Name: Robuuste vergelijking van eiwitniveaus over weefsels en in de gehele ontwikkeling met behulp van gestandaardiseerde kwantitatieve westelijke bevlekken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Leer gestandaardiseerde kwantitatieve western blotting voor betrouwbare eiwitexpressie-analyse in verschillende weefsels en ontwikkelingsstadia. Deze methode verbetert de reproduceerbaarheid van fundamenteel en klinisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

E.J.N.G. wordt ondersteund door de Wellcome Trust (grant 106098/Z/14/Z). Andere financiering is verstrekt door de SMA Trust (SMA UK Consortium; T.H.G. & Y-T. H.), SMA Europa (T.H.G, D.v.D.H. & E.J.N.G.), de Universiteit van Edinburgh DTP in precisie geneeskunde (T.H.G., L.L. & A.M.M.) en het Euan MacDonald-centrum voor Motor Neurone Disease Research (T.H.G).

Weefsels voor deze procedure werden verkregen uit dierlijke studies die werden goedgekeurd door het Comité van interne ethiek aan de Universiteit van Edinburgh en werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele en UK Home Office verordeningen onder het gezag van relevante persoonlijke en project licenties.
Opmerking: Dit protocol is geoptimaliseerd met behulp van gestandaardiseerde, commercieel beschikbare kits en reagentia teneinde reproduceerbaarheid (Zie Tabel van materialen).
1. bereiding van de monsters
<ol><li>
Eiwit extractie
	<ol>
<li>Overdracht module-bevroren cel of weefselmonsters van-80 ° C op droog ijs, ontdooien op ijs, en wassen zoals vereist met ijs koud 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (voor meer informatie over weefsels en PBS wast, Zie tabel 1). Vermijd geen onnodige bevriezen-ontdooien cycli als dit zal invloed hebben op eiwit kwaliteit.</li>
		<li>Toevoegen van radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer (25 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% natrium deoxycholate, 0,1% SDS) met 1 x proteaseinhibitor aan elk monster, met behulp van de optimale bedrag per weefsel gewicht (Zie tabel 1 voor aanbevelingen). Opmerking: Afhankelijk van de toepassing, de aard en hoeveelheid van homogenisering buffer wellicht verdere optimalisatie.</li>
		<li>Gebruik een hand-held elektrische homogenizer met een polypropyleen stamper om te homogeniseren weefselmonsters. Tussen elk monster, de stamper in tweemaal gedestilleerd water wassen en drogen met een schone tissue. Het wijzigen van de stamper tussen verschillende experimentele omstandigheden en weefsels.</li>
		<li>Laat de monsters op het ijs gedurende 10 minuten na homogenisatie. Centrifugeer de monsters op > 10.000 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Overbrengen in het supernatant een nieuwe buis op ijs zonder de pellet te verstoren. De bovendrijvende substantie is de eiwitSteekproef. Winkel de uitgepakte eiwit bij-80 ° C of direct overgaan tot het meten van de eiwitconcentratie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kwantificering en normalisering van de eiwitconcentratie
	<ol>
<li>Meet de eiwitconcentratie met behulp van een bicinchoninic zuur (BCA) test. Een mix van BCA assay volgens de instructies van de fabrikant in een 96-Wells optische plaat met behulp van 200 µL van BCA mix per goed voor te bereiden. Opmerking: Andere methoden zoals Lowry en Bradford testen een kwantificering kunnen ook worden gebruikt om te bepalen van de eiwitconcentratie, zolang de eiwitconcentratie is gekwantificeerd consequent over experimenten.</li>
		<li>Bereiden bovien serumalbumine (BSA) normen op toenemende concentraties in drievoud en voeg 1 µL van elke eiwitSteekproef in tweevoud. Incubeer de 96-wells-plaat in een voorverwarmde warmte blok bij 60 ° C gedurende 10 minuten of langer als de eiwitconcentratie verwachting laag.</li>
		<li>Na incubatie het meten van de absorptie bij 560 nm met behulp van een afleesapparaat.</li>
		<li>Exporteer de plaat lezer metingen en de eiwitconcentratie berekenen door de waarden van de gemiddelde absorptie van elke steekproef aan een standaard curve verkregen met behulp van de standaard eiwit te vergelijken. De R-kwadraatwaarde voor de standaard curve moet groter dan of gelijk aan 0.98 te monster eiwitconcentratie nauwkeurig te schatten.</li>
		<li>Normaliseren de hoeveelheid eiwit door het opstellen van verdunningen van EiwitSteekproeven in monster (buffer) en ultrapure water. Het totale volume kan worden aangepast afhankelijk van het soort gel gebruikt. Laden van 30 µg eiwit per lane als een beginbedrag wordt aanbevolen. Toevoegen van reductiemiddel zoals dithiothreitol (DTT; eindconcentratie 5 mM) of bèta-mercaptoethanol (eindconcentratie 200 mM) aan elk monster zoals vereist. Pipetteer onverdund bèta-mercaptoethanol in een zuurkast.</li>
		<li>Incubeer de monsters in een blok van warmte bij 70 ° C gedurende 10 min. de monsters op ijs, vortex en spin down kort gezegd om te verzamelen. Houd op ijs tot het laden van de gel.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. gelelektroforese van EiwitSteekproeven
<ol><li>
Apparaat en gel instellen
	<ol>
<li>Setup een helling van de Bis-Tris geprefabriceerd 4 – 12% gel (Zie Tabel van materialen) in het gel-elektroforese kamer-systeem. Spoel de gels met tweemaal gedestilleerd water vóór gebruik. Opmerking: Afhankelijk van de grootte, de interacties en de overvloed van de proteïne van belang, gels met een verschillende helling, bufferen agent of goed formaat en nummer kan worden gebruikt.</li>
		<li>Voeg 500 mL 1 x MES SDS buffer verdund in tweemaal gedestilleerd water per tank lopen. Verwijder voorzichtig de kam van de gels na het toevoegen van de lopende buffer zonder verstoring van de putten in de stapelvolgorde gel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Eiwit laden
	<ol>
<li>Laden 3,5 µL van een eiwit standaard in de put. Afhankelijk van de indeling van de steekproef, kan laden van een eiwit ladder aan beide zijden van de gel helpen in meer eiwit grootte nauwkeurig te schatten. Gebruik schone-tipped gel laden van tips voor meer nauwkeurige steekproef laden.</li>
		<li>Bij het gebruik van een interne standaard voor tussen-membraan normalisatie (zie stap 5 hieronder en discussie), het laden van een bedrag dat gelijk is aan de andere monsters in de eerste 3 putten naast de eiwit-ladder.</li>
		<li>Belasting 30 µg van elk monster in de overige wells. Breng 1 x monster buffer in alle lege putjes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Elektroforese
	<ol>
<li>Monteer de gel tank na het laden van de monsters. De monsters worden uitgevoerd door de stapelvolgorde gel bij 80 V gedurende 10 minuten gevolgd door 150 V voor een extra 45-60 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. eiwit overdracht
Opmerking: Eiwit overdracht in dit protocol wordt uitgevoerd met behulp van een commercieel beschikbare semi-droge Bevlekkende systeem (Zie Tabel of Materials) voor snelle en consistente resultaten.
<ol><li>Voorbereiden van de eiwit-overdracht door vooraf filtreerpapier in tweemaal gedestilleerd water onderdompelen en het waarborgen van de gel-mes, kunststof Pasteur Pipetteer Bevlekkende roller en pincet zijn klaar voor gebruik.</li>
	<li>Open de transfer-stack door het zorgvuldig verwijderen van alle wrapping folie. De top uit de bodem stapel verwijderen en zet het opzij. Snel bevochtigen het membraan op de stapel van de bodem met enkele druppels elektroforese met buffer (2-3 mL). Zodra de transfer-stack geopend is, is het belangrijk om te voorkomen dat het membraan PVDF uitdrogen.</li>
	<li>Na het stoppen van de elektroforese, openen de voorgegoten gel met behulp van de gel-mes en sneed de stapelvolgorde gel. Snijd de gel rond de randen aan het bevrijden van de kunststof cast. Houd het mes van de gel NAT om schade te voorkomen aan de gel.</li>
	<li>Monteren van de transfer-stack van bodem tot bovenkant: onderste van de stapel (met het membraan PVDF), eiwit gel, filtreerpapier. Gebruik de Bevlekkende roller te verwijderen alle luchtbellen. Plaats de bovenste stapel op de top van het koffiefilter en rollen van de stapel weer om luchtbellen te verwijderen. Duw niet te sterk als hierdoor kan de gel te vervormen tijdens eiwit overbrengen.</li>
	<li>Breng de hele stack in het apparaat van de overdracht met de elektrode aan de linkerkant van het apparaat en plaats van de spons van de gel op de top van de stack, zodat het wordt uitgelijnd met de bijbehorende elektrische contacten op het apparaat. Sluit het deksel, selecteer en start het juiste programma (20 V voor 7 min is een aanbevolen uitgangspunt).</li>
	<li>Wanneer u klaar bent, laat het deksel gesloten gedurende 2 minuten om de stack om af te koelen en te voorkomen dat het membraan uitdrogen. Verwijder de transfer-stack en het membraan op de gel maat gesneden. Was de gesneden membraan snel met tweemaal gedestilleerd water voordat u verdergaat met de totale proteïne vlek.</li>
</ol>4. totaal eiwit kleuring
Opmerking: Met behulp van fluorescerende detectie biedt een aanzienlijk voordeel over meer traditionele benaderingen (bijvoorbeeld ECL detectie), zoals de lineaire bereik en gevoeligheid kunnen veel beter gecontroleerde4. Dus in stappen 4 en 5, een fluorescerende TPS en fluorescerende secundaire antilichamen worden gebruikt (Zie Tabel van materialen).
<ol><li>Rol het membraan in een 50 mL-buis met de eiwit kant naar binnen. Vanwege de lichtgevoeligheid van de fluorescerende TPS en secundaire antilichamen, worden alle volgende stappen uitgevoerd in het donker.</li>
	<li>Voeg 5 mL van eiwit vlek oplossing (Zie Tabel van materialen) en uit te broeden op een roller gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Omdat TPS en was buffer bevatten methanol, deze stappen uit te voeren in een zuurkast.</li>
	<li>Negeren van de kleurstofoplossing en was tweemaal snel met de 5 mL wassen oplossing (6,3% azijnzuur in 30% methanol). Plaats de buis kort terug op de roller tussen wassen stappen. Spoel het membraan kort met ultrazuiver water voordat u verdergaat.</li>
</ol>5. blokkeren, antilichaam-incubatie en opsporing
<ol><li>
Het blokkeren van het membraan: Voeg 3 mL blokkeerbuffer (Zie Tabel van materialen) aan de 50 mL-buis met het membraan. Het membraan op een roller gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur incuberen. Afhankelijk van de keuze van antilichaam, kan het type buffer met blokkerend gebruikt optimalisatie nodig.</li>
	<li>
Primair antilichaam-incubatie
	<ol>
<li>Gooi de blokkering buffer en vervangen met het primaire antilichaam aan de passende, geoptimaliseerd concentratie (Figuur 1 en Figuur 2: muis-anti-SMN, op 1:1, 000, verdund in blokkeerbuffer). Opmerking: Dient voldoende optimalisatie van primaire antilichamen bevestiging dat het antilichaam een eiwit product van de juiste grootte detecteert terwijl tonen geen of minimale binding met andere, aspecifieke eiwitproducten. Indien mogelijk testen en vergelijken meerdere antistoffen tegen het eiwit van belang.</li>
		<li>Incubeer het membraan op een roller's nachts bij 4 ° C. De volgende dag, verwijder de antilichaam-oplossing en wassen 6 keer gedurende 5 minuten met 1 x PBS op een roller bij kamertemperatuur (RT).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Incubatie van secundair antilichaam
	<ol>
<li>Bereid de specifieke secundair antilichaam op 1:5,000 tegen de gastheer van het primaire antilichaam in 5 mL blokkeerbuffer. Andere secundaire antilichamen kunnen andere verdunningen of het gebruik van alternatieve blokkerende buffers verlangen.</li>
		<li>Incubeer het membraan met de secundair antilichaam-oplossing op een roller voor 1 h op RT. Na incubatie het membraan driemaal 30 min met 1 x PBS te wassen op een roller.</li>
		<li>Droog het membraan en houden het membraan beschermd tegen licht met behulp van aluminiumfolie tot opsporing. Membranen kunnen worden bewaard bij 4 ° C voor lange termijn opslag.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Beeldacquisitie
	<ol>
<li>Login aan de computer waarop de scanner is aangesloten. Plaats het membraan op de scanner met de eiwit-zijde naar beneden en selecteer het scangebied in de software.</li>
		<li>Optimaliseren van de intensiteit van de laser voor beide (700 nm en 800 nm) kanalen, door te bevestigen zonder verzadiging optreedt. Verwerven van de beelden in beide kanalen en exporteren van de afbeeldingen voor verdere analyse (stap 6).</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. westelijke vlekkenanalyse en kwantificering
Opmerking: Deze aanbevelingen zijn gebaseerd op de vrij beschikbare beeld Studio software. Echter vergelijkbare analyses kunnen ook worden gedaan met behulp van andere softwarepakketten, zoals ImageJ.
<ol><li>
Het bestand importeren: een lokale werkruimte maken op de computer die wordt gebruikt voor de analyse. Dit genereert een database van afbeeldingsbestanden voor verworven westelijke vlekken. Verkregen op de scanner-bestanden importeren en selecteert u de afbeelding voor analyse.</li>
	<li>
TPS analyse
	<ol>
<li>De 700 nm kanaal zodat het totaal eiwit kleuring resultaat weergeven. Een voorbeeld van een afbeelding van de TPS is opgenomen in Figuur 1 in welke verschillende weefsels van neonatale (P5) (figuur 1A-B) en 10 - weken oude muizen (Figuur 1 C-D) direct worden vergeleken. Figuur 2 toont ook een voorbeeld van een directe vergelijking van hersenweefsel van muizen van verschillende leeftijden.</li>
		<li>Selecteer tabblad analyse in de rechterbovenhoek en selecteer Voeg rechthoek om het gebied van belang zijn voor de normalisatie (figuur 1B, D) te definiëren. Kopieer en plak de eerste rechthoek gebied op elk afzonderlijke monster om ervoor te zorgen de gedefinieerde regio op dezelfde grootte voor alle geanalyseerde rijstroken.</li>
		<li>Kopieer het resultaat van het tabblad van de Shapes in de linker onderhoek van de software.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kwantificering Opmerking: De optimale aanpak voor het kwantificeren van de monsters is afhankelijk van de proefopzet. Hier zullen wij een illustratief voorbeeld van de detectie van de overleving motor neuron proteïne (Smn; een belangrijke eiwitten die betrokken zijn bij de neuromusculaire ziekte spinale musculaire atrofie20,21), die erom bekend te afnemen in de tijd 19 en hoe normalisering van Smn signaal intensiteit aan TPS biedt betrouwbare schattingen van eiwit expressie ontwikkeling.<ol>
<li>
Figuur 2 toont een daling van Smn expressie met de leeftijd van het dier met TPS als eiwit laden van controle te verhogen. Herhaal stap 6.2.1-6.2.3 om te kwantificeren eiwit laden (figuur 2B). Herhaal stap 6.2.1-6.2.3 in de 800 nm kanaal (figuur 2A) voor het analyseren van de proteïne van belang.</li>
		<li>De resultaten van zowel de proteïne van belang als de TPS kopiëren naar een spreadsheetprogramma. Op het werkblad, eerst het normaliseren van het eiwit laden door het bepalen van de hoogste TPS-signaal en verdelen van elke TPS waarde door deze waarde te verkrijgen van de genormaliseerde proteïne laden waarde signaalverwerking.</li>
		<li>Verdeel de 800 nm signaal waarde van elke afzonderlijke monster door de bijbehorende waarde van het genormaliseerde eiwit voor de berekening van de relatieve eiwitverhouding met expressie in verschillende monsters.</li>
		<li>Na de eerste normalisatie, door verschillende tijdstippen of weefsels op de gemiddelde waarde van de interne standaard waarmee directe vergelijkingen over verschillende membranen en experimenten te vergelijken.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. statistieken
<ol><li>Om te bepalen een statistisch significante verschillen in eiwit expressie meerdere complexe en grote groepen van monsters, is passende statistische methoden vereist. Hoewel een gedetailleerde bespreking van de statistische achtergrond buiten het bestek van dit document gaat, die we willen markeren van de verschillende overwegingen en een succesvolle aanpak die we eerder hebben gebruikt19in detail te beschrijven.</li>
	<li>Wat betreft veel experimenten vertegenwoordigen eiwit kwantificering metingen niet volledig onafhankelijke gegevens. Hier, bijvoorbeeld, zijn meerdere weefsels over het algemeen verkregen van enkele dieren om eiwitniveaus over meerdere organen bij een experimentele tijd-aanspreekpunt. Daarom we een gemengde effecten modellen gebruikt voor het analyseren van de verschillen in eiwit expressie na verloop van tijd, en tussen de weefsels.  In het algemeen, bieden gemengde effecten modellen een effectieve manier om te gaan met niet-onafhankelijkheid en daardoor pseudo-replicatie22,23te vermijden. In het onderhavige geval, heeft gemengde effecten modellen met boekhouding voor herhaalde metingen onder weefsels, binnen individuen statistisch onderscheidingsvermogen toenemen. Gebruiken we het statistisch softwarepakket R voor het uitvoeren van deze analyses, omdat dit vrij beschikbaar en veelzijdig is. Echter, andere commercieel beschikbare pakketten mogelijk soortgelijke analyses uitvoeren.</li>
	<li>De huidige proefopzet impliceert een ontwerp "split perceel" omdat elke muis tot slechts één leeftijdsgroep behoorde. Dus we individuele muizen (muis ID) gemodelleerd als een willekeurige effect met een unieke identifier; We tekende ook voor weefsel, leeftijd en hun interactie als vaste effecten. Wij de gegevens met behulp van de functie lmer in de R-bibliotheek, lme4 gemodelleerd. Als een stap in de kwaliteitscontrole, we gevisualiseerd storingswaarden te beoordelen van de veronderstellingen van gelijke variantie en een normale verdeling en getransformeerd de gegevens indien nodig om te voldoen aan deze veronderstellingen. Om te testen voor een belangrijke interactie tussen weefsel en leeftijd, passen we een identiek model dat ontbrak deze interactie, en ten opzichte van de modellen met parametrische bootstrappen (R functie PBmodcomp in de bibliotheek, pbkrtest).  Waar significante interacties ontstaan, we de functie emmeans (in de bibliotheek van de emmeans R) gebruikt om te bepalen van de oorzaak van de interactie.  Bijvoorbeeld, vergeleken we gemiddelde expressie onder leeftijdsklassen binnen elk weefsel; een belangrijke interactie tussen leeftijd en weefsel kan ontstaan als, zeg, twee bepaalde leeftijdsklassen verschilde aanzienlijk voor een weefsel, maar niet een andere. Kortom bieden deze benaderingen een manier om de robuustheid van de conclusies van westelijke vlek experimenten uit te breiden door het bieden van statistische ondersteuning aan deze resultaten.</li>
</ol>

<ol><li>Bertoni, T. A., Perenha-Viana, M. C., Patussi, E. V., Cardoso, R. F., Svidzinski, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting+is+an+efficient+tool+for+differential+diagnosis+of+paracoccidioidomycosis+and+pulmonary+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunology%22%5BJournal%5D)">Western blotting is an efficient tool for differential diagnosis of paracoccidioidomycosis and pulmonary tuberculosis.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 19 (11), 1887-1888 (2012).</li>
<li>Hutchinson, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Costs+and+outcomes+of+laboratory+diagnostic+algorithms+for+the+detection+of+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">Costs and outcomes of laboratory diagnostic algorithms for the detection of HIV.</a> Journal of Clinical Virology. 58 Suppl 1, e2-7 (2013).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+protein+analysis+as+a+reliable+loading+control+for+quantitative+fluorescent+Western+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting.</a> PloS One. 8 (8), e72457(2013).</li>
<li>Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+necessity+of+and+strategies+for+improving+confidence+in+the+accuracy+of+western+blots%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots.</a> Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).</li>
<li>Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+commercial+antibodies+for+alpha-1-adrenergic+receptor+subtypes+are+nonspecific%5BTitle%5D)+AND+%22Naunyn-Schmiedebergs+Archives+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).</li>
<li>Jositsch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suitability+of+muscarinic+acetylcholine+receptor+antibodies+for+immunohistochemistry+evaluated+on+tissue+sections+of+receptor+gene-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Naunyn-Schmiedebergs+Archives+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 389-395 (2009).</li>
<li>Smejkal, G., Gallagher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+semidry+protein+transfer+efficiency+with+transverse+gradient+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Determination of semidry protein transfer efficiency with transverse gradient gel electrophoresis.</a> Biotechniques. 16 (2), 196-198, 200-192 (1994).</li>
<li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52099(2014).</li>
<li>Hunter, G., Roche, S. L., Somers, E., Fuller, H. R., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+storage+parameters+on+measurement+of+survival+motor+neuron+%28SMN%29+protein+levels%3A+implications+for+pre-clinical+studies+and+clinical+trials+for+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disorders%22%5BJournal%5D)">The influence of storage parameters on measurement of survival motor neuron (SMN) protein levels: implications for pre-clinical studies and clinical trials for spinal muscular atrophy.</a> Neuromuscular Disorders. 24 (11), 973-977 (2014).</li>
<li>Fosang, A. J., Colbran, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparency+Is+the+Key+to+Quality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transparency Is the Key to Quality.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (50), 29692-29694 (2015).</li>
<li>Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defined+methodology+for+reliable+quantification+of+Western+blot+data%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A defined methodology for reliable quantification of Western blot data.</a> Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).</li>
<li>Goasdoue, K., Awabdy, D., Bjorkman, S. T., Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+loading+controls+are+not+reliable+for+Western+blot+quantification+across+brain+development+or+in+pathological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Standard loading controls are not reliable for Western blot quantification across brain development or in pathological conditions.</a> Electrophoresis. 37 (4), 630-634 (2016).</li>
<li>Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoiding+pitfalls+of+internal+controls%3A+validation+of+reference+genes+for+analysis+by+qRT-PCR+and+Western+blot+throughout+rat+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Avoiding pitfalls of internal controls: validation of reference genes for analysis by qRT-PCR and Western blot throughout rat retinal development.</a> PloS One. 7 (8), e43028(2012).</li>
<li>Aghamaleky Sarvestany, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+quantitative+proteomic+profiling+identifies+disruption+of+ubiquitin+homeostasis+as+a+key+driver+of+Schwann+cell+defects+in+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Label-free quantitative proteomic profiling identifies disruption of ubiquitin homeostasis as a key driver of Schwann cell defects in spinal muscular atrophy.</a> Journal of Proteome Research. 13 (11), 4546-4557 (2014).</li>
<li>Fuller, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+Muscular+Atrophy+Patient+iPSC-Derived+Motor+Neurons+Have+Reduced+Expression+of+Proteins+Important+in+Neuronal+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spinal Muscular Atrophy Patient iPSC-Derived Motor Neurons Have Reduced Expression of Proteins Important in Neuronal Development.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 506(2015).</li>
<li>Liu, N. K., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-tubulin+is+a+more+suitable+internal+control+than+beta-actin+in+western+blot+analysis+of+spinal+cord+tissues+after+traumatic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury.</a> Journal of Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).</li>
<li>Moritz, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+or+Not+Tubulin%3A+Heading+Toward+Total+Protein+Staining+as+Loading+Control+in+Western+Blots%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li>
<li>Groen, E. J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+tissue-specific+variability+of+SMN+protein+levels+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Temporal and tissue-specific variability of SMN protein levels in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 27 (16), 2851-2862 (2018).</li>
<li>Chaytow, H., Huang, Y. T., Gillingwater, T. H., Faller, K. M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+survival+motor+neuron+protein+%28SMN%29+in+protein+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">The role of survival motor neuron protein (SMN) in protein homeostasis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).</li>
<li>Groen, E. J. N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+therapy+for+spinal+muscular+atrophy%3A+promises+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Neurology%22%5BJournal%5D)">Advances in therapy for spinal muscular atrophy: promises and challenges.</a> Nature Reviews: Neurology. 14 (4), 214-224 (2018).</li>
<li>Fitzmaurice, G. M., Laird, N. M., Ware, J. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFitzmaurice%2C+GM+%22Applied+longitudinal+analysis%22">Applied longitudinal analysis</a>. , Wiley-Interscience. (2004).</li>
<li>Jordan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+sampling+affects+pseudoreplication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Population sampling affects pseudoreplication.</a> PLoS Biology. 16 (10), e2007054(2018).</li>
<li>LaFauci, G., Adayev, T., Kascsak, R., Brown, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+Quantification+of+the+Fragile+X+Mental+Retardation+Protein+1+%28FMRP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Detection and Quantification of the Fragile X Mental Retardation Protein 1 (FMRP).</a> Genes (Basel). 7 (12), (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende belangen openbaar te maken.

Met de juiste proefopzet, de controlemaatregelen en de statistische analyse, kan westelijke bevlekken worden gebruikt om betrouwbare kwantitatieve ramingen van eiwit expressie binnen en tussen een gevarieerd aanbod van biologische monsters. Het protocol we in het huidige manuscript beschrijven wil dienen als richtsnoer voor onderzoekers op zoek naar het westelijke bevlekken om kwantitatieve analyse over grotere en complexere groepen van monsters, met behulp van een combinatie van fluorescentie gebaseerde gebruiken detect...

Westelijke bevlekken is een techniek die wordt gebruikt bij het detecteren en kwantificeren van eiwit expressie, met inbegrip in weefsel homogenates of extracten. Loop der jaren heeft deze techniek geleid tot veel vooruitgang in zowel fundamenteel en klinisch onderzoek, waar het kan worden gebruikt als een diagnostisch hulpprogramma te identificeren van de aanwezigheid van ziekte1,2. Westelijke bevlekken werd het eerst beschreven in 1979 als een methode voor het overbrengen van eiwitten van polyacrylamide gels naar nitrocellulose bladen en vervolgens het visualiseren van eiwitten met behulp van secundaire antilichamen die waren ofwel radioactief gelabelde of geconjugeerd met fluoresceïne of peroxidase3. Door de ontwikkeling van commercieel beschikbare kits en apparatuur, zijn westelijke bevlekkende methoden steeds meer gestandaardiseerd en vereenvoudigd door de jaren heen. Inderdaad, de techniek is gemakkelijk nu uitgevoerd door wetenschappers met uiteenlopende achtergronden en niveaus van ervaring. Echter zoals met vele soortgelijke experimentele technieken, wordt het resultaat van westelijke vlek analyses gemakkelijk beïnvloed door de keuzes in het ontwerp en de uitvoering van het experiment. Het is daarom belangrijk, dat de toegankelijkheid van gestandaardiseerde westelijke bevlekkende methoden niet de behoefte aan zorgvuldige experimentele planning verdoezelen en ontwerp. Experimentele aspecten omvatten, maar zijn niet beperkt tot, monster voorbereiding en behandeling, selectie en validatie van antilichamen voor eiwit detectie en gel-naar-membraan spuitrendement van met name kleine of grote (< 10 of > 140 kDa) eiwitten4,5,6,7,8,9. Eiwit kwaliteit van het oorspronkelijke monster speelt een belangrijke rol bij de bepaling van het resultaat van de daaropvolgende westelijke vlekkenanalyse. Zoals eiwitten kan worden geëxtraheerd uit een grote verscheidenheid van monsters en bronnen, met inbegrip van weefsels van dierlijke modellen, cellijnen en post mortem menselijke weefsels, is consistentie in afhandeling en verwerking vereist om reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Bijvoorbeeld, als de langetermijnopslag van monsters voor eiwit extractie vereist is, is het belangrijk om te beseffen dat, hoewel eiwit over het algemeen stabiel bij-80 ° C is, verschillen in eiwitstabiliteit uitgepakte eiwitten en intact weefsels bij-80 ° C geweest gerapporteerde10. Bovendien, met het oog op een reproduceerbare ramingen van de hoeveelheden eiwit, consistente homogenisering van de monsters is cruciaal. Optimaliseren van verschillende lysis buffers en homogenisering methoden (bijvoorbeeld handmatige homogenisering in vergelijking met geautomatiseerde methoden) kan nodig zijn voordat u begint een grootschalige kwantitatieve experiment.
Normalisatie strategieën om te corrigeren voor eiwit laden en kwantificering variabiliteit zijn essentieel voor het verkrijgen van robuuste, kwantitatieve resultaten van eiwit expressie. Huishouden eiwitten zoals β-actine, α-tubuline, β-tubuline en glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) hebben van oudsher gebruikt om te normaliseren eiwitniveaus voor kwantificering. Echter, normalisatie aan specifieke huishouding eiwitten voor kwantificering doeleinden is steeds meer bekritiseerd over de afgelopen paar jaar11,12. Bijvoorbeeld, kunt de uitdrukking van de huishouding eiwitten wijzigen in verschillende ontwikkelingsstadia13,14, over weefsels van dezelfde dieren4en onder verschillende ziekte voorwaarden4,15 ,16,17. Daarom is het gebruik van specifieke huishouding eiwitten beperkt de mogelijkheden van het maken van meer complexe vergelijkingen tussen eiwit expressie uit verschillende weefsels, op verschillende tijdstippen en onder verschillende experimentele omstandigheden. Een alternatief voor huishouden eiwitten aan besturingselement voor eiwit laden variatie is het gebruik van een totale proteïne vlek (TPS) dat etiketten en visualiseert alle eiwitten aanwezig in een monster. TPS kunt signaal normalisering op basis van de totale proteïne laden in plaats van de niveaus van één specifieke proteïne en dus kwantificering van TPS signaal moet zijn vergelijkbaar en reproduceerbare ongeacht de experimentele conditie, monster type of developmental timepoint . Voorbeelden van totaal eiwit vlekken zijn Ponceau S, vlek-vrij gels Coomassie R-350, Sypro-Ruby, Epicocconone, Amydo Black en Cy5 (herzien in ref. 18). Elk van deze methoden heeft specifieke voordelen en beperkingen en selectie methode hangt af van de tijd en hulpmiddelen beschikbaar, evenals de experimentele opzet4,18.
Naast het gebruik van een TPS om te corrigeren voor binnen-membraan laden en kwantificering variabiliteit, wellicht te vergelijken tussen verschillende membranen, met name bij het uitvoeren van grootschalige eiwit expressie analyse monsters. Echter kan variabiliteit in factoren zoals antilichamen bindende efficiëntie en totaal eiwit vlek intensiteit leiden tot verdere variabiliteit tussen de eiwitsteekproeven die op aparte gels zijn geanalyseerd en membranen. Voor robuuste kwantificering in deze situatie moet het dan ook om een verdere normalisatie stap om de variabiliteit tussen-membraan te verklaren. Dit kan worden bereikt door een interne laden standaard op elk van de afzonderlijk geanalyseerde membranen die constant wordt gehouden over experimenten. Deze standaard kan de vorm aannemen van een eiwit lysate die in voldoende hoeveelheden worden gebruikt in alle membranen opgenomen in het experiment kan worden verkregen. Hier, gebruiken we een lysate van muis hersenen (verkregen uit 5 dag oud besturingselement muizen), omdat de hersenen is gemakkelijk gehomogeniseerd en de verkregen eiwit lysate bevat een aanzienlijke hoeveelheid eiwit met een hoge concentratie. Laden van een interne standaard in drievoud kunt monsters op aparte membranen worden genormaliseerd en vergeleken rechtstreeks.
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol die we hebben ontwikkeld zodat ons ertoe complexe vergelijkingen van eiwit expressie variatie in verschillende weefsels, Muismodellen (inclusief ziekte modellen) en ontwikkelingsstoornissen timepoints19. Door een fluorescerende TPS te combineren met het gebruik van een interne laden standaard, konden we bestaande beperkingen in het aantal monsters en experimentele omstandigheden die binnen een enkele experiment kunnen worden vergeleken. Deze aanpak breidt het gebruik van traditionele westelijke vlek technieken, waardoor onderzoekers beter verkennen eiwituitdrukking in verschillende weefsels en monsters.

<table><tbody><tr><td>Fine Tipped Gel Loading Tips</td><td>Alpha Laboratories</td><td>GL20057SNTL</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78437</td><td></td></tr><tr><td>Handheld homogeniser&nbsp;</td><td>VWR Collection</td><td>431-0100</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 Gel Transfer Device</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>IB21001</td><td></td></tr><tr><td>iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>IB401031</td><td></td></tr><tr><td>Image Studio Lite</td><td>Licor</td><td>N/A</td><td>Gratis downloaden vanaf https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/</td></tr><tr><td>IRDye 800CW secundaire antilichamen</td><td>Licor</td><td>--</td><td>Selecteer het juiste secundaire antilichaam dat specifiek is voor de host van het primaire antilichaam.</td></tr><tr><td>Micro BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Novex Sharp Pre-stained Protein Standard</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC5800</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0323BOX</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Blocking Buffer</td><td>Licor</td><td>927-40000</td><td></td></tr><tr><td>Gezuiverd Muis anti-SMN (survival motor neuron) monoklonaal antilichaam</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610646</td><td>Wordt veel gebruikt in de SMN/SMA literatuur en geeft consistente resultaten ongeacht het lotnummer</td></tr><tr><td>REVERT Total Protein Stain, 250 mL&nbsp;</td><td>Licor</td><td>926-11021&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>REVERT Wash Solution&nbsp;</td><td>Licor</td><td>926-11012&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>XCell&nbsp;SureLock Mini-Cell</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EI0001</td><td></td></tr></tbody></table>

robuuste vergelijking van eiwitniveaus over weefsels en in de gehele ontwikkeling met behulp van gestandaardiseerde kwantitatieve westelijke bevlekken

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Westelijke bevlekken is een techniek die wordt gebruikt bij het detecteren en kwantificeren van eiwit expressie. Loop der jaren heeft deze techniek geleid tot veel vooruitgang in zowel fundamenteel en klinisch onderzoek. Echter zoals met vele soortgelijke experimentele technieken, wordt het resultaat van westelijke vlek analyses gemakkelijk beïnvloed door de keuzes in het ontwerp en de uitvoering van het experiment. Specifieke huishouding eiwitten hebben van oudsher gebruikt om te normaliseren eiwitniveaus voor kwantificering, echter deze hebben een aantal beperkingen en hebben daarom steeds meer bekritiseerd in de afgelopen paar jaar. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol die we hebben ontwikkeld zodat ons ertoe complexe vergelijkingen van eiwit expressie variatie in verschillende weefsels, Muismodellen (inclusief ziekte modellen) en ontwikkelingsstoornissen timepoints. Met behulp van een fluorescerende totaal eiwit vlek en introductie van het gebruik van een interne standaard wordt geladen, is het mogelijk om de bestaande beperkingen in het aantal monsters die binnen experimenten kunnen worden vergeleken en systematisch vergelijken eiwitniveaus over een waaier van experimentele omstandigheden. Deze aanpak breidt het gebruik van traditionele westelijke vlek technieken, waardoor onderzoekers beter verkennen eiwituitdrukking in verschillende weefsels en monsters.

Wij zijn voorbeelden van het gebruik van TPS en een interne standaard om vergelijkingen van eiwitniveaus over weefsels en tijdstippen. Figuur 1 toont de resultaten van het westelijke bevlekken op eiwit geëxtraheerd uit weefsels verkregen neonatale (postnatale dag 5) in vergelijking met volwassen muizen (10 - weken oude). TPS en Smn immunoblot worden weergegeven in figuur 1A, C. Kwantificering van de intensiteit v...

Deze methode beschrijft een robuuste en reproduceerbare aanpak voor het vergelijken van eiwitniveaus in verschillende weefsels en bij verschillende ontwikkelings timepoints met behulp van een kwantitatieve westelijke bevlekkende standaardbenadering.

Robuuste vergelijking van eiwitniveaus over weefsels en in de gehele ontwikkeling met behulp van gestandaardiseerde kwantitatieve westelijke bevlekken

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Dit protocol kan worden gebruikt om belangrijke vragen in fundamenteel en klinisch onderzoek aan te pakken door te kijken naar eiwitexpressie in verschillende weefsels en tijdstippen. Om betrouwbare kwantitatieve westerse blotting uit te voeren, combineren we een fluorescerende totale eiwitvlek met een interne ladingscontrole. Dit overwint beperkingen die zich voordoen bij het vergelijken van verschillende weefsels over experimentele omstandigheden.Om eiwitten uit snap-bevroren cel of weefselmonsters te extraheren, ontdooit u de min-80-gradenmonsters op ijs voordat u de monsters indien van toepassing was, volgens de tabel. Met behulp van een draagbare elektrische homogenisator met een polypropyle stamper, homogeniseren de gewassen monsters, spoelen de stamper in dubbel gedestilleerd water en drogen met een schoon weefsel tussen de monsters. Laat de monsters 10 minuten op ijs liggen, gevolgd door centrifugatie.Breng vervolgens het eiwitmonster-bevattende supernatant over naar een nieuwe buis op ijs zonder de pellet te verstoren. Voor de kwantificering van de eiwitconcentratie worden de albuminenormen voor runderserums ingesteld bij toenemende concentraties in drievoud en één microliter van elk eiwitmonster in tweevoud toegevoegd aan de juiste putten van een optische plaat met 96 put. Incubeer het eiwit op een 60-graden Celsius warmteblok gedurende 10 minuten of langer als de eiwitconcentratie naar verwachting laag is en meet de absorptie op 560 nanometer op een plaatlezer.Exporteer de metingen van de plaatlezer en bereken de eiwitconcentratie door de gemiddelde absorptiewaarden van elk monster te vergelijken met een standaardcurve verkregen met behulp van de eiwitnorm. Om de hoeveelheid eiwit te normaliseren, bereid verdunningen van de eiwitmonsters in monsterbuffer en ultrazuiver water en broed de monsters gedurende 10 minuten uit in een hitteblok van 70 graden Celsius. Plaats vervolgens de monsters op ijs voordat u gaat wervelen en even centrifugeert.Voor elektroforese, het opzetten van een prefab vier tot 12%Bis-Tris gradiënt gel in de gel elektroforese kamer systeem en belasting 3,5 microliter van een eiwit standaard in de put. Laad bij het gebruik van een interne standaard voor tussen-membraannormalisatie een hoeveelheid die gelijk is aan de andere monsters in de eerste drie putten naast de eiwitladder en laad 30 microgram van elk monster in de resterende putten. Voer vervolgens de monsters door de stapelgel op 80 volt gedurende 10 minuten, gevolgd door 150 volt voor een extra 45 tot 60 minuten.Plaats aan het einde van de elektroforese, om de overdrachtsstapel te monteren, de eiwitgel op de bodemstapel met het polyvinylidenen difluoridemembraan, gevolgd door het filterpapier. Gebruik de blotting roller om eventuele luchtbellen te verwijderen en plaats de bovenste stapel op de bovenkant van het filterpapier voordat u de stapel weer rolt om luchtbellen te verwijderen. Breng de hele stapel met de elektrode aan de linkerkant van het apparaat over in het overdrachtsapparaat en plaats de gelspons bovenop de stapel, zodat de spons wordt uitgelijnd met de bijbehorende elektrische contacten op het apparaat.Na het sluiten van het deksel, selecteer en start het juiste programma. Snijd aan het einde van het programma het membraan tot de gelgrootte en was het snijmembraan snel met dubbel gedestilleerd water voordat u verdergaat met de totale eiwitvlek. Voor totale eiwitvlekken rol je het membraan in een buis van 50 milliliter met de eiwitkant naar binnen gericht en label het membraan met vijf milliliter eiwitvlekoplossing op een roller gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur in een rookkap.Aan het einde van de incubatie was je het membraan snel met vijf milliliter wasoplossing, waarbij de buis kort terugkeert naar de roller tussen wasbeurten, gevolgd door een korte spoeling met ultrazuiver water. Voeg drie milliliter blokkeerbuffer toe aan het membraan en breng het membraan gedurende 30 minuten terug op de rol bij kamertemperatuur. Vervang de blokkeerbuffer door het primaire antilichaam van belang bij de juiste geoptimaliseerde concentratie en broed het membraan op de rol 's nachts bij vier graden Celsius uit.De volgende dag was je het membraan zes keer gedurende vijf minuten met vijf milliliter verse PBS per wasbeurt op de rol bij kamertemperatuur. Na de laatste wasbeurt, incubeer het membraan met de juiste secundaire antilichaamoplossing op de rol gedurende een uur bij kamertemperatuur, gevolgd door drie wasbeurten gedurende 30 minuten per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt droog je het membraan en gebruik aluminiumfolie om het membraan tegen licht te beschermen.Voor het verkrijgen van afbeeldingen, plaats het membraan op de scanner met de eiwitkant naar beneden en selecteer het scangebied in de software. Verwerf vervolgens afbeeldingen in beide kanalen en exporteer de afbeeldingen naar een geschikt beeldanalyseprogramma. Geef het kanaal van 700 nanometer weer om het totale resultaat van eiwitvlekken weer te geven en Selecteer Analyse en Tekenrechthoek om het interessegebied voor normalisatie te definiëren.Kopieer en plak vervolgens het eerste rechthoekgebied op elk afzonderlijk voorbeeld om ervoor te zorgen dat het gedefinieerde gebied dezelfde grootte heeft voor alle geanalyseerde rijstroken. Om de eiwitconcentratie in elke rijstrook te kwantificeren, kopieert u de resultaten van zowel de totale eiwitvlek als het eiwit van belang naar een spreadsheetprogramma en bepaalt u het hoogste totale eiwitvleksignaal. Verdeel vervolgens elke totale eiwitvleksignaalwaarde door deze waarde om de genormaliseerde eiwitbelastingswaarde te verkrijgen en verdeel de signaalwaarde van 800 nanometer van elk afzonderlijk monster door de bijbehorende genormaliseerde eiwitwaarde om de relatieve eiwitexpressieverhouding in verschillende monsters te berekenen.In deze representatieve westerse vlekken worden eiwitten gewonnen uit weefsels verkregen uit postnatale dag vijf muizen vergeleken met eiwitten die worden gewonnen uit 10 weken oude volwassen muizen. Kwantificering van de fluorescentieintensiteit van de totale eiwitvlek werd bereikt door de fluorescentieintensiteit in de rechthoeksdoos op elke rijstrook te meten. Wanneer hele rijstroken worden geanalyseerd, blijft de fluorescentieintensiteit relatief vergelijkbaar tussen monsters, wat aangeeft dat het gebruik van de totale eiwitvlek voor normalisatie geschikt is voor dit doel.De fluorescerende totale eiwitvlek kan ook worden gebruikt om eiwitniveaus op verschillende ontwikkelingstijdpunten te vergelijken. Bijvoorbeeld, hoewel overleving motorische neuron eiwitniveaus duidelijk afnemen met de leeftijd in muizen, de totale eiwit gekleurde kwantificering blijft constant. Het gebruik van interne standaarden, normalisatie op basis van fluorescentie en adequate statistieken verhoogt de robuustheid van complexe eiwitexpressieanalyse over verschillende omstandigheden.Dit protocol voegt toe aan traditionele westerse vlekkentechnieken, het overwinnen van de problemen van de juiste beladingscontroles en vergelijkingen tussen experimentele batches, en het verstrekken van flexibiliteit voor eiwit expressie analyse. Deze aanpak kan worden uitgebreid tot het vergelijken van eiwitexpressie onder andere experimentele omstandigheden.

robust-comparison-protein-levels-across-tissues-throughout

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

The video demonstrates a total protein normalization-based western blotting technique for quantifying the target protein expression in a sample. By utilizing the total protein staining of the sample, a ratiometric analysis is performed to determine the relative expression level of the target protein.

Quantitative Western Blotting to Estimate Protein Expression Levels

V3 workflow is een westerse vlek procedure met behulp van vlekvrije gels. De vlekvrije technologie stelt onderzoekers in staat om de kwaliteit van eiwitscheiding te visualiseren, de overdrachtsefficiëntie te verifiëren en vooral om de verandering in het eiwit van belang te valideren met behulp van totale eiwitkwantificering als een betrouwbare belastingscontrole.

V3 Vlekvrije workflow voor een praktische, handige en betrouwbare totale eiwitbelastingscontrole in Western Blotting

Een gemeenschappelijke eiwitextractie protocol met behulp van ureum / thioureum / SDS buffer voor menselijke en muizen hersenweefsel maakt het identificeren van eiwitten door 2D-DIGE en de daaropvolgende karakterisering door mini 2DE immunoblotting. Deze methode maakt een meer reproduceerbare en betrouwbare resultaten te verkrijgen van menselijke biopsies en experimentele modellen.

Consensus Brain-afgeleide eiwit, Extraction Protocol voor de studie van mensen en muizen Brain Proteome behulp Zowel 2D-DIGE en Mini 2DE Immunoblotting

De vooruitgang van westerse blotting met behulp van fluorescentie heeft de detectie van subtiele veranderingen in eiwitexpressie mogelijk gemaakt, waardoor kwantitatieve analyses mogelijk zijn. Hier beschrijven we een robuuste methodologie voor de detectie van een reeks eiwitten in verschillende soorten en weefselsoorten. Er wordt ook een strategie geboden om veelvoorkomende technische problemen te overwinnen.

A Guide to Modern Kwantitatieve TL Western Blotting met Troubleshooting Strategies

We presenteren een protocol om te kwantificeren nauwkeurig eiwitten met isobaar etikettering, uitgebreide fractionering, bioinformatica tools en kwaliteitscontrole stappen in combinatie met vloeibare chromatografie geïnterfacet met een hoge resolutie massaspectrometer.

Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering

Een standaard Western blotting protocol is geoptimaliseerd voor het analyseren van slechts 500 hematopoietische stamcellen of voorlopercellen. Optimalisatie houdt zorgvuldige behandeling van het monster van de cel, beperking van de overdracht tussen buizen en direct het lysing van cellen in Laemmli monster buffer.

Een Western Blotting Protocol voor kleine aantallen van hematopoietische stamcellen

Hier tonen we een gedetailleerd proces van kwantitatieve dot vlekkenanalyse (QDB) door de vaststelling van de absolute inhoud van een gerichte eiwit, aftopping actine eiwit, gelsolin-achtige (CAPG), in drie verschillende muis weefsels. We tonen een hoge doorvoer, handige, kwantitatieve immunoblot techniek voor biomerker validatie op het niveau van cellulaire en weefsel.

High Throughput, Absolute bepaling van het gehalte van een geselecteerde eiwit op weefsel niveaus met behulp van kwantitatieve Dot analyse (QDB) van de vlek

We beschrijven het gebruik van kwantitatieve immunoblotting te valideren immunofluorescentie histologie beeldanalyse wordt gekoppeld als een middel voor het kwantificeren van een proteïne van belang in formaline-vaste, paraffine-ingebedde weefselsteekproeven van (FFPE). Onze resultaten tonen aan dat het nut van immunofluorescentie histologie voor het vaststellen van de relatieve hoeveelheid biomerker eiwitten in routine biopsie monsters.

Kwantitatieve Immunoblotting van cellijnen als een standaard voor het valideren van de immunofluorescentietest voor het kwantificeren van Biomarker eiwitten in Routine weefselsteekproeven

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van RNA, DNA en eiwit uit hetzelfde monster, in een poging om de variatie te reduceren, reproduceerbaarheid te verbeteren en vergemakkelijken van interpretaties.

Gecombineerde Nucleotide en eiwit extracties in Caenorhabditis elegans

Dit artikel beschrijft een protocol voor het analyseren van eiwitten uit Xenopus-eicellen en embryo's door middel van immunoblotting. Verzamelingsstappen worden beschreven, gevolgd door stappen die overeenkomen met monsterverwerking, SDS-PAGE, overdracht, antilichaamkleuring en beeldvorming. Het protocol legt de nadruk op het bestuderen van translationele regulerende eiwitcomplexen met endogene antilichamen en antilichamen tegen eiwitaffiniteitslabels.

Geoptimaliseerde analyse van eiwitten uit xenopus-eicellen en embryo's door immunoblotting

Leer gestandaardiseerde kwantitatieve western blotting voor betrouwbare eiwitexpressie-analyse in verschillende weefsels en ontwikkelingsstadia. Deze methode verbetert de reproduceerbaarheid van fundamenteel en klinisch onderzoek.

Robuuste vergelijking van eiwitniveaus over weefsels en in de gehele ontwikkeling met behulp van gestandaardiseerde kwantitatieve westelijke bevlekken (Video) | JoVE Journal

Robuuste vergelijking van eiwitniveaus over weefsels en in de gehele ontwikkeling met behulp van gestandaardiseerde kwantitatieve westelijke bevlekken

Meer video's verkennen