Het gebruik van Deuteriumoxide als niet-invasief, niet-dodelijk hulpmiddel voor de beoordeling van lichaamssamenstelling en waterverbruik bij zoogdieren

Met behulp van dit protocol kan deuteriumoxide of D2O, een niet-radioactieve, stabiele isotoop van water, worden gebruikt om de lichaamssamenstelling en het waterverbruik te schatten. Deze techniek is niet invasief en kan daarom worden gebruikt om de lichaamssamenstelling bij bedreigde soorten te beoordelen, evenals bij mensen en huisdieren. Een unieke toepassing van de deuteriumoxide verdunningstechniek is de mogelijkheid om het waterverbruik van vrijuitlopende dieren te meten met hoge heroveringspercentages of van sociaal gehuisveste dieren.

Hoewel anesthesie niet nodig is, kan het voor degenen die niet bekend zijn met het geven van onderhuidse injecties gemakkelijker zijn om de dieren te verdoven voordat het deuteriumoxide wordt geleverd. Demonstreren van de procedure met Sarah Hooper en ik zal Amanda Eshelman en Ashley Cowan, veterinaire studenten, en Alicia Roistacher, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium. Om een 50-milliliter voorraad oplossing van negen gram per liter verzilt deuteriumoxide te maken, eerst wegen 450 milligram van farmaceutische kwaliteit natriumchloride, en registreren van de exacte hoeveelheid vier decimalen.

Breng al het zout in een gesteriliseerde 100-milliliter bekerglas, en meet 50 gram groter dan of gelijk aan 99,8% deuteriumoxide in een steriele, afgestudeerde cilinder. Schrijf de exacte hoeveelheid deuteriumoxide op vier decimalen en breng het deuteriumoxide over op het steriele bekerglas natriumchloride. Bevestig vervolgens een naald van 20 meter aan een niet-steriliserend, steriel schijffilter met submicronporiën die zijn uitgerust met een spuitvat van 10 milliliter en steek de naald in het septum van een steriele, lege flacon van 100 milliliter.

Bevestig een vacuümbuis aan een naald van 22 meter en steek de naald in het septum van de 100-milliliter flacon. Laad vervolgens 10 milliliter isosmotische sterkte natriumchloride in het spuitvat en zet het vacuüm langzaam aan totdat de deuteriumoxideoplossing langzaam in de flacon begint te filteren. Blijf de deuteriumoxidevoorraadoplossing in het spuitvat gieten totdat het volledige volume van 50 milliliter is gefilterd.

Na bevestiging van een gebrek aan respons op teen knijpen in een verdoofde vleermuis, gebruik maken van een alcohol prep pad om het uropatagium schoon over de interfemorale ader, en laat de ontsmette staart membraan te drogen. Breng een dunne laag vaseline aan over de interfemorale ader en gebruik een naald van 29 meter om het dorsale gedeelte van de interfemorale ader te doorboren. Gebruik dan plastic natriumheparine capillaire buizen om 100 microliter bloed te verzamelen.

Om een adequate vermenging van het hele bloed met de natriumheparine te garanderen, rolt u voorzichtig elke buis na de bloedafname voordat u het labelt. Na het bepalen van de massa van deuteriumoxide in gram te injecteren, laad een insulinespuit uitgerust met een 29-gauge naald met de juiste hoeveelheid deuteriumoxide. Weeg de deuterium-geladen insulinespuit en naald, het registreren van het gewicht tot vier decimalen, en injecteren het gehele volume van deuteriumoxide onderhuids over de dorsale heup regio van de verdoofde vleermuis.

We raden u aan een precisieschaal met een antistatisch ontwerpschild te gebruiken en ervoor te zorgen dat u zich terugtrekt op de zuiger om negatieve druk te garanderen voordat u gaat injecteren. Direct na de injectie, weeg de nu lege insulinespuit en naald, en registreert het gewicht tot vier decimalen. Gebruik binnen 30 minuten na de bloedafname een hematocrietcentrifuge om gedurende vijf minuten op elke capillaire buis op 10.000 keer g te draaien.

Met behulp van een scherpe schaar, snijd de plastic capillaire buis tussen het hele bloed en het plasma, en gebruik een 200-microliter pipet om het plasma direct te verdrijven in een gelabelde, 500-microliter opbergbuis. Verzamel en bewaar na de evenwichtsperiode nog eens 100 microliter bloed uit de interfemorale ader, zoals zojuist is aangetoond. Voor FTIR spectrofotometrie analyse, stel de temperatuur van een zandbad op 60 graden Celsius om distillatie te vergemakkelijken, en voeg 50 microliter van elk plasma monster en standaard in individuele 1,5-milliliter conische microcentrifuge doppen.

Houd de microcentrifuged ondersteboven, schroef de 1,5 milliliter conische microcentrifugebuis op de dop en plaats de omgekeerde buis minimaal 12 uur in contact met het zand in het zandbad. De volgende ochtend, plaats een nieuwe, schone dop op elke buis, en puls de microcentrifuge buizen voor 10 seconden in een microcentrifuge. Installeer een vloeibare transmissiecel in de FTIR-spectrometer en vul de cel met methanol.

Sluit de injectiepoort aan en vul de cel langzaam met achtergrondwater terwijl u de methanolspuit zorgvuldig verwijdert om het risico op luchtbellen te verminderen. Bevestig buizen aan de uitvoerpoort om de monsters na analyse te verwijderen en open de FTIR-spectrometersoftware. Stel de parameters in op basis van de tabel en verzamel een achtergrondmonster met behulp van het verdunningslichaam, 0,22 micrometer gefilterd, gedestilleerd water.

Injecteer 40 microliter van een nul delen per miljoen deuteriumoxide standaard, en registreren en opslaan van de spectra als een komma-gescheiden waarden bestand. Na het injecteren en opslaan van de spectra van alle normen om een standaardcurve te creëren, injecteer 40 microliter van elk gedestilleerd monster in de vloeibare transmissiecel en sla de spectra op. Met een bekende evenwichtstijd kunnen het totale lichaamswater, de vetvrije massa en de massa van het lichaamsvet voor wild gevangen grote bruine vleermuizen en gevangen grote bruine vleermuizen worden bepaald.

Een negatieve lichaamsvetmassa kan worden berekend als gevolg van een of meer van de volgende redenen: het niet ontvangen van de volledige dosis deuteriumoxide, torpid worden tijdens de evenwichtsfase, abnormaal grote vetmassa's en minimale magere massa's hebben, of minder dan drie tot 5% lichaamsvet hebben zoals bepaald door dubbele x-ray absorptiometrie. Hier wordt een representatief percentage lichaamsvet weergegeven dat wordt bepaald door de verdunningstechniek van de baarmoederoxide in vergelijking met dubbele röntgenaborptiometrie. De twee technieken zijn goed gecorreleerd, met de lichaamsvetmassa die sterke correlaties tussen het lichaamsvet en lichaamsgewicht en met de deuteriumoxide verdunningstechniek niet constant over of onderschatting van de lichaamsvetmassa toont.

De deuteriumoxideverdunningsmethode is eerder gevalideerd bij katten, en de techniek werd aangepast om het dagelijkse waterverbruik van sociaal gehuisveste katten tijdens elk voedingsblok van het experiment te kunnen meten. Vergeet niet dat deze techniek alleen moet worden uitgevoerd op gezonde dieren en dat u nauwkeurig moet wegen, registreren, en leveren van de volledige dosis deuteriumoxide aan elk dier. Een secundaire methode voor het bepalen van de lichaamssamenstelling, zoals volledige karkasanalyse of DEXA, kan worden voltooid om de deuteriumoxidetechniek te valideren.

Deze techniek stelde ons in staat om een sociaal gehuisveste kat te identificeren die abnormaal grote hoeveelheden water consumeerde zonder elke kat te scheiden om hun waterverbruik te meten.