Niet-invasieve strategieën voor chronische manipulatie van de DREADD-gecontroleerde Neuronale activiteit

DREADD's zijn de meest populaire chemogenetische aanpak voor afstandsbediening van neuronale activiteit. Hier bieden we nieuwe alternatieven voor repetitieve of chronische DREADD controle, gericht op minder invasieve CNO leveringsmethoden. We beschrijven twee strategieën voor de langdurige CNO-levering bij muizen door herhaalde oogdruppels, of chronisch door het drinkwater van het dier.

De hier beschreven protocollen zijn voorbeelden van chronische en niet-invasieve opties voor CNO-levering die kunnen worden aangepast aan een verscheidenheid aan experimentele ontwerpen, waaronder verschillende DREADD-varianten, weefsels of zelfs soorten. Een belangrijk punt voor een CNO levering is stress en pijn van een dier. Deze protocollen minimaliseren dit probleem en zijn eenvoudig uit te voeren en aan te passen aan verschillende experimentele instellingen.

Voor het uitvoeren van de operatie, reinigen en steriliseren van de stereotaxic frame en alle benodigde instrumenten. Wanneer het frame klaar is, bevestig dan een gebrek aan reactie op teen knijpen in een verdoofde gemengde achtergrond wilde type mannelijke muis, scheren de bovenkant van het hoofd, en bevestig het hoofd van de muis op het frame. Breng vervolgens oculair beschermend smeermiddel aan op de ogen en maak ten slotte de blootgestelde huid schoon met sequentiële povidonjodium en 70% ethanolscrubt.

Gebruik een steriele scalpel om de schedel bloot te stellen en het frame te kalibreren tot het bregma-punt. Boor op een medialaterale coördinaat van 2,9 millimeter, en een voorste coördinaat van min 2,7 millimeter om de hippocampus te targeten. Wanneer de hersenen worden blootgesteld, gebruik maken van een micro-injector en getrokken microcapillaire pipetten om eenzijdig injecteren 90 nanoliters van de adenoassociated virus in de hippocampus op een dorsale ventrale diepte van min drie millimeter.

Sluit vervolgens de incisie met nylon hechtingen en verwijder het dier uit het frame voor analgesieadministratie. Voor repetitieve CNO-levering, vanaf vier weken na de injectie, acclimatiseren de dieren aan de behandeling door scruffing elke muis drie minuten per dag gedurende drie tot vier dagen voorafgaand aan de toediening van de oogdruppels. Wanneer de muizen gewend zijn geraakt aan de behandeling, weegt elke muis om de juiste hoeveelheid CNO te bepalen die moet worden geleverd om een één milligram CNO per kilogram lichaamsgewichtconcentratie te bereiken.

Twee uur voor het uitlichten tijdens de inactieve fase, laad een tot drie microliter van de voorbereide CNO-oplossing in een P10-micropipet en immobiliseer de muis via scruffing. Verdrijf de oplossing langzaam totdat zich een stabiele druppel vormt op de pipetpunt en breng de druppel voorzichtig dicht bij het hoornvlies totdat de oplossing wordt geleverd zonder de pipettepunt aan het oog van de muis aan te raken. Breng de muis vervolgens terug naar zijn thuiskooi voordat u de CNO-oogdruppel op het oog van het volgende dier brengt.

In gevallen waarin CNO moet worden geleverd tijdens de muis actieve fase, zorgen voor de aanwezigheid van een zwak rood licht voor een goede behandeling van dieren en CNO levering. Voor chronische CNO behandeling, vanaf vier weken na injectie en drie dagen voor aanvang van de behandeling, vervang de reguliere flessen water met kleine flessen gestopt met rubberen tuiten en bedekt met aluminiumfolie met 10 milliliter regelmatig water. Zet de kooien vast met tape om muizen te laten acclimatiseren aan de flessen.

Meet het dagelijkse waterverbruik voor elke muis en weeg elke muis. Test een reeks CNO-concentraties om de dosis te bepalen die de maximale effectiviteit weergeeft met de minimale CNO-concentratie. Vul vervolgens elke kleine fles met acht milliliter gewoon water plus de vereiste hoeveelheid CNO.

Voor beperkte CNO-behandeling, vanaf vier weken na injectie en drie dagen voor aanvang van de behandeling, plaats een klein flesje met 10 milliliter water plus 1%sucrose op de kooi weg van de oorspronkelijke waterfles tijdens het laatste deel van de actieve fase van het dier. Verwijder aan het einde van de blootstelling het water plus sacharoseoplossingen uit elke kooi en meet het waterverbruik voor elk dier. Voor CNO levering, vul de flessen met vijf milliliter water plus 1%sucrose en een milligram per kilogram CNO.

Plaats de fles in dezelfde positie als tijdens de suikerwateratcliatieperiode tijdens het laatste deel van de actieve fase, verwijder de flessen en meet de hoeveelheid water, sacharose en CNO verbruikt zoals aangetoond. Aan het einde van het experiment, oogst de behandelde dierlijke hersenen in verse fixatief. Na 9 tot 12 uur beschermt cryoprotect het hersenweefsel in een 30%sucroseoplossing.

Wanneer de hersenen zinken, sectie het monster op een cryostat. Wanneer alle hersensecties zijn verkregen en de niet-specifieke binding is geblokkeerd, worden de weefselmonsters incubeer gemaakt met een anti-c-Fos-antilichaamoplossing bij vier graden Celsius 's nachts met constante agitatie. De volgende ochtend was je de monsters met drie wasbeurten van vijf minuten in verse PBS per wasbeurt voordat je de monsters uitbroedt met een passend fluorescentiegeconjugeerd secundair antilichaam.

Na een uur bij kamertemperatuur en constante agitatie beschermd tegen licht, verkrijgen van digitale beelden van de gelabelde weefselsecties door fluorescentie confocale microcroscopie. Na het laden van de beelden in ImageJ, schets op meten van de gebieden van Adeno-geassocieerde geïnfecteerde mCherry positieve cellen en kwantificeren van het aantal C vals-positieve cellen binnen dit gebied om het aantal geactiveerde cellen per gebied te verkrijgen. Repetitive CNO delivery using eyedrops elicits a robust inductie of cFos expression in most infected neurons demonstrating that the effectiveness of CNO delivery is sustained during the repetitive exposure.

Bovendien wordt een significante inductie van cFos waargenomen in monsters die twee uur na de CNO-behandeling zijn verzameld in vergelijking met monsters die zes uur na blootstelling aan CNO zijn verkregen, wat aangeeft dat veranderingen die door CNO worden veroorzaakt, tijdsafhankelijk zijn. Het dagelijkse waterverbruik plus CNO is niet significant anders in vergelijking met het totale volume van het regelmatige water verbruikt. Evenzo wordt de hoeveelheid water plus 1% sacharose verbruikt tijdens de nacht niet beïnvloed door de toevoeging van CNO, noch zijn verschillen in de dagelijkse consumptie van zowel water plus CNO, en water plus sacharose plus CNO waargenomen over een vijf-daagse experimentele periode.

Vergelijkbaar met de toepassing van CNO-oogdruppels, wordt een robuuste inductie van cFos waargenomen na twee, maar niet zes uur toegang tot het drinkwater van CNO. Bovendien is er een duidelijke doeltreffendheidsdrempel voor CNO, aangezien een lage CNO-dosis geen cFos-activering uitlokt in vergelijking met een zoutbeheersingscontrole, terwijl hogere doses een robuuste en vergelijkbare cFos-inductie veroorzaken. We raden aan om een dosisresponsanalyse uit te voeren om de laagste CNO-dosis te definiëren die de neuronale activering niet significant vermindert en het gebruik clozapine als ligand overweegt.

Hier hebben we aangetoond met behulp van CNO-gemedieerde cFos inductie als gevolg van neuronale activering. Echter, deze protocol kan gemakkelijk worden aangenomen om elektrofysiologische analyse of gedragstests. DREADD-technologie is een krachtig hulpmiddel voor de afstandsbediening van neuronale activiteit, en het ontwerpen van alternatieve strategieën voor CNO levering.

We zullen het spectrum van opties voor experimentele instellingen en mogelijke klinische interventies vergroten.