Name: Evaluatie van colorectale kanker risico en prevalentie door ontlasting DNA Integriteit Detectie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Leer een niet-invasieve methode voor het detecteren van colorectale neoplastische laesies met behulp van de FL-DNA kit. Deze gebruiksvriendelijke test verbetert de voorspelling van kanker in combinatie met bestaande screeningsmethoden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs hebben geen erkenningen.

Tussen 2013 en 2015 werden patiënten aangeworven bij de Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) van Meldola (FC, Italië). Ingeschreven patiënten waren opgenomen in protocol IRSTB002, goedgekeurd door de Ethische Commissie van IRST - IRCCS AVR (25/10/2012, ver. 1). Alle methoden werden uitgevoerd in overeenstemming met relevante richtlijnen en voorschriften. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle patiënten.
1. DNA-extractie uit ontlasting
<ol><li>Gebruik een kit om ontlastingsmonsters voor te bereiden (zie Tabel met materialen)). Selecteer en behandel het fecale materiaal door de extractie uit te voeren volgens de instructies van de fabrikant. Versterk het gezuiverde DNA direct of bewaar bij -20 °C voor latere analyse.</li>
</ol>2. Voorbereiding van positieve controle, normen, spike-in DNA en klinische monsters
<ol><li>Bereiding van normen en monsters<ol>
<li>Om de positieve controle, normen, spike-in DNA, en alle klinische monsters voor te bereiden, centrifuge een aliquot van positieve controle, normen, en spike-in DNA, dan resuspend elk reagens door het toevoegen van de juiste hoeveelheid geleverd water (zie hieronder). Dan, zorgvuldig vortex de positieve controle, standaard, en spike-in DNA, dan centrifuge voor 10 s. Om een volledige resuspensie van de droge reagentia te bereiken, slaat u de vloeistofreagentia op kamertemperatuur (RT) gedurende 30 minuten voor gebruik op.<ol>
<li>De positieve controle is menselijk DNA in een droog formaat. Resuspend elke aliquot met 750 μL water.</li>
			<li>De spike-in DNA is zalm (Oncorhynchus keta) DNA, die wordt gebruikt als een exogene interne controle om de mogelijke aanwezigheid van remmers in DNA-monsters uit ontlasting te verifiëren. Resuspend elke aliquot met 100 μL water.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Om de standaardcurve voor te bereiden, produceert u vier 1:5 verdunningen vanaf de voorraadoplossing. De standaardpunten moeten 10 ng/reactie, 2 ng/reactie, 0.4 ng/reactie, en 0.08 ng/reactie zijn.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voorbereiding van het 1x spike-in DNA<ol>
<li>Bereid de spike-in DNA-controle direct voor gebruik voor.</li>
		<li>Bereid de 1x spike-in DNA-controle voor door 5 μL FL-DNa spike te mengen met 20 μL steriel water. Het aantal 1x spike-in DNA-controle monsters zal worden voorbereid op basis van het aantal van de monsters worden geanalyseerd, plus de positieve controle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiding van monsters<ol>
<li>Meng 75 μL van de monsters (klinische monsters of positieve controle) met 25 μL 1x spike-in DNA, wat een totaal volume van 100 μL oplevert.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Versterking en bepaling van de FL-DNA waarde met behulp van qPCR Easy PGX
OPMERKING: Volledige versterkingsmengsels die specifieke primers en sondes bevatten die gericht zijn op het menselijk DNA en de interne controle zijn voorzien in een lyofiel formaat in 8 putstrips voor FL-DNA Mix A en FL-DNA Mix B. Normen, positieve en negatieve controles en monsters moeten worden versterkt met beide lyoffiele mixen. Klinische monsters mogen alleen in tweevoud worden versterkt met beide lyofiele mengsels.
<ol><li>Zie de tabel van materialen voor qPCR-instrument en operationele software.<ol>
<li>Open de bedrijfssoftware en stel de plaat en het thermische profiel in:<ol>
<li>Stel de plaat in zoals aangegeven in tabel 1.<ol>
<li>Stel het puttype in voor alle acht posities in kolom 1 als Standaard.</li>
				<li>Stel het puttype in voor de A2- en B2-putten als NTC.</li>
				<li>Stel het brontype voor C2 en D2 (de positieve besturingselementen) in als Onbekend.</li>
				<li>Stel het puttype voor alle andere posities in als Onbekend.
</li>
				<li>Selecteer alle 96 posities en voeg de Dyes FAM en HEXtoe. Klik op Synchronisatieplaat.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Stel het thermische profiel in volgens tabel 2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Centrifuge het benodigde aantal strips voor 10 s om de inhoud naar de bodem van de buis te brengen.</li>
		<li>Verwijder voorzichtig de afdichtingen uit de stroken, met aandacht voor het behoud van de inhoud, en voeg toe aan de respectieve stroken: negatieve controle: 20 μL water; monster: 20 μL DNA; standaardcurve: 20 μL van standaard 1, 2, 3 of 4; positieve controle: 20 μL positieve controle.</li>
		<li>Sluit alle strips voorzichtig met behulp van de 8 strip platte optische doppen en vortex voor enkele seconden.</li>
		<li>Centrifugeren de strips voor 10 s en laad ze in het instrument. Start dan de run.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Gegevensanalyse
LET OP: Gegevensanalyse kan automatisch of handmatig worden uitgevoerd, afhankelijk van de software (zie Tabel met materialen).
<ol><li>Selecteer aan het einde van de run de kolommen A, C, E, G voor "FAM: FL-DNA-A" en "HEX: IC"en kolommen B, D, F, H voor "FAM: FL-DNA-B" en "HEX: IC".</li>
	<li>Stel het volgende in voor het standaardhoeveelheid :10 ng/reactie voor A1- en B1-putten, 2 ng/reactie voor C1 en D1, 0,4 ng/reactie voor E1 en F1 en 0,08 ng/reactie voor G1 en H1.</li>
	<li>Stel drempelfluorescentiewaarden in op 150 voor zowel FAM (FL-DNA A als FL-DNA B) en HEX (IC) kanalen.</li>
	<li>Klik in het vak Resultaattabel op Kolomopties | Alles selecteren | Ok om de resultaten te verkrijgen in beide kanalen met hun respectieve Cq (∙R) en ∙R laatste waarden. LET OP: Deze waarden worden geleverd door de Real Time PCR-instrumentsoftware. ΔR komt laatst overeen met de fluorescentiewaarde genormaliseerd aan de laatste versterkingscyclus.</li>
	<li>Klik in het vak Resultaattabel met de rechtermuisknop op de tabel om het contextmenu te openen en klik op Verzenden naar Excel om de ruwe gegevens te exporteren.</li>
	<li>Controleer de waarden van de normen om de geschiktheid van de standaardcurve te controleren.</li>
	<li>Controleer voor elke FL-DNA-mix de R2 [R² (R²)" kolom en efficiëntie ["Efficiëntie (%)" kolom] waarden. Als ze zich in een aanvaardbaar bereik bevinden, is het mogelijk om de instructies van de fabrikant dienovereenkomstig te analyseren(tabel 3).</li>
	<li>Als de resultaten van het FAM-kanaal zich niet in het verwachte bereik bevinden, laat dan één punt van de standaardcurve weg en heranalyseer de run.</li>
	<li>Bepaal de waarden van de negatieve en positieve besturingselementen met de volgende formule, rekening houdend met de waarden 'Geen Cq' als nul: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq2.jpg">
</li>
	<li>Vergelijk de verkregen waarden met die welke in tabel 4worden vermeld .</li>
	<li>Als de reactiebesturingselementen zich binnen het bereik van de verwachte waarden bevinden, gaat u verder met de analyse van de monsters. OPMERKING: Controleer of de verkregen Cq-waarden worden gegenereerd uit een echte versterkingsreactie (sigmoïdale fluorescentiecurve) en niet uit een artefact (lineaire fluorescentiecurve).</li>
	<li>Als u de geschiktheid van het monster voor elke FL-DNA-mix wilt analyseren, vergelijkt u de Cq-waarden van het HEX-kanaal. Als de waarde ≥16 is, gaat u verder met de analyse van de monsters. Als de waarde <16 is of er geen Cq is, is dit waarschijnlijk te wijten aan een doseerfout van de FL-DNA Spike. Daarom is het niet mogelijk om de monsters te analyseren.</li>
	<li>Bereken het gemiddelde van de Cq-waarden in het HEX-kanaal van het positieve besturingselement met behulp van de volgende formule: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq3.jpg">
</li>
	<li>Bereken het gemiddelde van de Cq-waarden in het HEX-kanaal van de voorbeeldrepliceert met de volgende formule: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq4.jpg">
</li>
	<li>Bereken de CqHEX-waarden volgens de volgende formule: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq5.jpg">
</li>
	<li>Vergelijk de CqHEX-waarden van de monsters met de in tabel 5gerapporteerde .</li>
	<li>Vergelijk voor elke mix (Mix A en Mix B) de Cq-waarden van het FAM-kanaal met die welke in tabel 6 worden gerapporteerd.
</li>
	<li>Gebruik de volgende formule, rekening houdend met de waarden 'Geen Cq' als nul om de FL-DNA-waarde van elk geschikt monster te bepalen: <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq6.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq2.jpg"> OPMERKING: Colorectale kankerrisico en prevalentie is een functie van iFOBT- en FL-DNA-evaluaties volgens de Fagan nomogramresultaten verkregen door Rengucci et al.12 (Tabel 7).</li>
</ol>

<ol><li>Fearon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Genetics+of+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Molecular Genetics of Colorectal Cancer.</a> Annual Review of Pathology. 6, 479-507 (2011).</li>
<li>Sears, C. L., Garrett, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbes%2C+Microbiota%2C+and+Colon+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Microbes, Microbiota, and Colon Cancer.</a> Cell Host and Microbe. 15, 317-328 (2014).</li>
<li>SEER Stat Fact Sheets: Colon and Rectum Cancer. National Cancer Institute. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://seer.cancer.gov/statfacts/html/colorect.html">http://seer.cancer.gov/statfacts/html/colorect.html</a> (2019).</li>
<li>Levin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+Surveillance+for+the+Early+Detection+of+Colorectal+Cancer+and+Adenomatous+Polyps%2C+2008%3A+A+Joint+Guideline+From+the+American+Cancer+Society%2C+the+US+Multi-Society+Task+Force+on+Colorectal+Cancer%2C+and+the+American+College+of+Radiology%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Screening and Surveillance for the Early Detection of Colorectal Cancer and Adenomatous Polyps, 2008: A Joint Guideline From the American Cancer Society, the US Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer, and the American College of Radiology.</a> Gastroenterology. 134, 1570-1595 (2008).</li>
<li>Bosch, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+tests+for+colorectal+cancer+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Colorectal+Cancer%22%5BJournal%5D)">Molecular tests for colorectal cancer screening.</a> Clinical Colorectal Cancer. 10, 8-23 (2011).</li>
<li>Ahlquist, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+detection+of+colorectal+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Molecular detection of colorectal neoplasia.</a> Gastroenterology. 138, 2127-2139 (2010).</li>
<li>Calistri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+multiple+molecular+tests+to+detect+colorectal+cancer+in+stool%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Fecal multiple molecular tests to detect colorectal cancer in stool.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology. 1, 377-383 (2003).</li>
<li>Calistri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+colorectal+cancer+by+a+quantitative+fluorescence+determination+of+DNA+amplification+in+stool%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Detection of colorectal cancer by a quantitative fluorescence determination of DNA amplification in stool.</a> Neoplasia. 6, 536-540 (2004).</li>
<li>Calistri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fluorescence+determination+of+long-fragment+DNA+in+stool+as+a+marker+for+the+early+detection+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Quantitative fluorescence determination of long-fragment DNA in stool as a marker for the early detection of colorectal cancer.</a> Cellular Oncology. 31, 11-17 (2009).</li>
<li>Calistri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+DNA+for+noninvasive+diagnosis+of+colorectal+cancer+in+immunochemical+fecal+occult+blood+test-positive+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiology+Biomarkers+and+Prevention%22%5BJournal%5D)">Fecal DNA for noninvasive diagnosis of colorectal cancer in immunochemical fecal occult blood test-positive individuals.</a> Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 19, 2647-2654 (2010).</li>
<li>De Maio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+and+stool+nucleic+acid+analysis+for+colorectal+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Circulating and stool nucleic acid analysis for colorectal cancer diagnosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20, 957-967 (2014).</li>
<li>Rengucci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+stool+DNA+integrity+method+for+early+colorectal+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiology+Biomarkers+and+Prevention%22%5BJournal%5D)">Improved stool DNA integrity method for early colorectal cancer diagnosis.</a> Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 23, 2553-2560 (2014).</li>
</ol>

Maura Menghi is fulltime medewerker van Diatech Pharmacogenetics srl.

Eerdere studies hebben aangetoond dat DNA-integriteitsanalyse van ontlasting die wordt geëxtraheerd door handmatige en semi-automatische benaderingen een alternatief instrument kan zijn voor de vroegtijdige detectie van colorectale laesies7,8,9,10,11,12. Moleculaire, niet-invasieve screening tests zijn ontwikkeld door de jare...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/59426/evaluation-colorectal-cancer-risk-prevalence-stool-dna-integrity">Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection</a>. An&#160;affiliation&#160;was&#160;updated.
The first&#160;affiliation was updated from:
Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST)
to:
Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/59426/evaluation-colorectal-cancer-risk-prevalence-stool-dna-integrity">Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection</a>. An&#160;affiliation&#160;was&#160;updated.

Erratum: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Colorectale kanker (CRC) is afgeleid van een multi-step proces waarbij gezond epitheel zich langzaam ontwikkelt tot adenomen of poliepen, die in de loop van de tijd uitgroeien tot kwaadaardige carcinomen1,2. Ondanks het hoge incidentiepercentage van CRC is er de afgelopentienjaar een neerwaartse trend in het percentage sterfgevallen waargenomen . Inderdaad, vroege diagnostische instrumenten die in screeningsprogramma's zijn aangenomen, hebben geleid tot vroegtijdige opsporing en verwijdering van pre-neoplastische adenomen of poliepen4. Echter, vanwege de verschillende technische limieten, geen van deze methoden is optimaal. Om de gevoeligheid en specificiteit te verbeteren, zijn veel dna-tests met ontlasting alleen of in combinatie met de huidige routinediagnosetests5,6voorgesteld .
Typisch, gezonde slijmvlies werpt in de fecale stroom apoptotische colonocyten, terwijl zieke slijmvlies exfoliates niet-apoptotische colonocyten. Fragmenten van 200 bp of meer in lengte karakteriseren niet-apoptotisch DNA. Dit DNA heet lang DNA (L-DNA) en is uitgegroeid tot een bruikbare biomarker voor CRC vroege diagnose. Het L-DNA kan worden geïsoleerd van ontlasting specimen en gekwantificeerd door qPCR met behulp van een in vitro diagnostische FL-DNA kit7,8,9,10,11,12.
De test bestaat uit twee tests voor de detectie van FL-DNA fragmenten variërend van 138 bp tot 339 bp. Elke test maakt de versterking van FL-DNA (FAM) en spike-in DNA (HEX) mogelijk. Om een optimale versterking van alle fragmenten te garanderen, is de test verdeeld in twee tests (genaamd "A" en "B"). De A-test detecteert twee gebieden van exon 14 van het APC-gen (NM_001127511) en een fragment van exon 7 van het TP53-gen (NM_001276760). De B-test detecteert een fragment van exon 14 van het APC-gen (NM_001127511) en twee gebieden van exonen 5 en 8 van het TP53-gen (NM_001276760). De tests maken geen onderscheid tussen de gedetecteerde regio's. Het spike-in DNA komt overeen met het Oncorhynchus keta zalm DNA en maakt het mogelijk om te controleren of de procedure goed is uitgevoerd en controleert op de mogelijke aanwezigheid van remmers, wat foutnegatieve resultaten kan opleveren. De FL-DNA concentratie wordt geëvalueerd door absolute kwantificering met behulp van de standaard curve methode en wordt uitgedrukt als ng / reactie.
De FL-DNA methode is een niet-invasieve en goedkope ontlasting DNA-test die, in combinatie met de immunochemische op basis van fecale occulte bloedtest (iFOBT), wordt momenteel gebruikt in CRC screening programma's en zorgt voor betere voorspellingen van CRC en / of hoog risico adenoma laesies12.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL en 2 mL polypropyleen twist-lock buisjes (DNase-, RNase-, DNA-, PCR remmer-vrij)</td><td></td><td></td><td>Benodigdheden voor DNA-extractie en Real Time PCR</td></tr><tr><td>Absoluut Ethanol (kwaliteit van analytische graad)</td><td></td><td></td><td>Reagens vereist voor DNA-extractie</td></tr><tr><td>Centrifuge voor op tafel&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Maximale snelheid van 20000 x g. Instrument vereist voor DNA-extractie</td></tr><tr><td>EasyPGX analysesoftware versie 2.0.0</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT800-SW</td><td>Analysesoftware&nbsp;</td></tr><tr><td>EasyPGX centrifuge/vortex 8-well strips</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT803</td><td>Instrument aanbevolen voor de Real Time PCR-test</td></tr><tr><td>EasyPGX qPCR instrument 96&nbsp;</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT800-96</td><td>Instrument aanbevolen voor de Real Time PCR-test</td></tr><tr><td>EasyPGX ready FL-DNA</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT029</td><td>Kit vereist voor de Real Time PCR-test</td></tr><tr><td>Micropipetten (volumes van 1 tot 1.000 &micro;L)</td><td></td><td></td><td>Benodigdheden voor DNA-extractie en Real Time PCR</td></tr><tr><td>Poedervrije wegwerphandschoenen</td><td></td><td></td><td>Benodigdheden voor DNA-extractie en Real Time PCR</td></tr><tr><td>QIAamp Fast DNA Stool</td><td>Qiagen</td><td>51604</td><td>Kit aanbevolen voor de DNA-extractie en zuivering uit ontlasting</td></tr><tr><td>Steriele filtertips DNase-, RNase-vrij (volumes van 1 tot 1.000 &micro;L)</td><td></td><td></td><td>Benodigdheden voor DNA-extractie en Real Time PCR</td></tr><tr><td>Thermische blok bijv. EasyPGX dry block</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT801</td><td>Instrument vereist voor DNA-extractie</td></tr><tr><td>Vortex bijv. EasyPGX centrifuge/vortex 1.5 ml&nbsp;</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT802</td><td>Instrument vereist voor DNA-extractie</td></tr></tbody></table>

evaluatie van colorectale kanker risico en prevalentie door ontlasting dna integriteit detectie

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Tegenwoordig kan ontlasting DNA worden geïsoleerd en geanalyseerd door verschillende methoden. De lange fragmenten van DNA in ontlasting kunnen worden gedetecteerd door een qPCR-test, die een betrouwbare waarschijnlijkheid biedt van de aanwezigheid van pre-neoplastische of neoplastische colorectale laesies. Deze methode, genaamd fluorescentie lang DNA (FL-DNA), is een snelle, niet-invasieve procedure die een verbetering is ten opzichte van het primaire preventiesysteem. Deze methode is gebaseerd op de evaluatie van fecale DNA-integriteit door kwantitatieve versterking van specifieke doelen van genomisch DNA. Met name de evaluatie van DNA-fragmenten langer dan 200 bp maakt detectie van patiënten met colorectale laesies met een zeer hoge specificiteit mogelijk. Dit systeem en alle momenteel beschikbare dna-tests met ontlasting geven echter een aantal algemene problemen die moeten worden aangepakt (bijvoorbeeld de frequentie waarop tests moeten worden uitgevoerd en een optimaal aantal ontlastingsmonsters die op elk tijdstip voor elk individu worden verzameld). Het belangrijkste voordeel van FL-DNA is echter de mogelijkheid om het te gebruiken in combinatie met een test die momenteel wordt gebruikt in het CRC-screeningprogramma, bekend als de immunochemische fecale occulte bloedtest (iFOBT). Beide tests kunnen namelijk op hetzelfde monster worden uitgevoerd, waardoor de kosten worden verlaagd en een betere voorspelling wordt gedaan van de uiteindelijke aanwezigheid van colorectale laesies.

De werkstroom van dit protocol wordt weergegeven in figuur 1. De werkstroom biedt twee controlestappen en verschillende acties op basis van deze stapresultaten. Ten eerste, als een monster ongeschikte besturingselementen bevat, moet de versterking worden herhaald. Ten tweede, als de versterking wordt geremd, moet het monster vanaf het begin worden herverwerkt of als niet waardevol worden geclassificeerd.
Figuur 2 toont de fluorescentiecurven die worden geprodu...

De gepresenteerde diagnostische FL-DNA kit is een tijdbesparende en gebruiksvriendelijke methode om de betrouwbare waarschijnlijkheid van de aanwezigheid van colorectale kankerlaesies te bepalen.

Evaluatie van colorectale kanker risico en prevalentie door ontlasting DNA Integriteit Detectie

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Deze methode maakt het mogelijk om, door een niet-invasieve aanpak, patiënt met colorectale neoplastische laesie te detecteren. In het bijzonder, deze test maakt het mogelijk, in combinatie met tests die momenteel worden gebruikt in colorectale kanker screening programma, om beter te voorspellen de aanwezigheid van kanker of een hoger risico op abnormale laesies. Om dit protocol te beginnen, centrifuge een aliquot van elke positieve controle, standaard NC's, en spike-in DNA, in een droog formaat gedurende 10 seconden op een minicentrifuge.Resuspend de positieve controle met 750 microliters van water. Resuspend de spike-in DNA, gebruikt als een exogene interne controle, om de aanwezigheid van remmers te testen, met 100 microliters van water. Voor de standaardcurve, resuspend de droge standaard met 100 microliter water en maak vier 1:5 verdunningen vanaf de voorraad oplossing.Dan, zorgvuldig vortex de reagentia voor 15 seconden, en centrifuge in een mini-centrifuge gedurende 10 seconden. Bewaar de vloeibare reagentia voor een volledige resuspensie gedurende 30 minuten op kamertemperatuur voordat u deze gebruikt. Om de 1x spike-in DNA-controle voor te bereiden, meng je vijf microliter fl-DNA-spike met 45 microliter steriel water.Voor de monsters, meng 75 microliter van elk monster met 50 microliter van 1x spike-in DNA, wat een totaal volume van 125 microliters oplevert. Open eerst de qPCR-besturingssysteem. Als u de plaat wilt instellen, stelt u het puttype in voor alle acht posities in kolom één, als Standaard.Stel de Well Type voor de A2 en B2 putten als NTC. Stel het goedtype in voor de positieve besturingselementen, C2 en D2, als Onbekend. En stel de Well Type voor alle andere posities als Onbekend.Selecteer alle 96 posities. Voeg de kleurstoffen, FAM en HEX toe en klik op Sync Plate. Stel vervolgens het thermisch profiel in, zoals voorzien.Bereid het gewenste aantal 8-well strips met volledige lyophilized versterking mengsels, met specifieke primers en sondes gericht op het menselijk DNA, en de interne controle. Om de inhoud naar de bodem van de buizen te brengen, centrifuge de strips gedurende 10 seconden. Verwijder voorzichtig de afdichtingen uit de reepjes, om ervoor te zorgen dat er geen pellet verliest.Voeg vervolgens 25 microliter water toe aan de negatieve controleputten. 25 microliter monster-DNA om putten te bemonsteren en 25 microliter van positieve controle-DNA aan de positieve controleputten. Voor de standaardcurve voegt u 25 microliter standaard 1, 2, 3 en 4 toe in elke speciale put.Gebruik 8-strip platte optische doppen om zorgvuldig te sluiten alle strips en vortex voor een paar seconden. Centrifuge de strips gedurende 10 seconden, laad ze in het instrument, en start de run. Selecteer aan het einde van de run, voor FAM FL-DNA A en HEX IC, kolommen, A, C, E en G.Voor FAM FL-DNA B en HEX IC, selecteer kolommen, B, D, F en H.Voor de standaardhoeveelheid hoeveelheden, stel 10 nanogram per reactie in voor A1- en B1-putten, twee nanogrammen per reactie voor C1 en D1, punt vier nanogrammen per reactie voor E1 en F1 , en punt nul acht nanogram per reactie voor G1 en H1. Stel vervolgens voor zowel FAM- als HEX-kanalen drempelfluorescentiewaarden in op 150.Klik in het vak Resultaattabel op Kolomopties en selecteer vervolgens Alles en vervolgens Oke om de resultaten in beide kanalen te verkrijgen met hun respectievelijke Cq- en delta R-laatste waarden, die worden geleverd door de realtime qPCR-instrumentsoftware. Delta R komt laatst overeen met de fluorescentiewaarde die is genormaliseerd tot de laatste versterkingscyclus. Klik in het vak Resultaattabel met de rechtermuisknop op de tabel om het contextmenu te openen.Klik op Verzenden naar Excel om de ruwe gegevens te exporteren. Upload vervolgens het Excel-bestand op de speciale analysesoftware voor geautomatiseerde berekening van de HOEVEELHEID FL-DNA. Uit de combinatie van iFOBT en FL-DNA waarden schatting voor elke patiënt, de colorectale kanker risico.Fluorescentiecurven van een geschikt positief monster tonen het monstersignaal op het HEX-kanaal, dat de interne controle is, binnen het aanvaardbare bereik. Positief signaal is boven de drempel op het FAM-kanaal, wat de versterking van doelgenen laat zien. Fluorescentiecurven van een geschikt negatief monster tonen het monstersignaal binnen het aanvaardbare bereik op het HEX-kanaal.Het negatieve controlesignaal ligt onder de drempel op het FAM-kanaal. Aan de andere kant tonen krommen van een niet-geschikt monster het monstersignaal dat niet binnen het aanvaardbare bereik op het HEX-kanaal valt. Waarschijnlijk te wijten aan een mogelijke remming.Daarom moet dit monster worden herhaald, te beginnen met de extractie. Software analyse output tabel toont gegevens voor zowel Mix A en Mix B in termen van FL-DNA concentratie voor reactie controles, klinische monsters, en run kwaliteitscontrole resultaten. Voorbeeld nummer vier heeft geen resultaten omdat het niet de kwaliteitscontrole heeft doorstaan.Het moet herhaald en opnieuw worden geanalyseerd. Wees voorzichtig bij het opnieuw opspenen van het DNA voor spike-in controle naar de standaard curve. En bij het distribueren van verschillende DSM's naar 8-well strips, evenals tijdens moleculaire detectie in de sectie resultatenanalyse.Deze methode moet worden uitgevoerd in combinatie met de iFOBT-test om een betere evaluatie van colorectale neoplastische laesies mogelijk te maken, het moet worden uitgevoerd met hetzelfde fecale monster.

evaluation-colorectal-cancer-risk-prevalence-stool-dna-integrity

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Verminderd / afwezige uitdrukking van PMS2 en / of ERCC1 in hele crypten is een frequent geval binnen 10 cm aan elke kant van colon adenocarcinomen, waarschijnlijk de basis van een gezichtsveld met een hoge veranderlijkheid en de progressie van kanker. Deficiëntie in Ku86 of CcOI is veel minder frequent in deze veld gebreken.

Gebrekkige PMS2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Gebreken Tijdens Progressie naar Colon Cancer

Beschreven wij een procedure voor het uiteenvallen van colorectale kanker (CRC) levensvatbare enkele cellen, die vervolgens worden opgevangen op maat antilichaam microarrays herkennen van oppervlakte-antigenen (DotScan CRC microarray) te produceren. Subpopulaties van cellen gebonden aan de microarray kan worden geprofileerd door fluorescentie multiplexen behulp van monoklonale antilichamen gelabeld met een fluorescerende kleurstoffen.

Colorectal Cancer Cell oppervlakte-eiwit Profiling Met behulp van een antilichaam Microarray en fluorescentie Multiplexing

This video describes DNA isolation protocol from stool samples of colon tumor-bearing mice. The extracted DNA is amplified using PCR, and the product is further cleaned using a magnetic beads-based approach. This method can be used to determine the effect of environmental enrichment on colon microbiota and animal mortality.

Stool Microbial DNA Isolation: Studying the Effect of Environmental Enrichment on Microbiome Diversity in Murine Tumor Model

We rapporteren significante verbeteringen voor de reproduceerbare meting van somatische colonische stamcelmutaties na blootstelling van muizen aan potentieel DNA-beschadigende stoffen.

Kwantificering van Colonic Stem Cell Mutaties

Er wordt een methode voorgesteld voor het analyseren van de DNA-integriteit in de celvrije supernatantfractie van urinemonsters. De methode is geschikt voor vroege detectie van urologische maligniteiten en heeft bewezen nauwkeurig te zijn voor de vroege diagnose van blaaskanker.

Cell-Free DNA Integrity Analysis in de urine monsters

Milieu verrijking (EE) is een dierverblijven omgeving die wordt gebruikt voor het onthullen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de verbindingen tussen de levensstijl, stress en ziekte. Dit protocol beschrijft een procedure maakt die gebruikmaakt van een muismodel van dikke darm tumorvorming en EE aan wijzigingen in microbiota biodiversiteit die mogelijk van invloed op dierlijke sterfte specifiek te definiëren.

Een methode om de effecten van milieu verrijking op de dikke darm Microbiome biodiversiteit in een muismodel van het Colon-Tumor definiëren

Digitale polymerase-kettingreactie (PCR) is een nuttig hulpmiddel voor het opsporen van hoog-gevoeligheid van één nucleotide varianten en DNA kopie nummer varianten. Hier tonen we belangrijke overwegingen voor het meten van zeldzame varianten in het menselijk genoom digitale PCR met de chip-in-a-tube-indeling.

Digitale Polymerase Chain Reaction Assay voor de genetische variatie in een sporadische familiale adenomateuze Polyposis patiënt met behulp van de Chip-in-a-tube-indeling

Hier gepresenteerd is een protocol om de overuitexpressieve driver genen behoud van de gevestigde kanker stam-achtige cellen afgeleid van colorectale HT29 cellen te ontdekken. RNAseq met beschikbare bioinformatica werd uitgevoerd om genexpressienetwerken te onderzoeken en te screenen voor het ophelderen van een potentieel mechanisme dat betrokken is bij de overleving van gerichte tumorcellen.

Ontdekking van drivergenen in colorectale HT29-afgeleide kankerstam-achtige tumorsferen

We presenteren een flexibel protocol voor het genereren van hoogwaardige virale fractiemetagenomen (viromen) uit menselijke ontlastingsmonsters. Oorspronkelijk ontwikkeld voor bodemviromica, werd dit protocol hier met succes toegepast op ontlastingsmonsters, waardoor een robuuste karakterisering van de menselijke darmvirosfeer mogelijk is.

DNA-virale fractie metagenomica voor menselijke ontlastingsmonsters

We beschrijven de oprichting van orthotopische colorectale tumoren via injectie van tumorcellen of organoïden in de cecum van muizen en de daaropvolgende isolatie van circulerende tumorcellen (CTC's) uit dit model.

Isolatie van circulerende tumorcellen in een orthotopische muismodel van colorectale kanker

Leer een niet-invasieve methode voor het detecteren van colorectale neoplastische laesies met behulp van de FL-DNA kit. Deze gebruiksvriendelijke test verbetert de voorspelling van kanker in combinatie met bestaande screeningsmethoden.

Evaluatie van colorectale kanker risico en prevalentie door ontlasting DNA Integriteit Detectie

Meer video's verkennen