CRISPR/Cas9 technologie in het herstellen van Dystrofine expressie in door iPSC afgeleide spier voorlopercellen

Duchenne is een spierdystrofie veroorzaakt voortijdige uitputten van spiervererver voorloper cellen. Het is een van de meest ernstige spierdystrofies. Om een functionele spierregeneratie te bevorderen, gebruiken we CRISPR/Cas9-gemedieerde genbewerking om dystrofineexpressie te herstellen in geïnduceerde pluripotente spiervererverstoorercellen.

De CRISPR-Cas9 genbewerking heeft het potentieel om dystrofisch genexpressie te herstellen. Autologe iPSC-afgeleide spiervererveroorzaker cellen kunnen de stamcel porie aanvullen, schade herstellen, en verdere complicaties in DMD voorkomen zonder een immuunrespons te veroorzaken. Verschillende agenten van iPS-cellen in myogene voorlopercellen verminderden het risico op tumorhersenen in iPS-cellen.

Verschillende therapieën die autologe Induced Pluripotent Stem Cell-afgeleide spiervererver voortlevercellen combineren met CRISPR-Cas9-gemedieerde genetische correctie beloven Duchenne Spierdystrofie behandeling strategieën. Deze technologie kan worden gebruikt om veel aangeboren ziekten te behandelen door het genetisch bewerken van autologe stamcellen, waaronder hart-, hersen- en bloedziekte. We toonden demonstratie van deze aanpak kan de lezers te voorzien van ervaring in de behandeling van cel herprogrammering en genbewerking, die blijft een uitdaging.

Onder een omgekeerde microscoop, onderzoeken de kolonies van geïnfecteerde muis embryonale stamcellen. Markeer de kolonies aan de onderkant van de schotel met de zelf-inktobject marker. Breng ingevette kloonringen aan om de gemarkeerde celkolonies te bedekken.

Voeg 100 microliters van 0,05% Trypsin-EDTA toe aan elke kloonring en plaats de plaat vijf minuten in een couveuse op 37 graden Celsius. Breng vervolgens de verteerde cellen met 100-microliter pipettips over naar 48-well kweekplaten met 250 milliliter MES-groeimedium. Incubeer de cellen in de 37 graden Celsius incubator met 5%kooldioxide en 85% vochtigheid.

Wanneer ze lezen 70%samenvloeiing, selecteert u de putten met goed gekweekte cellen en voeg 250 milliliter TVP-oplossing toe om gedurende 30 minuten te verteren. Breng vervolgens de celcultuur van elke put over naar een schaal van zes centimeter. Herhaal het aanbrengen van kloonringen en incubatie gedurende meerdere malen totdat uniforme, slaapzaalvormige klonen zijn verkregen.

Verteerbaar nu de voorbereide muis-iPSC's door een milliliter TVP-oplossing toe te voegen. Breng de celcultuur over in een 24-put plaat bekleed met Fibronectin en Gelatine en incubeer bij 37 graden Celsius met 5%Kooldioxide. Nadat de cellen 50% samenvloeiing hebben bereikt, schakelt u over op 500 microliter vers kweekmedium met acht microgram per milliliter Polybrene.

Voeg vervolgens 100 microliter van de lentivirale deeltjesoplossing toe aan de iPSC's van de muis. Incubeer de cellen gedurende drie dagen bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide. Bepaal vervolgens de minimale concentratie van Blasticidin en Hygromycine B, die binnen 24 uur met de helft van de dodensnelheid is.

Voeg de media van 2,5 microgram per milliliter Blasticidin en 100 microgram per milliliter Hygromycine B in de cellen, wacht drie dagen en selecteer de cellen die blijven hechten als stabling geïnfecteerde cellen. Verteren de geselecteerde muis iPSC's met 0,5 milliliter TVP-oplossing, elk goed in een nieuwe 24-put plaat, en incubaat cellen gedurende 30 minuten op 37 graden Celsius met 5%kooldioxide. Vervolgens u de iPSC's in enkele cellen pipetten en de cellen tellen met een celtelkamer.

Selecteer ongeveer 150 verteerde enkele cellen en verdun met MES medium in 10 centimeter schotel, cultuur op 37 graden Celsius met 5%Kooldioxide. Na ongeveer 10 dagen, onder een omgekeerde microscoop, gebruik 10 microliter steriele pipet tips om enkele kolonies te plukken en elke kolonie over te brengen in 50 microliters van TVP-oplossing in een 96-put plaat. Verteren op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten.

Betrouwbare handmatige klonen plukken is van cruciaal belang voor het succes van het oogsten van CRISPR / Cas9-bewerkte Induced Pluripotent Stamcellen. Breng de verteerde cellen vervolgens over en verdeel ze van elke put in nog eens twee 96-put kweekplaten. Incubeer bij 37 graden Celsius tot 70%confluent.

Met de celkolonies bij 70%-samenvloeiing, verwijder het medium in de 96-put plaat. Voeg 25 microliter Lysis reagens met 1%Proteinase K oplossing toe aan elke put en breng het lysaat over naar een andere PCR-plaat met 96-putten. Verzegel de PCR-plaat met kleefzegels en vouw de plaat in een thermisch cycler gedurende 30 minuten af bij 55 graden Celsius en vervolgens 45 minuten op 95 graden Celsius om de cellen te lyseen en de Proteinase K te denatureren. in een PCR-buis, voeg twee microliter van het lysaat, 10 microliter van 2x DNA Polymerase Premix, 7 microliter DNase-vrij water , en een microliter van DMD Exon23 primers.

Start de PCR-reactie volgens het manuscript. Laad vervolgens de PCR-reactie die wordt geleverd met 2,2 microliter laadbuffer op een 2%agarose gel. Laat de gel 30 minuten op 100 tot 150 volt draaien en inspecteer de gel onder UV-licht.

In dit protocol werden twee gids RNAs ontworpen die de mutant Exon23 flankeren. Na Cas9-gemedieerde dubbelstrengs pauzes en niet-homologe end-joining, mutant Exon23 werd geschrapt, waardoor afgekapte, maar functionele Dystrophin productie. Om te voorkomen dat de lekkage van Trypsin oplossing, moeten we vet gelijkmatig toe te passen op de bodem van de ringen.

De combinatie van CRISPR/Cas9 genoombewerking met een geplakt MyoD-activeringssysteem biedt een veilige, haalbare en effectieve strategie voor autologe transplantatie bij Duchenne Spierdystrofiepatiënten met gene recovery basale voorlopercellen.