Evaluatie van een universele geneste omgekeerde transcriptie polymerase chain reactie voor de opsporing van Lyssaviruses

De geneste RT-PCR is ontwikkeld om alle Lyssavirussen te detecteren, inclusief alle 16 ictv-goedgekeurde en twee nieuwe Lyssavirussoorten. De validatie van deze methode is bewezen door het gebruik van meer dan 9000 dierlijke hersenen specimens in 10 jaar van klinische rabiës diagnose en surveillance in China. De geneste RT-PCR kan niet alleen geloofwaardig resultaat opleveren op verse hersenweefselmonsters, maar ook op gedegradeerde monsters.

De overstroming deze methode kan worden gebruikt om biologische vloeistof monsters zoals hersenvocht, speeksel en urine te testen, waardoor deze methode kan worden toegepast in ultimatum diagnoses. Om pcr-overdrachtsbesmetting te minimaliseren, is het belangrijk om negatieve en positieve controles voor te bereiden Het is echt belangrijk om stappen te zetten. Voor elke RNA-extractie moet bijvoorbeeld worden voorbereid, moeten PCR-opstelling en gelelektroforese in fysiek gescheiden gebieden worden gebruikt.

Het wordt ook aanbevolen om spiraaltapes te gebruiken in RNA-extractie en omgekeerde transcriptie om besmetting met hondsdolheid aan de peptideketen te voorkomen. Een goede behandeling, zoals het voorbereiden van uw agenten op ijs, het regelmatig verwisselen van handschoenen en het gebruik van ribonucleasevrije materialen, zullen de introductie van ribonuclease voorkomen en afbraak van RNA elimineren. Om te beginnen met deze procedure, extract van de RNA uit hondsdolheid verdacht weefsel, huidbiopsieën, speeksel, hersenvocht of RABV geïnfecteerde celcultuur zoals beschreven in het tekstprotocol.

Wanneer klaar om verder te gaan, verwijderde de benodigde reagentia uit de vriezer en houd ze op ijs. Zorg ervoor dat ontdooien en vortex elk reagens voor gebruik. Voor omgekeerde transcriptie van het virale RNA naar cDNA bereiden 12 micro liter reactiemix voor elk monster op ijs en een 1,5 milliliter centrifuge buis zoals beschreven in tabel 1 van het tekstprotocol in een cleanroom.

Om rekening te houden met pipetting variaties, bereiden een volume van master mix ten minste een reactie grootte groter dan nodig, en vervolgens verdelen de reactie mix in 0,2 milliliter PCR buizen. Voeg in een PCR-werkstation in een sjabloonruimte acht microliters van het monster of een van de besturingselementen toe aan de reactiemix. De positieve controle is RNA gewonnen uit de celcultuur besmet met vaste RABV stam CVS11, terwijl de negatieve controle bevat Rnase-vrije dubbele gedestilleerd water.

Meng de inhoud van elke buis door eerst vortexing en vervolgens door kort centrifugeren. Laad hierna de reactiebuizen in een thermocycler. Stel het cDNA-syntheseprogramma in en voer het uit zoals beschreven in het tekstprotocol.

Haal eerst de nodige reagentia op en houd ze op ijs in een cleanroom tot ze klaar zijn voor gebruik. Als je klaar bent, ontdooi en draaikolken de reagentia. Bereid vervolgens 48 microliter van de eerste ronde PCR-mix voor elk monster in een 1,5 milliliter centrifugebuis zoals beschreven in tabel 2 van het tekstprotocol en verdeel het reactiemengsel in 0,2 milliliter PCR-buizen.

Voeg in een PCR-werkstation in een sjabloonruimte een twee microlitervoorbeeld van de cDNA toe aan de eerste ronde PCR-mix. Inclusief twee microliter van CVS11 cDNA als een positieve controle, en twee microliters van dubbel gedestilleerd water als een negatieve controle. Breng de verzegelde buizen vervolgens over naar een PCR-thermocycler en cyclus met behulp van de parameters in tabel 3 van het tekstprotocol.

Om te beginnen, bereid 48 microliter van tweede ronde PCR-mix voor elk monster in een 1,5 milliliter centrifuge buis zoals beschreven in tabel 4 van het tekstprotocol en verdeel de reactie mix in 0,2 milliliter PCR buizen. Voeg twee microliters van de eerste ronde PCR product in de tweede ronde PCR mix. Neem dubbel gedestilleerd water op als negatieve controle voor deze ronde van PCR.

Voer vervolgens PCR-thermocycling uit met behulp van de parameters in tabel 3 van het tekstprotocol. Voeg eerst 1,5 gram agarose toe aan 100 milliliter Tris-acetaat EDTA en verwarm het in een magnetron om het grondig op te lossen. Voeg vervolgens ethidiumbromide toe bij een uiteindelijke concentratie van 0,01%Giet de gel in de mal en laat deze minstens 30 minuten stollen bij omgevingstemperatuur.

Bereid de laadmonsters voor door vijf microliter van elk PCR-product te mengen met één microliter 6x laadbuffer. Laad de monsters en geschikte DNA-marker afzonderlijk in de putten en voer de gel ongeveer 30 tot 45 minuten op 120 volt totdat de kleurstoflijn is ongeveer 75 tot 80% van de gel. Wanneer de run is voltooid, schakelt u de stroom uit en koppelt u de elektroden los van de krachtbron.

Verwijder vervolgens voorzichtig de gel uit de geldoos. Gebruik een UV-gel documenteerapparaat om de DNA-fragmenten te visualiseren en te fotograferen. Karakteriseer de geneste reverse-transcriptie PCR zoals beschreven in het tekstprotocol.

De resultaten van een representatieve geneste RT-PCR om 18 Lyssavirus soorten te detecteren worden hier getoond. De PCR positieve controles tonen de verwachte band op 845 basisparen in de eerste ronde versterking en op 371 basisparen voor de tweede. Geen band wordt gezien voor de negatieve controles.

Alle 18 Lyssavirussen worden gezien om dezelfde twee banden als de positieve controle te produceren, wat aangeeft dat de geneste RT-PCR alle 18 Lyssavirussen heeft gedetecteerd. Terwijl 16 van de plasmiden hebben efficiënte versterking in twee rondes van PCR, twee van hen, Aravan virus en Ikoma virus, worden alleen versterkt in de eerste of tweede ronde, respectievelijk. De gevoeligheid van de methode varieert in de detectie van verschillende Lyssavirus plasmiden, van waarden variërend van 2,24 tot 2, 240 moleculen per microliter.

Deze verschillen kunnen worden toegeschreven aan de mismatches tussen de primers en sjablonen als gevolg van virale sequentie diversiteit. Een vergelijking van 9, 624 hersenweefsels van klinische monsters die worden getest door geneste PCR versus die getest met FAT blijkt dat geneste RT-PCR als een gevoeligheid van 100%en een specificiteit van 99,97%De overeenstemming tussen de twee methoden is 99,07%Tien andere rabiës laboratoria werden uitgenodigd om de test uit te voeren om verder te valideren van de geneste RT-PCR. Alle tien laboratoria verkregen geneste RT-PCR resultaten die 100% in overeenstemming met de FAT, zonder valse negatieven of false positives, wat aangeeft dat de geneste RT-PCR heeft een hoge specificiteit en reproduceerbaarheid.

RT-PCR wordt nu aanbevolen door OIE voor het gebruik van rabiës technologieën. En onze geneste RT-PCR is bewezen als de nationale standaard van rabiëstechnologieën in China in 2018.