Chirurgische grootte vermindering van zebravis voor de studie van het embryonale patroon schrapen

Hoewel schaalvergroting een van de universele en fundamentele kenmerken van ontwikkelingssystemen is, zijn de onderliggende mechanismen niet begrepen in veel organen en weefsels. De groottereductietechniek van zebravissen die in deze video wordt gepresenteerd, zal uw begrip van mechanismen die ten grondslag liggen aan dynamische schaalprocessen bevorderen. Voordelen van het werken met zebravissen zijn dat het gemakkelijk is om live beeldvorming, genetica en kwantitatieve analyse uit te voeren.

Onze techniek is ook zeer eenvoudig en gemakkelijk toe te passen zonder gespecialiseerde apparatuur of intensieve training. De gezondheid van embryo's is de sleutel tot succes met deze techniek. Gebruik jonge vis als ouders en wees voorzichtig om de schade te minimaliseren door het verwijderen van de chorions.

En ook spelen rond in de grootte van de wond op de dooier, en hoeveel cellen worden verwijderd. Aangezien de embryo's die we gebruiken erg jong en kwetsbaar zijn, moeten ze zeer zorgvuldig worden behandeld bij het overbrengen en hakken. Tegelijkertijd moet het snel zijn, zodat de procedure kan worden gedaan in het juiste moment venster van ontwikkeling.

Visuele demonstratie kan een goed gevoel geven van hoe kleinere embryo's effectief te produceren. Om een draadlus te maken voor embryohakken, voer je 20 centimeter lang stijf en niet-corrosieve roestvrijstalen draad door een glazen capillaire, waardoor een kleine, een millimeter lange lus aan de bovenkant wordt gemaakt. Plaats een druppeltje duidelijke nagellak op het puntje van de klasse capillaire, tussen de capillaire en de draad lus om het op zijn plaats te houden, zorg ervoor dat er geen nagellak op de lus gedeelte, omdat het kan beschadigen de embryo's.

En dan laat het drogen. Gebruik lab tape om de glazen capillaire hechten met de lus op een houten eetstokje, waardoor ongeveer twee en een halve centimeter van de glazen capillaire uit te breiden buiten de eetstok, zodat de eetstok deel van het gereedschap niet duik in het water later. In een 100 millimeter glazen petrischaal met een plastic spatel, verspreid ongeveer 0,5 milliliter van 2%methyl cellulose in de buurt van het midden van de bodem dun en gelijkmatig tot een dikte van ongeveer 0,5 millimeter.

Giet ongeveer 30 milliliter van een derde Ringer oplossing aan de zijkant van de schotel, en laat het te verspreiden op de rest van de schotel en bedek de methyl cellulose. Plaats eerder gedechorioneerde embryo's bij de 256-cel tot en met één K-celstadium op 2%methylcellulose, om ervoor te zorgen dat de embryo's op hun kant zijn gericht. Om blastula te hakken, gebruik de draadlus om in de buurt van de dierlijke pool te snijden, loodrecht op de dierlijke plantaardige as en ongeveer 30 tot 40% van de blastodermcellen af te hakken.

Tik vervolgens voorzichtig op de uiteinden samen om de resterende cellen te helpen terug te steken. Voor dooier, gebruik maken van de gemonteerde draad om een kleine wond in de buurt van de plantaardige pool te maken door nicking het eimembraan, waardoor de dooier te sijpelen uit voor een paar minuten, en dan genezen. Wanneer de dooier stopt met uitsijpelen, gebruik dan een pipet om het embryo buiten de methylcellulose in dezelfde schotel te verplaatsen voor herstel.

Herhaal blastula en dooier hakken voor alle embryo's, en laat de schotel ongestoord gedurende 30 minuten, terwijl de embryo's herstellen. Gebruik vervolgens een glazen pipet om de embryo's over te brengen naar de eerder bereide 35 millimeter glazen schotel met verse oplossing van een derde Ringer en plaats ze in een couveuse van 28,5 graden Celsius om volledig herstel mogelijk te maken voordat u verdergaat met de beeldvorming. Na het uitvoeren van twee stappen hakken met blastula en dooier, embryo's toonde schijnbaar normale algemene morfologie gedurende de ontwikkelingsstadia in vergelijking met de controle embryo's, andere dan grootte verschil.

Aan de andere kant vertoonden gehakte embryo's met blastula's een eigenaardige morfologie, vooral in eerdere stadia. Tijdens het epiboly, de embryo's had een vernauwde en ingesprongen verschijning. In de volgende somite fase, midline structuren bleken te worden afgevlakt op vele axiale niveaus.

In latere stadia vertoonden de lichaamsstructuren naast de dooier, zoals het midden en achterbrein, nog steeds een relatief afgeplatte vorm, mogelijk door verhoogde spanning van de relatief grotere dooier. Time lapse beeldvorming van somite formatie toonde aan dat in zowel de controle en gehakte embryo's, de grootte van somites die werden gevormd in latere stadia waren kleiner in vergelijking met die uit eerdere stadia. Ook hadden gehakte embryo's gedurende de somietvormingsstadia kleinere somites dan die in controleembryo's.

Toen de twee stappen hakken techniek werd uitgevoerd op membraan mCherry geïnjecteerd embryo's, beeldvorming van hun ruggenmerg op 20 uur na de bevruchting toonde vermindering van neurale buis hoogten als gevolg van grootte vermindering. Twee stappen hakken is zeer belangrijk om kleinere, maar anders normale embryo's met een hoge efficiëntie te verkrijgen. Het is belangrijk om te onthouden niet om de dooier te hakken tijdens het afhakken van cellen uit de blastula.

Voor dooier, maak een kleine verwonden op het voor de inhoud uit te sijpelen. En het dooiermembraan geneest van nature in de juiste buffer. Omdat de gehakte embryo's snel kunnen worden teruggewonnen, kunnen alle methoden of analyses worden toegepast op normale embryo's volgens de groottereductiemethode.

De eenvoud en veelzijdigheid van deze techniek is zeer krachtig als iedereen zou kunnen introduceren deze techniek om schaalvergroting probleem in elk weefsel of orgaan in zebravissen te bestuderen. Wij geloven dat onderzoekers met deze techniek schaalproblemen kunnen aanpakken in verschillende systemen die eerder onaangeroerd zijn geweest. We hebben al belangrijke ontdekkingen gedaan in het schalen van somite en neurale buispatronen.