Robuuste vergelijking van eiwitniveaus over weefsels en in de gehele ontwikkeling met behulp van gestandaardiseerde kwantitatieve westelijke bevlekken

Dit protocol kan worden gebruikt om belangrijke vragen in fundamenteel en klinisch onderzoek aan te pakken door te kijken naar eiwitexpressie in verschillende weefsels en tijdstippen. Om betrouwbare kwantitatieve westerse blotting uit te voeren, combineren we een fluorescerende totale eiwitvlek met een interne ladingscontrole. Dit overwint beperkingen die zich voordoen bij het vergelijken van verschillende weefsels over experimentele omstandigheden.

Om eiwitten uit snap-bevroren cel of weefselmonsters te extraheren, ontdooit u de min-80-gradenmonsters op ijs voordat u de monsters indien van toepassing was, volgens de tabel. Met behulp van een draagbare elektrische homogenisator met een polypropyle stamper, homogeniseren de gewassen monsters, spoelen de stamper in dubbel gedestilleerd water en drogen met een schoon weefsel tussen de monsters. Laat de monsters 10 minuten op ijs liggen, gevolgd door centrifugatie.

Breng vervolgens het eiwitmonster-bevattende supernatant over naar een nieuwe buis op ijs zonder de pellet te verstoren. Voor de kwantificering van de eiwitconcentratie worden de albuminenormen voor runderserums ingesteld bij toenemende concentraties in drievoud en één microliter van elk eiwitmonster in tweevoud toegevoegd aan de juiste putten van een optische plaat met 96 put. Incubeer het eiwit op een 60-graden Celsius warmteblok gedurende 10 minuten of langer als de eiwitconcentratie naar verwachting laag is en meet de absorptie op 560 nanometer op een plaatlezer.

Exporteer de metingen van de plaatlezer en bereken de eiwitconcentratie door de gemiddelde absorptiewaarden van elk monster te vergelijken met een standaardcurve verkregen met behulp van de eiwitnorm. Om de hoeveelheid eiwit te normaliseren, bereid verdunningen van de eiwitmonsters in monsterbuffer en ultrazuiver water en broed de monsters gedurende 10 minuten uit in een hitteblok van 70 graden Celsius. Plaats vervolgens de monsters op ijs voordat u gaat wervelen en even centrifugeert.

Voor elektroforese, het opzetten van een prefab vier tot 12%Bis-Tris gradiënt gel in de gel elektroforese kamer systeem en belasting 3,5 microliter van een eiwit standaard in de put. Laad bij het gebruik van een interne standaard voor tussen-membraannormalisatie een hoeveelheid die gelijk is aan de andere monsters in de eerste drie putten naast de eiwitladder en laad 30 microgram van elk monster in de resterende putten. Voer vervolgens de monsters door de stapelgel op 80 volt gedurende 10 minuten, gevolgd door 150 volt voor een extra 45 tot 60 minuten.

Plaats aan het einde van de elektroforese, om de overdrachtsstapel te monteren, de eiwitgel op de bodemstapel met het polyvinylidenen difluoridemembraan, gevolgd door het filterpapier. Gebruik de blotting roller om eventuele luchtbellen te verwijderen en plaats de bovenste stapel op de bovenkant van het filterpapier voordat u de stapel weer rolt om luchtbellen te verwijderen. Breng de hele stapel met de elektrode aan de linkerkant van het apparaat over in het overdrachtsapparaat en plaats de gelspons bovenop de stapel, zodat de spons wordt uitgelijnd met de bijbehorende elektrische contacten op het apparaat.

Na het sluiten van het deksel, selecteer en start het juiste programma. Snijd aan het einde van het programma het membraan tot de gelgrootte en was het snijmembraan snel met dubbel gedestilleerd water voordat u verdergaat met de totale eiwitvlek. Voor totale eiwitvlekken rol je het membraan in een buis van 50 milliliter met de eiwitkant naar binnen gericht en label het membraan met vijf milliliter eiwitvlekoplossing op een roller gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur in een rookkap.

Aan het einde van de incubatie was je het membraan snel met vijf milliliter wasoplossing, waarbij de buis kort terugkeert naar de roller tussen wasbeurten, gevolgd door een korte spoeling met ultrazuiver water. Voeg drie milliliter blokkeerbuffer toe aan het membraan en breng het membraan gedurende 30 minuten terug op de rol bij kamertemperatuur. Vervang de blokkeerbuffer door het primaire antilichaam van belang bij de juiste geoptimaliseerde concentratie en broed het membraan op de rol 's nachts bij vier graden Celsius uit.

De volgende dag was je het membraan zes keer gedurende vijf minuten met vijf milliliter verse PBS per wasbeurt op de rol bij kamertemperatuur. Na de laatste wasbeurt, incubeer het membraan met de juiste secundaire antilichaamoplossing op de rol gedurende een uur bij kamertemperatuur, gevolgd door drie wasbeurten gedurende 30 minuten per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt droog je het membraan en gebruik aluminiumfolie om het membraan tegen licht te beschermen.

Voor het verkrijgen van afbeeldingen, plaats het membraan op de scanner met de eiwitkant naar beneden en selecteer het scangebied in de software. Verwerf vervolgens afbeeldingen in beide kanalen en exporteer de afbeeldingen naar een geschikt beeldanalyseprogramma. Geef het kanaal van 700 nanometer weer om het totale resultaat van eiwitvlekken weer te geven en Selecteer Analyse en Tekenrechthoek om het interessegebied voor normalisatie te definiëren.

Kopieer en plak vervolgens het eerste rechthoekgebied op elk afzonderlijk voorbeeld om ervoor te zorgen dat het gedefinieerde gebied dezelfde grootte heeft voor alle geanalyseerde rijstroken. Om de eiwitconcentratie in elke rijstrook te kwantificeren, kopieert u de resultaten van zowel de totale eiwitvlek als het eiwit van belang naar een spreadsheetprogramma en bepaalt u het hoogste totale eiwitvleksignaal. Verdeel vervolgens elke totale eiwitvleksignaalwaarde door deze waarde om de genormaliseerde eiwitbelastingswaarde te verkrijgen en verdeel de signaalwaarde van 800 nanometer van elk afzonderlijk monster door de bijbehorende genormaliseerde eiwitwaarde om de relatieve eiwitexpressieverhouding in verschillende monsters te berekenen.

In deze representatieve westerse vlekken worden eiwitten gewonnen uit weefsels verkregen uit postnatale dag vijf muizen vergeleken met eiwitten die worden gewonnen uit 10 weken oude volwassen muizen. Kwantificering van de fluorescentieintensiteit van de totale eiwitvlek werd bereikt door de fluorescentieintensiteit in de rechthoeksdoos op elke rijstrook te meten. Wanneer hele rijstroken worden geanalyseerd, blijft de fluorescentieintensiteit relatief vergelijkbaar tussen monsters, wat aangeeft dat het gebruik van de totale eiwitvlek voor normalisatie geschikt is voor dit doel.

De fluorescerende totale eiwitvlek kan ook worden gebruikt om eiwitniveaus op verschillende ontwikkelingstijdpunten te vergelijken. Bijvoorbeeld, hoewel overleving motorische neuron eiwitniveaus duidelijk afnemen met de leeftijd in muizen, de totale eiwit gekleurde kwantificering blijft constant. Het gebruik van interne standaarden, normalisatie op basis van fluorescentie en adequate statistieken verhoogt de robuustheid van complexe eiwitexpressieanalyse over verschillende omstandigheden.

Dit protocol voegt toe aan traditionele westerse vlekkentechnieken, het overwinnen van de problemen van de juiste beladingscontroles en vergelijkingen tussen experimentele batches, en het verstrekken van flexibiliteit voor eiwit expressie analyse. Deze aanpak kan worden uitgebreid tot het vergelijken van eiwitexpressie onder andere experimentele omstandigheden.