Een enzym vrije methode voor isolatie en uitbreiding van mesenchymale stamcellen van menselijke adipeus
16 december 2019
Dit protocol biedt een enzym vrije methode voor het isoleren van mesenchymale stamcellen uit correctie-en lipoaspirate-monsters met behulp van een explant methode. De afwezigheid van harde enzymen of centrifugeer stappen voorziet in klinisch relevante stamcellen die kunnen worden gebruikt voor studies in vitro of teruggeplaatst naar de kliniek.
Dit protocol biedt een eenvoudige kosteneffectieve manier om ASC's te isoleren zonder het gebruik van agressieve enzymen of centrifugatiestappen, die het fenotype en gedrag van de cel kunnen veranderen. Het ontbreken van harde stappen levert minder gemanipuleerde cellen op dan die geïsoleerd met behulp van enzymen en centrifugatie, waardoor de vraag wordt geminimaliseerd of experimentele waarnemingen een artefact van de isolatiemethode zijn. Deze explant methode kan genereren klinisch relevante ASCs worden ingevoerd in een patiënt om een verscheidenheid van ziekten te behandelen of uit te breiden in het leven veroorloven onderzoekstoepassingen.
Het is moeilijk om de mesmethode in woorden volledig uit te leggen. De visuele demonstratie kan dienen andere wetenschappers het gedoe van het leren uit elkaar te breken het weefsel zelf. Soortgelijke explant methoden kunnen worden gebruikt om andere populaties van MSCs te isoleren, zoals die van navelstrengweefsels.
Om de abdominoplastie weefselmonsters gehakt, breng het weefsel eerst over naar het deksel van een steriele 100 millimeter plaat. Gebruik dan een steriele naald om een stuk weefsel op zijn plaats te houden en gebruik een steriele scalpel om het weefsel in minder dan een millimeter stukken te snijden. Breng het weefsel naar een verse buis en omkeren of schud het monster vijf tot zes keer om het mengen van alle lagen te garanderen.
Breng vervolgens, met een steriele spatel, 2,5 tot vijf milliliter weefsel over naar een 100 millimeter vacuümgasplasma behandelde weefselkweekplaat. Meet het volume van het monster door in een verse centrifugebuis te gieten. Voeg vervolgens een gelijkwaardig volume weefselkweekmedia toe aan de plaat en draai de plaat voorzichtig om de inhoud te mengen.
Incubeer de plaat op 37 graden Celsius in vijf procent kooldioxide totdat een voldoende aantal cellen worden gezien op de basis van de plaat. Zodra een voldoende aantal cellen zijn opgemerkt op de plaat of na zeven dagen, afhankelijk van wat eerder is, verwijder alle resterende stukken weefsel. Vervolgens cultuur de ASC's in weefsel cultuur media totdat ze bereiken 70%-samenvloeiing of totdat de clusters dicht worden op welk punt de cellen moeten worden doorgevloeid.
Spoel de plaat voorzichtig af met 1X fosfaat gebufferde zoutoplossing. Om de aanhangende cellen te trypsinize, de fosfaatgebufferde zoutoplossing aan te trekken, voeg een milliliter trypsine toe aangevuld met 0,25%EDTA aan elke plaat en broed gedurende vijf minuten op 37 graden Celsius. Voeg een kleine hoeveelheid media toe aan de plaat om de trypsine te deactiveren.
Dan voorzichtig pipette de media trypsin vanaf de bovenkant van de plaat naar beneden, het verliezen van een zwak bevestigde cellen van de plaat. Om de cellen te zaaien, voegt u eerst media toe aan de plaat. Voeg vervolgens de cellen op een druppelwijze toe en draai de plaat om een gelijkmatige verdeling over de plaat te garanderen.
Na drie passages, ga naar cytometrie en differentiatie testen stromen. Na drie passages bleken geïsoleerde ASC's van lipoaspiraat- en abdominoplastiemonsters een MSC-morfologie en fenotype te hebben, vergelijkbaar met geïsoleerde ASC's na een enzymatische spijsvertering. Net als andere MSCs, de explant geïsoleerde ASC's zijn negatief voor CD45 en positief voor CD73, CD90, en CD105.
Bij het afsgehakt van het weefsel moet de oppervlakte van elk stuk voldoende groot zijn om de ASC's uit het weefsel te laten migreren. Dit zijn fundamentele stamcellen die kunnen worden gebruikt voor een breed scala aan toepassingen. De geïsoleerde ASC's kunnen worden gebruikt voor elke downstream toepassing, in vivo of in vitro.
Overzicht
Dit protocol beschrijft een enzymvrije methode voor het isoleren van adipose-afgeleide stamcellen (ASCs) uit abdominoplastiek- en lipoaspiraatmonsters met behulp van een explanttechniek. Deze benadering minimaliseert de celmanipulatie, waardoor klinisch relevante stamcellen worden verkregen die geschikt zijn voor diverse toepassingen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Stamcelbiologie
- Regeneratieve Geneeskunde
- Celisolatietechnieken
Achtergrond
- Traditionele methoden voor het isoleren van ASC's maken vaak gebruik van agressieve enzymen en centrifugatie.
- Deze methoden kunnen het cel-fenotype en het gedrag beïnvloeden.
- De explantaatmethode biedt een milder alternatief.
- Visuele demonstraties kunnen helpen bij het begrijpen van het proces van weefselhakselen.
Doel van de studie
- Om een kosteneffectieve en eenvoudige methode te ontwikkelen voor het isoleren van ASC's.
- Om het risico op artefacten in experimentele waarnemingen, veroorzaakt door agressieve isolatietechnieken, te verminderen.
- Om klinisch relevante ASC's te genereren voor therapeutische toepassingen.
Gebruikte methoden
- Fijngehakt weefsel van een abdominoplastiek wordt gekweekt in een weefselkweekplaat.
- Cellen worden geïncubeerd bij 37°C in een CO2-omgeving.
- Na voldoende celgroei worden de resterende weefselstukjes verwijderd.
- Cellen worden gepassaged en gekarakteriseerd op stamcelmarkers.
Belangrijkste resultaten
- Geïsoleerde ASC's vertonen een morfologie en fenotype die vergelijkbaar zijn met die verkregen via enzymatische digestie.
- Via explantaat geïsoleerde ASC's zijn negatief voor CD45 en positief voor CD73, CD90 en CD105.
- De methode levert minder gemanipuleerde cellen op, wat de experimentele betrouwbaarheid verhoogt.
- ASC's kunnen worden gebruikt voor diverse downstream-applicaties, zowel in vivo als in vitro.
Conclusies
- De explantmethode is een levensvatbaar alternatief voor het isoleren van ASC's.
- Deze techniek behoudt de celkenmerken beter dan traditionele methoden.
- Geïsoleerde ASC's hebben een breed potentieel voor onderzoek en klinische toepassingen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Deze enzymvrije isolatiemethode pakt een belangrijke uitdaging in de regeneratieve geneeskunde aan: het verkrijgen van klinisch relevante mesenchymale stamcellen zonder artefacten te introduceren door zware enzymatische of mechanische bewerkingen. Door het behoud van het natuurlijke celfenotype en de functie, vergroot deze benadering het voorspellende vertrouwen in downstream-toepassingen, zoals ziektemodellering en therapeutische screening. De methode ondersteunt vroege discovery-workflows waarbij biologische risicoreductie en targetvalidatie afhankelijk zijn van betrouwbare, minimaal gemanipuleerde celbronnen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken met behulp van uit vetweefsel afgeleide stamcellen met behouden multipotentie en oppervlaktemarkeerprofielen.
- Operationele waarde: Vermindert de variabiliteit in experimentele resultaten door enzym-geïnduceerde fenotypische veranderingen te elimineren.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt biologische risicovermindering door het genereren van minder gemanipuleerde cellen voor target-validatieassays.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Produceert uit vetweefsel afgeleide stamcellen die geschikt zijn voor gestandaardiseerde in vitro assays die consistente mesenchymale fenotypes vereisen.
- Operationele waarde: Faciliteert de gereedheid voor assays via expansie op basis van explantaten, waarbij de positiviteit voor CD73, CD90 en CD105 behouden blijft.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt reproduceerbare celproductie voor compound-screening en mechanistische studies.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Biedt een klinisch relevante celbron die is afgestemd op toepassingen binnen de regeneratieve geneeskunde.
- Preklinisch model: Maakt de generatie van adipose-afgeleide stamcellen mogelijk voor ziekterelevante systemen zonder blootstelling aan xenogene enzymen.
- Mechanische risicoreductie: Vermindert zorgen over isolatie-artefacten die de differentiatie of beoordelingen van de immunomodulerende functie beïnvloeden.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van vroege stamcelisolatie tot preklinische validatie, ter ondersteuning van workflows waarbij de integriteit van de celbron van invloed is op de betrouwbaarheid van gegevens en go/no-go-beslissingen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten door het leveren van uit vetweefsel afgeleide stamcellen met een natuurgetrouwe morfologie en fenotype.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, expansie-klare cellen voor assayplatforms die kenmerken van mesenchymale stromale cellen vereisen.
- Analytics: Maakt flowcytometrie en differentiatie-assays mogelijk na drie passages om de identiteit van de stamcellen te bevestigen.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt isolatie met therapeutisch potentieel door het behoud van klinisch relevante cel-eigenschappen.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar, enzymvrij platform voor de productie van uit vetweefsel afgeleide stamcellen over verschillende projecten heen.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen door isolatie-geïnduceerde artefacten in stamcele xperimenten te minimaliseren.
- Operationele waarde: Biedt een kosteneffectief, eenvoudig protocol zonder afhankelijkheid van dure enzymen of centrifugatie.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door een groter vertrouwen in de resultaten van celgebaseerde assays.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde voortgang door betrouwbare mesenchymale stamcellen te leveren voor preklinische evaluatie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist aseptische techniek en basisapparatuur voor weefselkweek voor mechanisch fijnmaken en explantaatkweek.
- Is afhankelijk van steriele instrumenten, waaronder scalpels, naalden en spatels voor de preparatie van weefsel.
- Necessiteert gestandaardiseerde incubatiecondities bij 37°C met 5% CO2 voor een optimale celgroei.
- Omvat handmatig passeren op basis van confluentie of clusterdichtheid na de initiële weefselverwijdering.
- Vertrouwt op flowcytometrie en differentiatie-assays voor fenotypische bevestiging na isolatie.
