Widdas, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+placental+transfer+of+sugars+in+the+sheep%3A+studies+with+radioactive+sugar%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The placental transfer of sugars in the sheep: studies with radioactive sugar.</a> Journal of Physiology. 129, 352-366 (1955).</li>
<li>Dancis, J., Money, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+sodium+and+iodo-antipyrine+across+guinea+pig+placenta+with+an+in+situ+perfusion+technique%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+and+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Transfer of sodium and iodo-antipyrine across guinea pig placenta with an in situ perfusion technique.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 80, 215-220 (1960).</li>
<li>London, W. T., Money, W. L., Rawson, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+Transport+of+I-131-Labeled+Thyroxine+and+Triiodothyronine+in+the+Guinea+Pig%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Placental Transport of I-131-Labeled Thyroxine and Triiodothyronine in the Guinea Pig.</a> Endocrinology. 73, 205-209 (1963).</li>
<li>Stulc, J., Stulcova, B., Svihovec, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+calcium+across+the+dually+perfused+placenta+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transport of calcium across the dually perfused placenta of the rat.</a> Journal of Physiology. 420, 295-311 (1990).</li>
<li>Goeden, N., Bonnin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+perfusion+of+mid-to-late-gestation+mouse+placenta+for+maternal-fetal+interaction+studies+during+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Ex vivo perfusion of mid-to-late-gestation mouse placenta for maternal-fetal interaction studies during pregnancy.</a> Nature Protocols. 8, 66-74 (2013).</li>
<li>Bond, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+perfusion+of+the+fetal+circulation+of+the+in+situ+mouse+placenta%3A+methodology+and+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Artificial perfusion of the fetal circulation of the in situ mouse placenta: methodology and validation.</a> Placenta. 27, Suppl A, S69-75 (2006).</li>
<li>Illsley, N. P., Fox, H., Van der Veen, F., Chawner, L., Penfold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+placental+ultrastructure+after+in+vitro+dual+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Human placental ultrastructure after in vitro dual perfusion.</a> Placenta. 6, 23-32 (1985).</li>
<li>Davis, M. J., Kuo, L., Chilian, W. M., Muller, J. M. Isolated, Perfused Microvessels. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDavis%2C+MJ+%22Clinically+Applied+Microcirculation+Research%22">Clinically Applied Microcirculation Research</a>. Barker, J. H., Anderson, G. L., Menger, M. D. , 1 ed, CRC Press. Boca Raton. 435-456 (1995).</li>
<li>Butcher, J. T., Goodwill, A. G., Frisbee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ex+vivo+isolated+skeletal+microvessel+preparation+for+investigation+of+vascular+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The ex vivo isolated skeletal microvessel preparation for investigation of vascular reactivity.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), 3674(2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Deze doorbloeding methode zorgt voor een snelle beoordeling van de placenta barrière en fysiologische functie van de baarmoeder vasculatuur en trofoblast laag. Canulatie en de doorbloeding van de proximale aan distale uiteinden van de moederlijke baarmoeder slagader simuleert de Fysiologie van de moeder door de stroom van dit grote schip verantwoordelijk voor het verzenden van bloed naar de zich ontwikkelende foetus. Deze methodologie zorgt voor fysiologische evaluatie van de geïsoleerde moeder-, placenta-en navel vasculatuur, en daarom veranderingen in de Fysiologie kan worden geïdentificeerd als vasculaire pathologie; de immune en neurale innervations worden verwijderd in de ex-vivo procedure. Om een goede evaluatie te garanderen, is het daarom van cruciaal belang om deze schepen zorgvuldig te cannulate om geen tranen of perforaties in de vaatwanden te creëren, en om luchtbellen te verwijderen. Gas emboli kan schade veroorzaken aan de endothelial laag van de vasculatuur of belemmeren de bloedvaten. Door het handhaven van de vasculaire verbindingen tussen de baarmoeder, placenta en foetus tijdens dissectie, de evaluatie van de vloeistof en de verplaatsing naar de foetus kan worden waargenomen. Met de toediening van een xenobiotische, in dit geval 20 nm polystyreen, kinetica aan het distale uiteinde van de baarmoeder slagader en door de placenta aan de foetale compartiment kan worden geëvalueerd door analyse van effluenten over een tijdsverloop van 180 minuten.
Terwijl een Dual-doorbloeding model werd beschreven en de overdracht van deeltjes en vloeistof van de moeder naar de foetale compartiment werd gecontroleerd in dit artikel, beoordelingen kunnen ook worden gemaakt in omgekeerde volgorde van de foetale aan de moeder-compartiment. Een beperking van de methode hier beschreven is dat de distale baarmoeder ader was niet gecanuleerde of bemonsterd. In toekomstige studies, vooral die gericht op de foetale-to-moeder overdracht, zal het belangrijk om cannulate en monster de distale baarmoeder schip. De uit dit mock-experiment genomen effluenten werden gebruikt om de xenobiotische overdracht te beoordelen; echter, een breed scala van beoordelingen met betrekking tot endocriene en moleculaire placenta functies of foetale voeding kan worden uitgevoerd.
De sterke punten van dit protocol zijn veel groter dan de kleine beperkingen. De voorbereiding handhaaft de fysiologische structuur en de integriteit van een geheel orgaan om experimentele voorwaarden te beoordelen. Ex vivo placenta is een wetenschappelijke progressie van cellulaire in vitro tot hele blootstelling aan dieren naar behoren te bepalen reproductieve risicobeoordeling. Dit kan worden beschouwd als een waardevolle techniek voor studies evalueren placentale farmacologische drug dispositie, farmacokinetiek, toxicologie, fysiologie, en moeder-foetale geneeskunde.

Door het behoud van morfologische structuur en fysiologische responsiviteit, orgaan-doorbloeding is een aanvaarde systeem-of weefsel-gebaseerde aanpak voor het analyseren van de metabolische functie. Deze doorbloeding technieken zorgen voor de ex vivo onderzoek van intacte weefsel reacties op een verscheidenheid van farmacologische en mechanische stimuli. De doorbloeding van de menselijke placenta werd in eerste instantie beschreven in 1958 om de hormonale effecten op de metabole activiteit van de citroenzuur cyclus te identificeren; Na eerder geïdentificeerd in weefsel homogenates, troen en Gordon erkende de noodzaak om de endocriene activiteit te verduidelijken met behulp van een nieuwe fysiologische benadering1. In de zelfde era, werden de enig-doorbloeding (moeder-aan-foetale of foetale-aan-moeder) strategieën beschreven in grote2,3 en kleine4 dierlijke modellen om de placenta overdracht van suikers, zouten, en antipyrine drugs te begrijpen. In vivo en ex vivo Dual-doorbloeding (gecoördineerde moeder-en foetale transfusie) technieken werden beschreven om verder te karakteriseren placentae overdracht met behulp van in vivo5 en ex vivo6,7,8 methodologieën. Technologische vooruitgang in de transmissie en scanning elektronenmicroscopie toegestaan onderzoekers om de structurele en functionele integriteit van de menselijke placenta weefsels na de infusie9te verifiëren.
Terwijl de doorbloeding van menselijke placenta weefsels en individuele cotyledon is het meest relevant, de snelle ontwikkeling van farmacologische agentia en milieuverontreinigingen noodzakelijk is het gebruik van een dierlijk transfusie model voor de vroegtijdige screening van xenobiotische overdracht over de placenta barrière. Deze placentale doorbloeding methode zorgt voor de evaluatie van de overdracht over de placenta barrière met behulp van gemakkelijker haalbaar en fysiologisch relevante rat placenta. Bovendien vloeistof stroom over de placenta barrière over een periode van tijd na een blootstelling kan worden geëvalueerd door het meten van het volume van perfusaat afkomstig van de navelstreng slagader. Op grond van het toestaan van placentale doorbloeding van zowel de moeder-en foetale circulatie, deze dual-flow hele orgaan aanpak kan voordelig zijn in vergelijking met de huidige in vitro en in vivo benaderingen. Deze methode staat het beheer van een xenobiotische door het moeder aspect toe om van perfusaat worden gemeten die over de placenta door de navelstreng ader, of vice versa te voorschijn komt. Het protocol hier gepresenteerd zal beschrijven de overdracht van 20 nm polystyreen (een gemeenschappelijke nanoplastic gebruikt in levensmiddelen en medische producten) van de moeder baarmoeder slagader naar de foetale compartiment en een bijbehorende daling van de vloeistof stroom over de placenta om te illustreren het gebruik van deze methode in meerdere fysiologische, farmacologische en toxicologische instellingen te beoordelen placentale overdracht, metabolisme, en fysiologische veranderingen die de moeder en/of foetale stroming.

<table><tbody><tr><td>Zwarte gevlochten zijden niet-absorbeerbare chirurgische hechting niet-steriel</td><td>Surgical Specialties Look</td><td>AACO805</td><td></td></tr><tr><td>Fijne forceps</td><td>FST by Dumont Zwitserland</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Fijne schaar</td><td>FST by Dumont Zwitserland</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>Glas cannula pakket</td><td>Living Systems Instrumentation (LSI)</td><td>GCP-75-100</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugebuizen 2,0 mL polypropyleen gegradueerde buis met vergrendelingsdeksel GEMENGD</td><td>Fisherbrand</td><td>02-681-299</td><td></td></tr><tr><td>Niet-gekartelde fijne gebogen micro serrefine klemmen</td><td>InterFocus</td><td>18052-03</td><td></td></tr><tr><td>Perfusaatpomp</td><td>ISMATEC</td><td>ISM795C</td><td></td></tr><tr><td>Drukmonitor</td><td>Living Systems Instrumentation (LSI)</td><td>Mode PM-4</td><td></td></tr><tr><td>Zelfverwarmende enkele vatkamer</td><td>Living Systems Instrumentation (LSI)</td><td>CH-1</td><td></td></tr><tr><td>Servo Pomp</td><td>Living Systems Instrumentation (LSI)</td><td>Model PS-200-P</td><td></td></tr><tr><td>Roestvrijstalen stompe naald 23 gauge</td><td>Component Supply Co.</td><td>04651-01</td><td></td></tr><tr><td>Roestvrijstalen stompe naald 25 gauge</td><td>Component Supply Co.</td><td>07116-01</td><td></td></tr><tr><td>STERIELE Nylon Hechting</td><td>AROSurgical Instruments Corporation</td><td>T04A00N07-13</td><td></td></tr><tr><td>Stopcock</td><td>Sedation Resource</td><td>6-205-04</td><td></td></tr><tr><td>Temperatuurregelaar</td><td>Living Systems Instrumentation (LSI)</td><td>Model TC-09S</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo doorbloeding van de knaagdieren placenta

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

De placenta is een belangrijk orgaan tijdens de zwangerschap die fungeert als een belemmering voor de foetale xenobiotische blootstelling en bemiddelt de uitwisseling van voedingsstoffen voor afval. Een assay wordt hier beschreven om een geïsoleerde rat placenta te perfuse en de moeder-naar-foetale translocatie van xenobiotica ex vivo te evalueren. Daarnaast kan de evaluatie van fysiologische processen, zoals vloeistof stroom naar de foetus en placentale metabolisme worden uitgevoerd met deze methodologie. Deze techniek is geschikt voor het evalueren van moeder-naar-foetale kinetiek van farmaceutische kandidaten of milieucontaminanten. In tegenstelling tot de huidige alternatieve benaderingen, deze methodologie maakt de evaluatie van de geïsoleerde moeder-foetale vasculatuur, met de systemische neurale of het immuunsysteem betrokkenheid verwijderd, waardoor eventuele waargenomen veranderingen in de fysiologische functie te worden toe te schrijven aan lokale factoren binnen het geïsoleerde weefsel.

Figuur 5 toont de proof-of-principe experimenten met behulp van blauwe kleurstof Evan, waardoor we het systeem te testen en te visualiseren passende vloeistof en placenta barrièrefunctie en om insluiting te voorkomen overdracht naar de foetale compartiment. De blauwe kleurstof van Evan bereikte en doorbloede het weefsel van de placenta binnen dit systeem (figuur 5a). Bij nader onderzoek, is het duidelijk dat de Evan de blauwe kleurstof niet in de foetale navelstreng ader (Figuur 5b), die wordt verwacht als de blauwe kleurstof Evan is gebonden aan albumine.
In Figuur 6 worden gegevens weergegeven voor het mock-experiment dat in dit protocol wordt beschreven. Effluent monsters uit het distale uiteinde van de baarmoeder slagader en foetale navelstreng werden gemeten op elk 10 minuten durende segment om de vloeistof stroom te evalueren na verloop van tijd na de bolus dosis werd toegediend aan de moeder baarmoeder slagader (Figuur 6). Minder vocht overdracht naar de foetale compartiment binnen 10 minuten na polystyreen infusie werd geïdentificeerd. Om de overdracht van polystyreen in het foetale compartiment te kwantificeren tijdens de tijds cursus wanneer het zich voordoet, werd 25 µ L van de doorbloede vloeistof van elk tijdpunt geplaatst in een 96 goed plaat in duplicaat om de steekproef fluorescentie te meten. Fluorescentie werd bepaald door de spectroscopie lezing op 546/575 nm (ex/em) met behulp van een fluorescerende Microplate lezer. Polystyreen Transfer naar de foetale compartiment vond plaats binnen 10 minuten en piekte op 20 minuten en bleef gedurende 90 minuten (Figuur 6b).
Een subset van doorbloede placentale weefsels werden opgeslagen voor histopathologie en morfologische Beoordelingen. De weefsels werden formaline en hematoxyline en eosine gekleurd en beoordeeld door een Raad gecertificeerde veterinaire patholoog. Deze deskundigen identificeerden geen structurele afwijkingen in placenta doorbloede door slechts PSS, of PSS met de bolus dosis van Rhodamine polystyreen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig1.jpg"> Figuur 1: de gewijzigde kamer voor één schip. Aeen overzicht van de gewijzigde kamer. (B) een close-up beeld van de stomp-Tip naalden beveiligd in de schip kamer. De rode pijl geeft de thermistor clip die is gewijzigd om de naalden op zijn plaats te houden voor de navelstreng canulatie. Ceen representatief beeld van de vier canules die voor weefsel canulatie zijn bereid. Rode pijlen wijzen op elk van de vier canules. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig2.jpg"> Figuur 2: een nader beeld van de placentale bloed kamer. (A) Dit vertegenwoordigt de slang verbonden aan de druk transducer en gecanuleerde de proximale moeder baarmoeder slagader, of de "instroom". De druk is ingesteld op een constante 80 mmHg zoals gedefinieerd door de literatuur. (B) Dit vertegenwoordigt de kamer afvoer haven van de superfusate rond de placenta weefsel tijdens de doorbloeding. (C) Dit vertegenwoordigt de kamer instroom van de superfusate om de placenta te baden met opgewarmde PSS tijdens de doorbloeding. (D) Dit is de distale moeder baarmoeder haven waar afvalwater uit de baarmoeder bloeding kan worden verzameld. (E) Dit is de temperatuur haven, waar de schip kamer kan worden bevestigd aan een thermometer en kachel om een consistente temperatuur gedurende het experiment te handhaven. (F) Dit vertegenwoordigt de navelstreng slagader canulatie. De navelstreng slagader wordt onder druk gezet tot 50 mmHg om voor tegenstroom flow op het niveau van de placenta. Gdit is de collectie van het effluent van de navelstreng. Vloeistof die stroomt naar de foetale compartiment tijdens de doorbloeding zal hier worden verzameld. (H) Dit is het middelpunt van het doorbloedings systeem, waar de placenta wordt gecanuleerde en gedurende de gehele bloeding wordt gehandhaafd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig3.jpg"> Figuur 3: een beeld van het systeem van de placenta. (A en B) de drukcontrole systeem gebruikt voor het monitoren en onderhouden 80 mmHg van perfusaat door de baarmoeder slagader. (C) Dit is de Thermo-regulatie van de transfusie kamer. (D) Microscoop. (E) infusie kamer. (F) zwaartekracht-gevoed navelstreng bloeds overbloeding vastgesteld op 50 mmHg. (G) een peristaltische pomp gebruikt voor het vullen en aftappen placenta superfusate PSS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig4.jpg"> Figuur 4: schematische voorstelling van het placenta systeem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig5.jpg"> Figuur 5: representatieve beelden van proof-of-principe experimenten met behulp van Evan de blauwe kleurstof. (A en B) proof-of-principe dat Evan de blauwe zal perfuse de baarmoeder vasculatuur, baarmoeder spier, en placenta, maar zal niet over de placenta barrière als gevolg van albumine bindend. De groene pijl wijst op de blauwe veneuze drainage van de placenta terug naar de moeder omloop. De rode pijl geeft de navelstreng effluent in de richting van de foetale compartiment. Let op het ontbreken van blauwe kleurstof. Ceen representatief beeld van het inzamelen van afvalwater uit de navelstreng. De rode pijl geeft de druppelvorming voorafgaand aan de collectie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig6.jpg"> Figuur 6: gegevens die zijn afgeleid van het mock-experiment. Fluorescentie metingen van Rhodamine polystyreen nanomaterialen, genormaliseerd naar Baseline fluorescentie, door het verzamelen van (a) baarmoeder slagader en (B) foetale navelstreng effluenten. Gemiddelde genormaliseerde fluorescentie ± standaardfout (SE). *: p < 0,05 en T: p < 0,1 via analyse van variantie (ANOVA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Hier wordt een protocol van ex vivo moeder-foetale vasculaire doorbloeding aangeboden om de toediening van een test artikel in de moeder vasculatuur mogelijk te maken en om de placentale overdracht van xenobiotische deeltjes of farmacologische agentia te evalueren in aanvulling op wijzigingen in placentale fysiologie.

Ex vivo doorbloeding van de knaagdieren placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

Een succesvolle toepassing van deze technieken zal zorgen voor de kinetische evaluatie van farmacologische proeven of de passage van xenobiotische verontreinigingen door een morfologisch intacte placenta. De perfusietechniek van de knaagdier placenta maakt een hogere doorvoer van farmacologische of toxicologische studies mogelijk, omdat meerdere verbindingen kunnen worden beoordeeld met behulp van het weefsel van een enkele dam. Het aantonen van de techniek zal Jeanine D'Errico, een senior afgestudeerde student van mijn laboratorium.Vul voor het begin van de procedure voorzichtig alle kamers, naalden, glazen micropipets, buizen en reservoirs met opgewarmde fysiologische zoutoplossing of PSS, waarbij eventuele luchtbellen voorzichtig worden verwijderd met een fijne gekantelde transferpipet indien nodig. Draai alle drie weg stopcocks naar de uitstand om de vloeistof in de pipetten te beveiligen. Plaats een enkele das op elk van de twee glazen micropipettes bereid voor de baarmoeder cannulatie en op de twee stompe tip naalden aangewezen voor navelstreng.Beveilig vervolgens de banden om verlies tijdens de kamerbewegingen te voorkomen. Na bevestiging van een gebrek aan reactie op teen knijpen in een verdoofde zwangerschapsdag 20 vrouwelijke zwangere rat, til een baarmoeder hoorn uit de buik en verspreid de hoorn uit longways, buiten het dier. Gebruik gevlochten zijdehechtingen om de baarmoederslagader af te binden aan de vaginale en eierstokken van de hoorn, inclusief de eierstok in de hechting met de baarmoederhoorn.Met behulp van chirurgische schaar, maken incisies aan de proximale kant van de eierstok das en de distale kant van de vaginale stropdas. Breng de baarmoeder hoorn in een ontleden schotel bekleed met siliconen rubber en gevuld met koude PSS. Met de eierstok kant aan de linkerkant en de vaginale kant naar rechts, voorzichtig duw een ontleden pin door de baarmoeder hoorn in de siliconen rubber om de baarmoeder te stabiliseren.Selecteer een moeder placenta foetale eenheid centraal in de hoorn. Verwijder met behulp van fijne tangen en scharen het vruchtwatermembraan van het foetale oppervlak van de placenta en zorg ervoor dat de navelstreng wordt vermeden. Ontrafel en ligate de navelstreng om de foetale pup te scheiden.Na het identificeren van de navelslagader en ader, voorzichtig scheiden en ligate de navelstrengvaten. Snijd vervolgens de navelstreng iets korter dan de navelslagader voor het gemak van identificatie. En ligate de baarmoederslagader en ader met chirurgische schaar.Het handhaven van de juiste oriëntatie van de baarmoederslagader anatomische bloedstroom, plaats de placenta-eenheid in de gewijzigde geïsoleerde vatkamer gevuld met warme zuurstofrijke PSS onder een ontledenmicroscoop. Met behulp van een paar fijne tangen in elke hand, cannulate de proximale en distale uiteinden van de baarmoederslagader op de glazen micropipetten. Zet de slagader stevig vast met de eerder geplaatste steriele nylon hechting.Kannuleren en zet de navelslagader op de 23 meter stompe naald. Dan cannulate en zet de navelstreng op de 25 meter stompe naald en backfill alle stopcocks en buizen om luchtbellen te voorkomen. Vergeet niet om alle stopcocks, canules, en buizen voor luchtbellen te controleren, als een luchtbolus in het systeem zal leiden tot cellulaire nood en elimineren van de teller stroom in de placenta.Sluit alle buizen volgens de figuur. Plaats kleine weegboten onder de distale cannulation van de moederbaarmoeder en onder de naaldkannulatie van de foetale navelstreng om het effluent te vangen dat tijdens de procedure zal ontstaan. Bereid de inzamelplaat voor op het afvalwater voor latere analyse.Open de stopcock om vloeistof door de slang naar de placenta toe te laten en zet de peristaltische pomp, drukcontrole en drukmonitor aan. Langzaam verhogen van de druk tot 80 millimeter kwik te lezen op de drukmonitor. Open langzaam de stopcock om vochttoevoer naar de baarmoederslagader mogelijk te maken.Vul alle reservoirs om het vloeistofvolume tijdens het experiment te behouden. Nadat de weefsels gedurende 30 minuten zijn geëquilibreerd om de vasculatuur aan te passen aan de nieuwe vloeistofstroom, stelt u de basislijnperfusie vast door afvalwater gedurende 10 minuten van beide weegboten te verzamelen. Meet het volume van de vloeistof die ontstaat door de baarmoederslagader en navelstreng.Aan het einde van de basiselinatieperiode, de experimentele behandeling in de baarmoederslagader. Verzamel vervolgens elke 10 minuten gedurende 180 minuten na de infusie monsters van de distale baarmoederslagader en foetale navelstrengefluent. Meet de verontreinigingen in de vloeistofmonsters.Perfusie met Evans blauwe kleurstof om het systeem te testen en om de juiste vloeistof en placenta barrière functie te visualiseren voor het voorkomen van verontreiniging overdracht naar het foetale compartiment blijkt dat de kleurstof bereikt en doordrongen van de placenta weefsel binnen dit systeem. Bij nader onderzoek, is het duidelijk dat de Evans blauwe kleurstof niet in de foetale navelstreng, die wordt verwacht, als de Evans blauwe kleurstof is gebonden aan albumin. In dit representatieve experiment werd een verminderde vloeistofoverdracht naar het foetale compartiment binnen 10 minuten na polystyreeninfusie geïdentificeerd.De polystyreen transfer naar het foetale compartiment piekte vervolgens op 20 minuten en bleef gedurende 90 minuten. Het belangrijkste om te onthouden tijdens de cannulation is om langzaam te gaan. De pipetten en het weefsel zijn zeer delicaat en kunnen gemakkelijk gebroken of gescheurd worden.Door het wegen van de effluence, deze methode kan worden gebruikt om placenta fysiologie en materiële translocatie te onderzoeken.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

This video describes a procedure for mouse liver perfusion through the portal vein using collagenase solution prior to isolating liver cells.

In Vivo Murine Liver Perfusion: A Method to Infuse the Rodent Liver with Solution via the Portal Vein

Bepaling van de Transport Rate van xenobiotica en nanomaterialen via de placenta met de<em&gt; Ex vivo</em&gt; Human placentaperfusie Model

Wij presenteren een gedetailleerde methode om de menselijke placenta fysiologie in vivo op termijn te bestuderen. De methode combineert bloedmonsterneming van de inkomende en uitgaande vaten op de moeder- en foetale zijkanten van de placenta met ultrasone metingen van volume bloedstroom en placenta weefselmonstering.

De 4-vaartuig Steekproef Aanpak bij Integratieve Studies van Menselijke Placentale Fysiologie<em&gt; In Vivo</em

Beschrijven we een systeem dat gebruik maakt van drie methoden voor evaluatie van de veiligheid en effectiviteit van placenta-gerichte drug delivery: in vivo imaging als u wilt controleren nanoparticle accumulatie, hoge-frequentie echografie placenta en foetale ontwikkeling te volgen , en HPLC te kwantificeren drug levering aan weefsel.

Uitgebreide evaluatie van de effectiviteit en veiligheid van Placenta-gerichte Drug Delivery met behulp van drie aanvullende methoden

Een protocol wordt beschreven voor in situ perfusie van het onderlichaam van de muis, met inbegrip van de blaas, de prostaat, geslachtsorganen, bot, spier en voethuid.

Oprichting van In Situ Closed Circuit Perfusie van onderbuikorganen en achterpoten bij muizen

Hier beschrijven we een tijdspecifieke methode om kritische ontwikkelingspaden in de placenta van de muis in vivo effectief te manipuleren. Dit wordt uitgevoerd door de injectie en elektroporatie van CRISPR-plasmiden in de placenta's van zwangere moederdieren op embryonale dag 12.5.

Muis in vivo placenta-gerichte CRISPR-manipulatie

Hier presenteren we een beoordelingsprotocol van een heterotopisch geïmplanteerd hart na normotherm ex situ behoud in het rattenmodel.

Rattenmodel van Normothermische ex-situ perfuseerde heterotope harttransplantatie

Een normotherm ex vivo leverperfusie (NEVLP) systeem werd gecreëerd voor muizenlevers. Dit systeem vereist ervaring in microchirurgie, maar zorgt voor reproduceerbare perfusieresultaten. Het vermogen om muizenlevers te gebruiken vergemakkelijkt het onderzoek van moleculaire routes om nieuwe perfusaatadditieven te identificeren en maakt de uitvoering van experimenten gericht op orgaanherstel mogelijk.

Normothermic Ex Vivo Lever Machine Perfusie in Muis

Er wordt een protocol gepresenteerd om te evalueren of kleine EV's (sEV's) geïsoleerd uit placenta-explantaten gekweekt onder hypoxische omstandigheden (modellering van één aspect van pre-eclampsie) de bloed-hersenbarrière verstoren bij niet-zwangere volwassen vrouwelijke muizen.

Verstoring van de bloed-hersenbarrière van muizen door kleine extracellulaire blaasjes van hypoxische menselijke placenta's

Hier is een protocol voor het kweken van placenta-explantaten onder constante stroomomstandigheden. Deze aanpak verbetert traditionele statische villeuze kweeksystemen door de replicatie van dynamische fysiologische omgevingen mogelijk te maken.

Ex Vivo Placenta Explant Flow Culture - De dynamische omstandigheden in de baarmoeder nabootsen

Dit protocol beschrijft de voorbereiding van menselijke placentaweefselexplants die worden gekweekt aan een lucht-vloeistofinterface voor de studie van virale infecties.

Ex vivo Kweek van menselijke placenta-explants voor de studie van virale overdracht over de maternale-foetale interface

Leer ex vivo doorbloeding van de knaagdieren placenta voor farmacologisch onderzoek. Deze methode evalueert de overdracht van xenobiotica en farmaceutische stoffen door de placenta.

Ex vivo doorbloeding van de knaagdieren placenta

Meer video's verkennen