Name: Patroon-geactiveerde oxidatieve burst en zaailing groeiremming assays in Arabidopsis thaliana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 11 s
Description: Leer de oxidatieve burst- en zaailinggroei-remmingstests voor plantenimmunologie met Arabidopsis thaliana. Deze snelle, betrouwbare methoden gebruiken standaard laboratoriumapparatuur om afweerreacties te kwantificeren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk in ons lab wordt gefinancierd door de Natural Resources and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Program, de Canadian Foundation for Innovation John R. Evans Leader ' Fund en Queen's University. KS en wordt ondersteund door tandem Ontario Graduate beurzen en NSERC Canada Graduate beurzen voor master's Students (CGS-M).

1. detectie van ROS burst in Arabidopsis Leaf discs na immuun elicitatie
<ol><li>Plantengroei en-onderhoud.<ol>
<li>Voor het synchroniseren van de kiemkracht, van Arabidopsis zaden door ongeveer 50 zaden op te schorten in 1 ml steriele 0,1% agar [w/v] en op te slaan bij 4 °c (geen licht) gedurende 3-4 dagen. Opmerking: Stratify een wild type achtergrond besturingselement (bijvoorbeeld, Col-0) en genotypen met hoge en lage immuunoutputs (bijvoorbeeld cpk28-1 en bak1-5, respectievelijk) om te dienen als interne controles.</li>
		<li>Zaaizaden op de bodem en ontkieren onder standaard kortdurende condities (22 °C, 10 uur licht, 150 mE/m2/s lichtintensiteit en 65-70% relatieve vochtigheid).</li>
		<li>Na ongeveer 7 dagen, gebruik de tang om individuele zaailingen te transplantaties naar nieuwe potten, gescheiden door ten minste 4 cm om volledige rozet ontwikkeling toe te staan. Transplantatie 6-12 zaailingen per genotype en terug naar standaard kortdurende condities. Regelmatig water en bevruchten planten (1 g/L van 20-20-20 meststof elke 2 weken).</li>
	</ol></li>
	<li>Verzamel blad schijven in 96-well platen voor 's nachts herstel.<ol>
<li>Bij 4-5 weken na het ontkiemen (Figuur 1a), gebruik een scherpe 4 mm biopsie punch om één bladschijf per plant te verwijderen, de middenader te vermijden en voorzichtig te zijn om verwonden te beperken (Figuur 1b). Plaats blad schijven in een ongebruikte 96-well luminometer plaat met 100 μL ddH2O met de adaxial zijde naar boven om uitdroging te voorkomen22 (figuur 1c). Als u meerdere ontlokken beoordeelt, verwijder dan 1 bladschijf uit hetzelfde blad voor elke elicitor-behandeling. Opmerking: monster bladeren die volledig zijn uitgevouwen, derde tot vijfde vanaf de bovenkant van de rozet, en ongeveer dezelfde grootte en leeftijd om de variabiliteit te beperken. Indien mogelijk, snijd blad schijven in tweeën met behulp van een scheermesje voorafgaand aan de nachtelijke terugwinning, omdat dit het oppervlak dat wordt blootgesteld aan de elicitor Solution23verhoogt.</li>
		<li>Herstel 's nachts op kamertemperatuur om de interferentie van Ros geproduceerd door verwonden tijdens Leaf disc collectie te voorkomen. Afdekplaten met deksel om verdamping te voorkomen.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer de elicitor-behandeling uit en meet de ROS-productie.<ol>
<li>Program meer de plaat lezer voorafgaand aan het toevoegen van de reactie oplossing, omdat dit de tijd tussen de ROS burst initiatie en de eerste metingen zal verkorten. Gebruik een commerciële software die geschikt is voor de plaat lezer. Klik in ons geval (Zie Inhoudsopgave) op instellingenen selecteer de LUM96 cartridge en het kinetische Lees type. Klik op de categorie leesgebied en sleep om een subset van putjes of de gehele te lezen plaat te selecteren. Stel onder het tabblad Pmt en optica de integratie tijd in op 1.000 MS. Stel onder het tabblad timing de totale uitvoeringstijd in op 40-60 min en het interval op 2 min.</li>
		<li>Verwijder water uit elke put met behulp van een meerkanaals pipet. Opmerking: Steek geen blad schijven, omdat dit kan leiden tot verwde stress en resulteren in meer variabele ROS-uitgangen.</li>
		<li>Bereid een reactie oplossing met 100 μM Luminol, 10 μg/mL HRP en de gewenste concentratie van elicitor (bijvoorbeeld: elf18 bij 1 nM, 10 nM, 100 nM of 1.000 nM) in steriele ddH2O met 10 ml oplossing voor 1 96-goed plaat. NB: Los gevriesdroogde peptiden op in steriele H2O in laagbindende buizen om een kolf van 10 mm te maken, in vloeistof N2te bevriezen en op-80 °c te bewaren. Als u klaar bent voor gebruik, Verdun u de voorraden in steriele H2O om een 100 μM werkende voorraad te genereren en bij-20 °c op te slaan.</li>
		<li>Gebruik een meerkanaals pipet om 100 μL van het reactiemengsel aan elk goed te doseren, waarbij de oplossing tegelijkertijd wordt toegevoegd aan alle blad schijven van dezelfde behandeling22. Neem een controle reactie (geen elicitor) voor elk genotype op om basale ROS-niveaus te beoordelen bij afwezigheid van uitlokken. Meet onmiddellijk de licht emissie voor alle golflengten in het zichtbare spectrum met behulp van een microplaat lezer. Opmerking: bereid de reactie oplossing voor en pas deze toe bij weinig licht, aangezien Luminol en HRP lichtgevoelige reagentia zijn. Bewaar reagentia op ijs of bij-20 °C, tenzij in gebruik.</li>
		<li>Meet de licht emissie met een 1.000 MS integratie tijd in 2 min intervallen gedurende een periode van 40-60 minuten in een microplaat lezer om de dynamische oxidatieve burst vast te leggen (figuur 1d). Opmerking: gebruik een langere integratie tijd om de gevoeligheid van de assay11te verbeteren, terwijl u ervoor zorgt dat alle monsters in een 96-put-plaat binnen één interval kunnen worden gemeten.</li>
	</ol></li>
	<li>Interpretatie van gegevens.<ol>
<li>Gebruik voor elk genotype een spreadsheettoepassing om het gemiddelde aantal fotonen en de standaardfout op elk tijdstip te berekenen en ROS-productie weer te geven als functie van de tijd met behulp van een spreidingsdiagram. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59437/59437eq1.jpg"> Waarbij t = elk tijdpunt
</li>
		<li>U ook het aantal fotonen voor elke bladschijf optellen en het gemiddelde van deze waarden voor elk genotype presenteren met behulp van een staafdiagram met standaardfout balken of een doos en whisker-plot. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59437/59437eq2.jpg">
</li>
	</ol></li>
</ol>2. inhibitie van kiem groei
<ol><li>Steriliseren zaden en zaaien op Murashige en Skoog (MS) platen.<ol>
<li>Bereid steriele halfsterkte (0,5 x) MS medium (2,16 g/L) met 0,8% agar [w/v]. Giet de media in platen (90 x 15 mm) in een laminaire stroom afzuigkap.</li>
		<li>Steriliseren ongeveer 100 zaden in een microcentrifuge buis door te wassen met 1 mL 70% ethanol gedurende 2 min en verwijderen door aspiratie. Voeg 1 mL 40% bleekwater toe en steen 17 minuten zachtjes op kamertemperatuur. Verwijder bleekmiddel door aspiratie en was drie keer in 1 mL steriel water gedurende 5 minuten. Respenderen in 1 mL steriele 0,1% agar. Opmerking: u ook een chloor gaszaad sterilisatie protocol24gebruiken.</li>
		<li>Zaai ongeveer 100 zaden per genotype op MS agar-platen met behulp van een pipet en afdichting met microporie tape in een laminaire stroom afzuigkap. Opmerking: Vermijd het plaatsen van zaden in de nabijheid, omdat dit het verplanten van zaailingen later moeilijk zal maken.</li>
		<li>Stratify zaden door platen te plaatsen bij 4 °C (geen licht) gedurende 3-4 dagen om de kiemkracht te synchroniseren (Figuur 2a).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transplantatie zaailingen in 48-goed platen met immuun elicitor peptiden.<ol>
<li>Na stratificatie, verplaats platen naar licht onder korte dagcondities (22 °C, 10 uur licht, 150 mE/m2/s lichtintensiteit en 65-70% relatieve vochtigheid) gedurende 3-4 dagen om kieming mogelijk te maken.</li>
		<li>Bereid in een laminaire stroom afzuigkap de ontvloeiingen van de elicitor peptide (0 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM en 1.000 nM) in steriele 0,5 x MS vloeibare media met 1% sucrose [w/v], met 25 mL MS voor elke 48-goed plaat. Bereid de platen voor door pipetteren van 500 μL MS vloeibaar medium of MS medium dat peptiden per put bevat. Gebruik, indien beschikbaar, een herhaalde pipet voorplaat voorbereiding om het proces te versnellen. Let op: voor elk genotype groeien zaailingen in MS zonder elicitor om rekening te kunnen maken met eventuele inherente verschillen in zaailing groei.</li>
		<li>Gebruik de steriele Tang zorgvuldig om een zaailing te transplanteren naar elk goed van dezelfde grootte en leeftijd, zodat er geen schade aan de zaailing of breuk aan de wortel wordt toegebracht en de wortel in de media wordt ondergedompeld. Voor elk genotype wordt ten minste 6-8 zaailingen in elke peptide verdunning (Figuur 2b) getransplanteerd. Let op: transplantatie zaailingen op 4 dagen na kieming, als korte wortels zijn gemakkelijker te manipuleren, en oudere zaailingen kunnen minder optimale resultaten opleveren.</li>
		<li>Afdichtings platen met microporie tape en ga terug naar het licht onder standaard kortdurende condities (22 °C, 10 uur licht, 150 mE/m2/s lichtintensiteit en 65-70% relatieve vochtigheid). Laat zaailingen groeien voor 8-12 dagen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Percentage groeiremming bepalen.<ol>
<li>Verwijder de zaailingen voorzichtig van 48-well Plates en droog door te deppen op een papieren handdoek. Weeg zaailingen op een analytische schaal en noteer waarden. Gebruik, indien beschikbaar, een analytische schaal die is uitgerust met een USB-uitgang om nieuwe gewichtswaarden op te nemen in een spreadsheet. Voordat u zaailingen gaat wegen, moet u een foto maken om de remming van de groei visueel weer te geven (figuur 2c).</li>
		<li>Bepaal als volgt percentage groeiremming van met ontlokken behandelde zaailingen in vergelijking met uitsluitend in MS gekweekte zaailingen (figuur 2D): <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59437/59437eq3.jpg">
</li>
		<li>Plot gegevens met behulp van een staafdiagram met standaardfout balken of met behulp van een doos en whisker-plot om de Inter-experimentele variantie beter weer te geven.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Dit artikel beschrijft twee methoden voor het aszeggen van patroon-geactiveerde immuunresponsen in Arabidopsis, het aanbieden van kwantitatieve benaderingen voor het evalueren van immune output zonder het gebruik van gespecialiseerde apparatuur. In combinatie, patroon-geactiveerde ROS en SGI kunnen worden gebruikt voor het beoordelen van vroege en late reacties op microbe perceptie, respectievelijk.
De belangrijkste beperking van de oxidatieve burst-assay is variabiliteit. Om redenen ...

Om te waarnemen en te verdedigen tegen pathogenen, planten hebben geëvolueerd membraan-gebonden patroon erkenning receptoren (PRRs) dat geconmaald microbiële moleculen buiten de cel bekend als microbe-geassocieerde moleculaire patronen (MAMPs)1detecteren. De binding van mamps aan hun verwant PRRS initieert eiwit kinase-gemedieerde immuun signalering resulterend in breedspectrum ziekte resistentie2. Een van de vroegste reacties na activering van PRR is de fosforylering en activering van integraal plasma membraan respiratoire BURST OXIDASE HOMOLOG (RBOH) eiwitten die de productie van extracellulaire reactieve zuurstof soorten (ROS) katalyseren3 , 4. Ros spelen een belangrijke rol bij het vaststellen van de ziekte resistentie, fungeert als secundaire boodschappers te propageren immuun signalering evenals directe antimicrobiële middelen5. De eerste observatie van een immuun-opgewekt oxidatieve uitbarsting werd beschreven met behulp van aardappelknollen van CV. Rishiri na Phytophthora infestans inoculatie6. ROS productie is geëvalueerd in verschillende plantensoorten met behulp van Leaf discs7, cel suspensie culturen8, en protoplasten6. Hier beschreven is een eenvoudige methode voor het aszeggen van patroon-geactiveerde ROS productie in blad schijven van Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).
Als reactie op MAMP-waarneming katalyseert de geactiveerde rboh-eiwitten de productie van superoxide-radicalen (O2-), hydroxylradicalen (• Oh) en singlet-zuurstof (1O2) die worden omgezet in waterstofperoxide (H2O 2) in de extracellulaire ruimte9. H2O2 kan worden gekwantificeerd met chemiluminescentie op basis van Luminol in aanwezigheid van de oxiderende agent mierikswortelperoxidase (HRP)10. HRP oxiseert H2O2 en genereert een HYDROXIDE-Ion (Oh−) en zuurstof gas (O2) dat reageert met Luminol om een instabiel intermediair te produceren dat een foon van licht10vrijgeeft. De emissie van photon kan worden gekwantificeerd als relatieve licht eenheden (RLUs) met behulp van een microplaat lezer of Imager die luminescentie detecteert, die standaard uitrustingsstukken zijn geworden in de meeste moleculaire laboratoria. Door het meten van het licht dat wordt geproduceerd over een interval van 40-60 minuten, kan een voorbijgaande oxidatieve uitbarsting al 2-5 minuten na de behandeling van de elicitor worden gedetecteerd, een piek van 10-20 minuten en terugkeren naar de basale niveaus na ~ 60 minuten11. Het cumulatieve licht dat over deze tijdsduur wordt geproduceerd, kan worden gebruikt als een maatstaf voor de immuunsterkte die overeenkomt met de activering van RBOH-eiwitten12. Handig is deze bepaling niet vereist gespecialiseerde apparatuur of omslachtige monstervoorbereiding.
Peaking kort na MAMP detectie, de oxidatieve uitbarsting wordt beschouwd als een vroege immuunrespons, samen met MAPK activering en ethyleenproductie5. Latere immuunresponsen omvatten transcriptionele herprogrammering, stomatale afsluiting en callose afzetting2,5. Langdurige blootstelling aan MAMPs activeert voortdurend energetisch-kostbare immuunsigna lering, resulterend in remming van de plantengroei, indicatief voor een trade-off tussen ontwikkeling en immuniteit13. Patroon-geactiveerde zaailing groeiremming (SGI) wordt veel gebruikt om de immuunoutput in Arabidopsis te beoordelen en is integraal onderdeel geweest van de identificatie van verschillende belangrijke componenten van immuunsigna lering, waaronder PRRS14,15 ,16. Daarom presenteert dit papier ook een test voor het patroon getriggerd SGI in Arabidopsis, waarbij zaailingen worden geteeld in multi-well platen met standaard media of media aangevuld met een immuunloïde gedurende 8-12 dagen en vervolgens gewogen met behulp van een analytische schaal.
Om aan te tonen hoe Ros en SGI assays kunnen worden gebruikt om PRR-gemedieerde signalering te bewaken, zijn drie genotypen gekozen die verschillende immuunoutputs vertegenwoordigen: (1) het wild type Arabidopsis toetredings Columbia (Col-0), (2) de dominante-negatieve bak1-5 Mutant waarin de multi-functionele PRR co-receptor brassinosteroid ongevoelig 1-geassocieerde KINASE 1 (BAK1) is niet-functioneel in immuun signalering17,18, en (3) het recessieve cpk28-1 Mutant, die mist de regulerend eiwit calcium-afhankelijke proteïne KINASE 28 (CPK28) en vertoont verhoogde immuungeactiveerde responsen19,20. Ros en SGI assays worden gepresenteerd in reactie op een synthetisch geproduceerde elf18 peptide epitoop van bacteriële rek factor TU (EF-TU), erkend in Arabidopsis door de PRR EF-TU receptor (EFR)15. Deze protocollen kunnen worden gebruikt met andere immuun uitlokken, zoals de bacteriële motiliteit proteïne flagellin14 of endogene plant lokaas eiwitten (AtPeps)16, echter, opgemerkt moet worden dat de reactie van de plant verschilt afhankelijk van de elicitor21. Samen kunnen ROS en SGI assays worden gebruikt voor de snelle en kwantitatieve beoordeling van vroegtijdige en late PRR-gemedieerde reacties.

<table><tbody><tr><td>20-20-20 Meststof</td><td>Plant Prod</td><td>10529</td><td>Meng 1 g/L in water en breng het elke 2 weken aan op planten voor optimale groei.</td></tr><tr><td>4 mm Biopsie Punch</td><td>Medical Mart</td><td>232-33-34-P</td><td>Een kurkboorset met een oppervlakte van 0,125 cm^2 kan ook worden gebruikt.</td></tr><tr><td>48-Well Steriele Platen met Deksel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3548</td><td></td></tr><tr><td>Analytische Weegschaal met Draft Sheid</td><td>VWR</td><td>VWR-225AC</td><td>Elke standaard analytische weegschaal kan worden gebruikt voor groeiremmingstests, maar een directe computeruitvoer is optimaal.</td></tr><tr><td>BioHit mLine Mechanische 12 Multikanaals Pipet (30-300 uL)</td><td>Sartorius</td><td>725240</td><td>Elke multikanaals pipet kan worden gebruikt, evenals een enkele pipetteerder indien nodig.</td></tr><tr><td>elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)</td><td>EZ Biolab</td><td>cp7211</td><td>Bewaar 10 mM stockpeptide bij -80C in buisjes met lage eiwitbinding. Na ontdooien, bewaar 100 uM werkstock bij -20C.</td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Horseradish Peroxidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6782</td><td>Oplossen in zuiver water. Bewaren bij -20C en uit de buurt van licht.</td></tr><tr><td>Luminol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8511</td><td>Oplossen in DMSO. Bewaren bij -20C en uit de buurt van licht.</td></tr><tr><td>Murisage en Skoog Basale Zouten</td><td>Cedarlane Labs</td><td>MSP09-100LT</td><td>Bewaren bij 4C.</td></tr><tr><td>Grond</td><td>SunGrow Horticulture</td><td>Sunshine Mix #1</td><td>Andere grondsoorten kunnen ook worden gebruikt om Arabidopsis te kweken. Meng met water bij het vullen van potten.</td></tr><tr><td>SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader met LUM Module</td><td>Molecular Devices</td><td>Moet een offerte aanvragen</td><td>Elke plate reader die luminescentie kan detecteren, kan worden gebruikt voor deze tests.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389-1KG</td><td>Bewaren bij kamertemperatuur.</td></tr><tr><td>Witte Polystyreen 96-Well Platen</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-589</td><td></td></tr></tbody></table>

patroon-geactiveerde oxidatieve burst en zaailing groeiremming assays in arabidopsis thaliana

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Planten hebben een robuust immuunsysteem ontwikkeld om pathogenen te zien en te beschermen tegen ziekte. Dit artikel beschrijft twee testen die kunnen worden gebruikt voor het meten van de sterkte van de immuunactivering in Arabidopsis thaliana na behandeling met elicitor moleculen. Gepresenteerd eerst is een methode voor het vastleggen van de snel geïnduceerde en dynamische oxidatieve burst, die kan worden bewaakt met behulp van een Luminol gebaseerde assay. De tweede is een methode die beschrijft hoe de door immuungeïnduceerde remming van zaailing te meten. Deze protocollen zijn snel en betrouwbaar, vereisen geen gespecialiseerde training of apparatuur, en worden op grote schaal gebruikt om de genetische basis van de immuniteit van de plant te begrijpen.

Mutant cpk28-119,25 en bak1-517,18 planten werden gebruikt om de verwachte resultaten voor genotypen met hoge en lage immuunresponsen aan te tonen, respectievelijk in oxidatieve burst en SGI assays ten opzichte van een wild-type achtergrond besturingselement (Col-0). Om de dosisafhankelijke effecten te beoordelen, werd een 10-voudige peptide verdunningsre...

Dit artikel beschrijft twee methoden voor het kwantificeren van verdediging reacties in Arabidopsis thaliana na blootstelling aan immuun uitlokken: de voorbijgaande oxidatieve uitbarsting, en de remming van zaailing groei.

Patroon-geactiveerde oxidatieve burst en zaailing groeiremming assays in Arabidopsis thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

Deze testen kunnen worden gebruikt om immuunproducties van verschillende plantengenotypes te beoordelen en te vergelijken. Het belangrijkste voordeel van deze technieken is dat ze snel, betrouwbaar en gebruik maken van gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur. Voor de groeiremmingstest moeten zaailingen van dezelfde grootte en leeftijd worden getransplanteerd en volledig droog worden geblurd alvorens te wegen om variatie te beperken.Gebruik na vier tot vijf weken na de ontkieming een scherpe biopsiepunch van vier millimeter om één bladschijf per Arabidopsis-plant te verwijderen, de midveïne te vermijden en voorzichtig te zijn om het wond te beperken. Verzamel de schijven in individuele putten van een ongebruikte 96-well luminometerplaat met 100 microliters dubbel gedestilleerd water per put, adaxiale zijde omhoog, om uitdroging te voorkomen. Bij de beoordeling van meerdere ontlokkenden, verwijder een tweede blad schijf uit hetzelfde blad voor elke elicitor behandeling, en bedek de plaat met het deksel om de bladschijven te herstellen 's nachts bij kamertemperatuur.De volgende ochtend stelt u de microplatelezerparameters in op een integratietijd van 1,000 milliseconden in intervallen van twee minuten over een periode van 40 tot 60 minuten om de dynamische oxidatieve uitbarsting vast te leggen. Gebruik vervolgens een multi-channel pipet om het water in elke put te vervangen door 100 microliters van vers bereide reactieoplossing, inclusief een controle, geen elicitorreactie voor elk genotype om de basale reactie zuurstofsoorten niveaus te beoordelen in afwezigheid van elicitatie. Meet vervolgens onmiddellijk de lichtemissie voor alle golflengten in het zichtbare spectrum op de microplatelezer.Laad na vier dagen na de ontkieming elke put van een 48-putplaat met 500 microliter ms-medium aangevuld met een verdunning van elicitor peptide. Gebruik vervolgens steriele tangen om zes tot acht zaailingen van dezelfde grootte, leeftijd en genotype zorgvuldig te transplanteren aan elke peptideverdunning, waarbij u ervoor zorgt dat er geen schade is aan de zaailing of breuk aan de wortel en dat de wortel onder water wordt gezet in medium. Wanneer alle zaailingen zijn verguld, verzegel de platen met Micropore tape en plaats de planten gedurende acht tot twaalf dagen onder standaard korte dagen.Om de procentuele groeiremming te bepalen, neem een foto om de groeiremming visueel vast te leggen voordat u de zaailingen zorgvuldig uit elke put verwijdert. Dep vervolgens de wortels op een papieren handdoek om te drogen en weeg elke zaailing op een analytische schaal. In dit representatieve experiment toonden gemuteerde planten met hyperactieve immuunsignalering een hogere cumulatieve en gemiddelde oxidatieve uitbarsting aan in vergelijking met arabische idopsisplanten van het wilde type, terwijl gemuteerde planten met een verminderde immuunsignalering een verminderde oxidatieve uitbarsting vertoonden bij concentraties tussen 10 en 1.000 nanomolar.Verwachte verschillen in zaailing groeiremming kan ook worden onderscheiden tussen alle genotypen geteeld in 100 en 1, 000 nanomolar elicitair peptide concentraties. Wanneer geteeld in de 1,000 nanomolar peptide verdunning, de mutanten met hyperactieve immuunsignalering waren aanzienlijk kleiner dan wilde planten geteeld onder dezelfde omstandigheden, terwijl de mutanten met verminderde immuun signalering vertoonde een zwakke remming van de groei ten opzichte van wilde planten. Deze methoden leveren bewijs voor vroege en late immuunreacties.Verschillende andere technieken, waaronder MAP kinase tests, pathogen-geïnduceerde genexpressie, en infectie testen, kan worden gebruikt om deze trajecten af te bakenen. Deze technieken zijn aangepast voor gebruik in grootschalige schermen, die met succes pathogene receptor eiwitten en verschillende andere signalering componenten hebben geïdentificeerd.

pattern-triggered-oxidative-burst-seedling-growth-inhibition-assays

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een cel dood-gebaseerde test voor het PTI in Nicotiana benthamiana planten is beschreven.

Test voor Pathogeen-geassocieerde Moleculaire Pattern (PAMP)-Triggered Immuniteit (PTI) in Planten

Een fundamentele zoektocht in de celbiologie is het definiëren van de mechanismen die de identiteit van de organellen die eukaryotische cellen te maken ten grondslag liggen. Hier stellen we een methode om de genen die verantwoordelijk zijn voor de morfologische en functionele integriteit van plantaardige organellen met behulp van fluorescentie microscopie en next-generation sequencing tools te identificeren.

Fluorescentie-microscopie Screening en next-generation sequencing: Handige hulpmiddelen voor de identificatie van genen betrokken bij organel Integriteit

Source: Liu, X., et al. Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method to assess the bacterial load in Arabidopsis thaliana leaves infected with Pseudomonas syringae. Leaf discs from infected leaves are homogenized, serially diluted, and plated onto nutrient-rich agar to promote bacterial colony formation. Colony counts are then used to...

Assessing Pseudomonas syringae Infection Load in Arabidopsis thaliana Leaves

This video demonstrates an assay to measure oxidative burst in Arabidopsis leaves upon immune elicitation. Leaf discs, cut from plant leaves, are incubated with bacterial peptides functioning as microbe-associated molecular patterns or MAMPs. Upon detection of the MAMPs, plant cells induce the production of extracellular ROS, which is detected using a chemiluminescence assay.

An Assay to Detect Oxidative Burst in Arabidopsis Leaf Discs upon Immune Elicitation

This video demonstrates the seedling growth inhibition assay in the Arabidopsis thaliana plant. The impact of increased concentration of immune peptide elicitor on seedling growth is determined.

Measuring Immune-Induced Inhibition of Seedling Growth

Kwantificering van ziekteverwekkergroei is een krachtig hulpmiddel om verschillende Arabidopsis thaliana (hierna: Arabidopsis) immuunresponsen te karakteriseren. De hier beschreven methode presenteert een geoptimaliseerde spuitinfiltratie-assay om de groei van Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 in volwassen Arabidopsis-bladeren te kwantificeren.

Bacteriële Leaf Infiltratie Assay voor Beeldende karakterisatie van Plant Defense Reacties met behulp van de<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

Het doel van deze studie was om te bepalen van de effecten van bleekmiddel en chloor gas sterilisatie op kiemkracht van zaad van een bereik van Arabidopsis genotypen geteeld op steriele media. Geoptimaliseerde sterilisatie protocollen zijn ontwikkeld om te voorkomen dat de groei van microbiële verontreinigingen terwijl het verstrekken van bevredigende zaad overleven.

Gestandaardiseerde methode voor High-throughput sterilisatie van Arabidopsis zaden

Een high-throughput protocol voor de oppervlaktesterilisatie van Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) zaden wordt geleverd, waarbij de vloeistofbehandelingsstappen worden geoptimaliseerd met een eenvoudig zuigapparaat dat is gebouwd met een vacuümpomp. Honderden zaadmonsters kunnen op één dag aan de oppervlakte worden gesteriliseerd.

High-throughput, robuuste en zeer tijdflexibele methode voor oppervlaktesterilisatie van Arabidopsis-zaden

Hier beschrijven we een geavanceerd hulpmiddel dat is ontworpen voor het monitoren van de biosynthese van chlorofyl tijdens de vroege stadia van de de-etiolatie van Arabidopsis-zaailingen . De nieuwe methodologie biedt niet-invasieve real-time chlorofylfluorescentiebeeldvorming met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie.

Niet-invasieve test voor bepaling van de kinetiek van chlorofylbiosynthese tijdens vroege stadia van de-etiolatie van Arabidopsis

Hier presenteren we een eenvoudige methode voor directe observatie en geautomatiseerde meting van stomatale reacties op bacteriële invasie in Arabidopsis thaliana. Deze methode maakt gebruik van een draagbaar stomatale beeldvormingsapparaat, samen met een beeldanalysepijplijn die is ontworpen voor bladbeelden die door het apparaat zijn vastgelegd.

Directe observatie en geautomatiseerde meting van stomatale responsen op Pseudomonas syringae pv. tomaat DC3000 in Arabidopsis thaliana

Dit protocol beschrijft een high-throughput benadering voor het evalueren van plantionenlekkage, peroxidaseactiviteit en calloseproductie in hetzelfde monster.

Evaluatie van bladreacties op microbiële secundaire metabolieten met behulp van een high-throughput formaat

Leer de oxidatieve burst- en zaailinggroei-remmingstests voor plantenimmunologie met Arabidopsis thaliana. Deze snelle, betrouwbare methoden gebruiken standaard laboratoriumapparatuur om afweerreacties te kwantificeren.

Patroon-geactiveerde oxidatieve burst en zaailing groeiremming assays in Arabidopsis thaliana

Meer video's verkennen