Synthese, Functionalization en karakterisatie van Fusogenic poreuze Silicon nanodeeltjes voor Oligonucleotide levering

Dit protocol beschrijft de synthese van een nanodeeltjessysteem dat genen in vivo kan dempen door siRNAs met een hoge efficiëntie te leveren. Door simpelweg het richten van peptide en de siRNA-payload uit te wisselen, kunnen de fusogene nanodeeltjes worden gebruikt als een potentiële therapeutische formulering voor ziekten die in vivo genmodulatie vereisen. We hebben eerder resultaten gepubliceerd met behulp van het fusogene nanoplatform tegen gram-positieve bacteriële infecties door het uitschakelen van een gen dat codeert voor ontsteking in macrofagen om chronische ontsteking te beëindigen.

Voorafgaand aan het uitvoeren van deze procedure, monteer een Teflon etscel met een silicium wafer in een drie-op-een fluorzuuroplossing. Voer een wisselstroom van een vierkante golfvorm uit met een lage stroomdichtheid van 50 milliamperes per centimeter in het kwadraat gedurende 0,6 seconden en een hoge stroomdichtheid van 400 milliamperes per vierkante centimeter gedurende 0,36 seconden herhaald gedurende 500 cycli. Zodra de ets is voltooid, verwijder de cel uit het circuit, en zorgvuldig uitspoelen van de fluorzuur oplossing met behulp van een spuit.

Spoel vervolgens drie keer met ethanol. Om de poreuze laag uit de siliciumwafer te tillen, vul je eerst de put van de etscel met 10 milliliter van een één-op-29 hydrofluorzuuroplossing. Voer vervolgens een constante van 3,7 milliamperes per centimeter in het kwadraat gedurende 250 seconden.

Zodra de ets klaar is, verwijdert u de cel uit het circuit. De poreuze siliciumlaag kan zichtbare rimpelingen hebben, wat wijst op loslating van de kristallijne siliciumwafer. Spoel voorzichtig de fluorzuuroplossing uit en spoel drie keer elk met ethanol en water.

Met behulp van een pipetpunt scheurt u stevig de omtrek van de poreuze siliciumlaag voor een volledige loslating. Met behulp van ethanol, verzamel de poreuze silicium fragmenten, of chips, uit de Teflon etscel in een weegboot. Breng de chips vervolgens over op een glazen flacon voor opslag.

Vervang vervolgens de ethanol in de glazen flacon met de poreuze siliciumchips door twee milliliter RNase-vrij water. Sluit de flacon stevig af en sluit de flacon af met Parafilm. Plaats de glazen flacon in een sonicatorbad en hangt zodanig dat het volume van poreuze siliciumchips volledig onder het oppervlak van het waterbad wordt ondergedompeld.

Om aanzienlijk waterverlies tijdens sonicatie te voorkomen, plaatst u een volumetrische kolf gevuld met water, omgekeerd zodat de opening van de kolf het oppervlak van het waterbad raakt. Vervolgens, sonicate de poreuze silicium chips voor 12 uur op 35 kilohertz met een RF-vermogen van 48 watt. Na de sonicatie, plaats de glazen flacon op een vlakke ondergrond voor een uur om de grotere deeltjes te vestigen op de bodem.

Verzamel vervolgens de supernatant met behulp van een pipet. Voeg in een glazen flacon 72,55 microliter DMPC-oplossing, 15,16 microliter DSPE-PEG-oplossing en 19,63 microliter DOTAP-oplossing toe en meng door pipetteren. Plaats de flacon in een rookkap met een losse dop om het oplosmiddel 's nachts te laten verdampen.

De gedroogde film zal een troebele, harde, gel-achtige stof aan de onderkant van de flacon. Plaats vervolgens een microcentrifugebuis met 150 microliter poreuze siliciumnanodeeltjes in een eerder voorbereid ijssonleenbad. Onder een ultrasoon van 15 minuten, voorzichtig pipette 150 microliters siRNA en 700 microliters van twee-molaire calciumchloride in de poreuze silicium nanodeeltjes.

Verwijder de buis met een milliliter van siRNA-geladen calcium-gecoate poreuze silicium nanodeeltjes uit de sonicator. Vul een breed bekerglas met gedeïioneerd water. Week een polycarbonaat membraan en vier filtersteunen door ze op het wateroppervlak te drijven.

Monteer vervolgens een liposoom extrusiekit door de instructies van de fabrikant op te volgen. Hydrateer vervolgens de gedroogde lipidefilm in de glazen flacon met een milliliter van de met siRNA geladen poreuze siliciumnanodeeltjes met siRNA-gecoate calciumhoudende siliciumnanodeeltjes. Pipette totdat alle lipiden van de onderkant van de flacon zijn opgetild en een troebele, homogene oplossing wordt waargenomen.

Voeg een magnetische roerstaaf toe aan de glazen flacon en plaats de flacon op een hete plaat om de deeltjes te verwarmen tot 40 graden Celsius terwijl de oplossing magnetisch gedurende 20 minuten wordt roeren. Bevestig hierna een lege spuit aan één kant van de extruder. Vul vervolgens een andere spuit met een milliliter van de met lipide gecoate poreuze siliciumnanodeeltjesoplossing en bevestig de spuit aan de andere kant van de extruder.

Begin de extrusie door het duwen van de zuiger in langzaam om de deeltjes te duwen van de ene spuit, door het polycarbonaat membraan, en in de andere spuit. Herhaal dit 20 keer. Verzamel vervolgens de geëxtrudeerde deeltjes in een microcentrifugebuis.

Bereid een peptide voorraad met een een-milligram-per-milliliter peptide concentratie in RNase-vrij water. In de microcentrifuge buis met de fusogene lipide-gecoate poreuze silicium nanodeeltjes, voeg 100 microliters van de peptide voorraad, en pipet voorzichtig. Houd de buis 20 minuten statisch op kamertemperatuur.

Om overtollig peptide of siRNA en andere excipiënten te verwijderen, was je in een centrifugaalfilter van 30 kilodalton door een uur lang 5.000 g bij kamertemperatuur te draaien. Centrifuge nog twee keer met een milliliter PBS onder dezelfde instellingen. Na centrifugatie, resuspend de laatste peptide-geconjugeerde fusogeen lipide-gecoate poreuze silicium nanodeeltjes in PBS bij de gewenste concentratie.

De deeltjes kunnen gedurende ten minste 30 dagen worden opgeslagen bij min 80 graden Celsius. Een succesvolle synthese van fusogene poreuze silicium nanodeeltjes moet een homogene, licht ondoorzichtige oplossing produceren die gedurende 30 dagen kan worden opgeslagen en ontdooid zonder structurele veranderingen te veroorzaken. Het niet optimaliseren van de verhouding en concentratie, evenals herhaalde vriesdooi cycli kan leiden tot aggregatie bij het laden.

Aangezien de deeltjes worden geëxtrudeerd, moet de gemiddelde hydrodynamische diameter van de fusogene poreuze siliciumnanodeeltjes, gemeten door dynamische lichtverstrooiing, ongeveer 200 nanometer zijn en het gemiddelde zetapotentieel ongeveer positieve zeven millivolt. Na oppervlaktewijziging met targeting peptiden moet de totale diameter minder dan 230 nanometer bedragen en daalt het gemiddelde zeta-potentieel tot min 3,4 millivolt. Fusie kan worden bevestigd door de fusogene lipiden te labelen met de lipofiele fluorofofoër DiI en de in vitro lokalisatie met behulp van confocale microscopie te observeren.

Succesvolle fusie wordt waargenomen wanneer de lipiden van de fusogene poreuze siliciumnanodeeltjes de DiI overbrengen naar het plasmamembraan en gelokaliseerd zijn onafhankelijk van lysosomen. Mislukte fusie toont de DiI lokalisatie binnen het cytoplasma van de cel en co-lokalisatie met lysosomen. Dit fusogene nanodeeltjessysteem wordt nu gebruikt voor therapeutische toepassingen in niet alleen bacteriële infecties, maar ook bij kanker adjuvante therapie en kanker immunotherapie.

Dit protocol kan verder worden geoptimaliseerd om meer te laden dan siRNAs. Het fusogene nanodeeltjessysteem heeft potentieel aangetoond bij het laden en leveren van grotere anionische ladingen, zoals mRNAs en CRISPR/Cas9 complexen.