Verbeterde bewaking van rabiës met behulp van een directe snelle immunohistochemische test

De DRIT is belangrijk omdat het een rabiës diagnostische test die kan worden uitgevoerd in gedecentraliseerde laboratoria in het veld of in gebieden zonder routinematige toegang tot elektronenmicroscopie biedt. Het belangrijkste voordeel van de DRIT is dat het alleen eenvoudige lichte microscopie gebruikt en de resultaten kunnen worden verkregen in ongeveer een uur. De DRIT biedt een krachtig economisch instrument voor rabiës diagnose die kan worden gebruikt door laboratoriumartsen en veldbiologen om rabiës surveillance, preventie en controle programma's wereldwijd te verbeteren.

Voor dieren die vers worden verzameld of ontdooid zijn naar omgevingstemperatuur, plaatst u het dier supine op een vlak oppervlak met de cervicale wervelkolom lichtjes gedraaid naar de examinator. Palpate om het atlanto-occipital gewricht te identificeren op het zijaspect van de cervicale wervelkolom. Met behulp van een scalpelblad, maak een incisie op het niveau van de atlanto-occipital gewricht op de ventrale aspect snijden door alle lagen van spier en zacht weefsel, met inbegrip van de luchtpijp en slokdarm.

Ga door tot het benaderen van het voorste aspect van de halswervels. Beweeg vervolgens het hoofd van het dier in een eindbereik uitbreiding totdat de hersenstam zichtbaar is. Gebruik een scalpel mes om alle zichtbare hersenstam en het centrale zenuwstelsel weefsel te verwijderen voor monster.

Plaats de hersenstammonsters in een onbreekbare container en label dienovereenkomstig. Ten eerste, uiteengezet kleuring gerechten die diep genoeg zijn om voor volledige onderdompeling van een monster dia mogelijk te maken. Vul schotel een met 10% fosfaat gebufferd formaline.

Vul gerechten twee, vier en vijf met TPBS. Vul schotel drie met 3% waterstofperoxide. Vul vervolgens gerechten zes, acht, negen en tien met gedestilleerd of gedeïsteerd water.

Vul schotel zeven met Gill's hematoxylin formulering nummer twee verdund in een 1:1 verhouding met gedestilleerd water. Om de amino-ethyl-carbazole voorraadoplossing voor te bereiden, met behulp van een glazen pipet, plaats vijf milliliter N, N-dimethylformamide in een glazen container. Voeg 120 milligram tablet 3-amino-9-ethylcarbazol toe aan de glascontainer en schud tot deze volledig is opgelost.

Om de AEC werkende verdunning voor te bereiden, voeg je zeven milliliter acetaatbuffer toe aan een 15 milliliter centrifugebuis. Gebruik een glazen pipet om 0,5 milliliter AEC-voorraadoplossing toe te voegen aan de centrifugebuis. Voeg 0,75 milliliter van 3% waterstofperoxide oplossing.

Gebruik een spuit van 10 milliliter met een spuitfilter van 0,45 micrometer om de oplossing te filteren. Om te beginnen, gebruik maken van een uitstrijkje waterdichte permanente inkt marker om glas microscoop dia's label met een uniek nummer voor elk exemplaar. Gebruik een scalpel mes om de hersenstam te verwijderen uit de container en plaats het op een papieren handdoek.

Gebruik een tweede papieren handdoek om voorzichtig dep weg overtollig vocht, bloed of bont om alleen de hersenstam weefsel onthullen. Indien nodig, sectie van de hersenstam weefsel om een dwarsdoorsnede te onthullen. Raak heel voorzichtig de microscoop dia naar verschillende punten van de hersenstam zonder laterale beweging om meerdere gebieden van hersenstam worden overgebracht naar de dia ervoor te zorgen dat slechts een of twee lagen van cellen worden overgedragen van het hersenweefsel naar de dia.

Laat de glijbanen ongeveer vijf minuten drogen bij kamertemperatuur. Dompel vervolgens de dia's in de 10% gebufferde formaline in schotel een gedurende 10 minuten. Haal de glijbanen uit de formaline en dip ze in de TPBS-oplossing in schaal twee.

Dompel de gespoelde glijbanen in de waterstofperoxideoplossing in schaal drie gedurende 10 minuten onder. Verwijder hierna de glijbanen uit de waterstofperoxide en dip ze in de verse TPBS in schaal vier. Na het verwijderen van overtollige waterstofperoxide, plaats de dia's in de verse TPBS in schotel vijf.

Neem de dia's een voor een van schotel vijf, schud af en dep een overtollige buffer en plaats de dia op een bevochtigde papieren handdoek op het lab bank. Wanneer alle dia's zijn overgedragen, gebruik dan een druppelaar of pipet om voldoende primaire anti-rabiës virus antilichaam op elke dia te laten vallen om het CNS-weefsel te dekken. Bedek de glijbanen met putplaten of een andere eenvoudige cover om een vochtigheidskamer te creëren en de glijbanen 10 minuten op kamertemperatuur in de kamer uit te broeden.

Verwijder hierna de glijbanen uit de vochtigheidskamer, schud en dep overtollige conjugaat af en dip de glijbanen in de TPBS in schaal vijf. Werken met een dia tegelijk, verwijder een dia van de TPBS en gebruik een druppelaar of pipet om genoeg Streptavidin peroxidase complex te laten vallen om het CNS-weefsel te dekken. Zodra alle glijbanen zijn bedekt, uitbroed ze in de vochtigheidskamer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Verwijder vervolgens de glijbanen uit de vochtigheidskamer, schud en dep overtollig complex af en dip spoel de glijbanen in de TPBS in schaal vijf. Werken met een dia tegelijk, verwijder een dia van de TPBS en gebruik een pipet om genoeg AEC werkoplossing te laten vallen om het CNS-weefsel te dekken. De glijbanen in de vochtigheidskamer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur uitbroeden.

Daarna, dip spoel de glijbanen in het gedestilleerde water in schotel zes en leg ze in een tegensnede van Gill's hematoxylin in schotel zeven gedurende twee minuten. Onmiddellijk dip spoel alle glijbanen in het gedestilleerde water in schotel acht. Herhaal dit twee keer met behulp van het zoetwater in gerechten negen en 10 voor elke wasbeurt.

Werken een dia per keer, verwijder een glijbaan uit het water en schudden en dep uit overtollig water. Gebruik een in water oplosbaar montagemedium om een afdekplaat op de glijbaan aan te brengen. Gebruik dan een lichtmicroscoop met een 20X doelstelling om de dia's te bekijken.

Positieve resultaten van de DRIT tonen rode intracytoplasmatische virale insluitsels die kunnen variëren in vorm en grootte binnen het cytoplasma van de blauwachtige cellichamen. De insluitsels lijken glad met zeer heldere marges en een minder intensief gekleurd centraal gebied. De antigeenverdeling wordt ingedeeld van plus vier tot plus één met plus vier vertegenwoordigende antigeendistributie die bestaat uit een overvloed aan grote en kleine insluitsels variërend in grootte en vorm en aanwezig in elk gezichtsveld binnen de CNS weefsel touch impression.

Een verdeling van plus drie wordt toegewezen wanneer er insluitsels in een verscheidenheid van maten in de meeste, maar niet alle velden van mening. Als insluitsels worden gevonden in 10 tot 50% van de microscoopvelden, wordt een plus twee antigeenverdeling toegewezen, terwijl er één wordt toegewezen wanneer insluitsels in minder dan 10% van de velden worden gevonden. De meeste CNS weefsels met rabiës virus aanwezig vertonen typische virale insluitsels gesorteerd als plus drie of plus vier intensiteit en antigeen distributie.

Als de resultaten wijzen op een plus één of plus twee in intensiteit of antigeenverdeling, wordt het monster als onbepaald verklaard en is herhaalde tests gerechtvaardigd. Een testmonster met DRIT wordt als negatief beschouwd voor rabiësvirusantigenen nadat de dia met het CNS-weefsel is gescand bij een vergroting van 200X of meer en er geen typische virusinclusies worden gedetecteerd. Negatieve monsters vertonen blauwachtige cellichamen met weinig of geen bekende specifieke kleuring.

Elke persoon die rabiës diagnostische tests moet ontvangen standaard pre-exposure rabiës vaccinaties en ondergaan regelmatige serologische antilichaam evaluatie. Niet-geïmmuniseerde personen mogen geen gebieden betreden waar dergelijk werk wordt uitgevoerd. Naast de voorzorgsmaatregelen die worden genomen bij het werken met het levende rabiësvirus, zijn verschillende reagentia die bij de test worden gebruikt, gevaarlijk.

Raadpleeg de veiligheidsinformatiebladen voor elk reagens.