Verbetering van de Engraftment van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten via een voorbijgaande remming van de activiteit van Rho kinase

Onze gegevens tonen aan dat voorbijgaande remming van Rho-kinase activiteit hechting, overleving en engraftment van hiPSC-afgeleide cardiomyocyten verbetert nadat ze in de infarcted animal hearts zijn getransplanteerd. Wij bieden een eenvoudige, goedkope, terwijl zeer efficiënte methode om de engraftment van getransplanteerde hiPSC-afgeleide cardiomyocyten in de gewonde dierenharten te verhogen. Aangezien deze techniek celengraftment tarieven veilig en efficiënt in acuut hartinfarct en hartfalen kan verbeteren, draagt het voor de resulterende verbeteringen in hartfunctie, vasculaire en apoptose bij.

Hoewel we onze protocollen alleen in hiPSC's hebben getest, kunnen deze methoden worden toegepast op andere soorten cellen, zoals embryonale stamcellen, mesenchymale stamcellen, et cetera. De dosis en duur van de behandeling met Y-27632 is van cruciaal belang. De visuele demonstratie kan tot in detail aantonen dat alle belangrijke stappen in het protocol, wat gunstig is voor iemand die nog nooit heeft uitgevoerd deze techniek voor.

Op dag 21 na hiPSC-CM differentiatie, aspirate het medium en was de cellen met steriele PBS een keer. Incubeer de cellen met 0,5 milliliter cel-dissociatie enzymen per goed bij 37 graden Celsius gedurende vijf tot zeven minuten. Na de incubatietijd, herhaaldelijk pipette de cel suspensie met behulp van een een-milliliter pipet om grondig te scheiden van de cellen.

Voeg vervolgens een milliliter neutraliserende oplossing toe aan elke put, verzamel het celmengsel in een 15-milliliter centrifugebuis en centrifuge drie minuten bij 200 keer g. Gooi na de centrifugatie de supernatant weg en verleg de cellen opnieuw in de neutraliserende oplossing. Herplant de cellen vervolgens op gelatinegecoate, zes-putplaten met een dichtheid van twee miljoen cellen per put.

Vervang na 24 tot 48 uur het kweekmedium voor drie tot vijf dagen door het zuiveringsmedium. Voorafgaand aan transplantatie, cultuur de cellen in de behandeling groep voor 12 uur in RB-plus medium aangevuld met 10-micromolar Y-27632. Voer ook verapamil-behandeling uit op de cellen in het RB-plus-medium met één micromole verapamil gedurende 12 uur.

Na de behandeling was je de hiPSC-CMs één keer met PBS en ontcubeer je de cellen met 0,5 microliter cel-dissociatieenzymen gedurende maximaal twee minuten. Herhaaldelijk pipette de cel suspensie met behulp van een een-milliliter pipet om grondig te scheiden van de cellen. Neutraliseer vervolgens de cellen met een neutraliserende oplossing, verzamel het celmengsel in een centrifugebuis van 15 milliliter en vercentrifugeer gedurende drie minuten op 200 keer g.

Na centrifugatie, resuspend de cellen in PBS bij een concentratie van 0,1 miljoen cellen per vijf microliters ter voorbereiding op injectie. Onmiddellijk na de hartinfarctinductie, injecteren vijf microliters van de controle hiPSC-CMs, Y-27632-geprefeerde hiPSC-CMs, verapamil-behandelde hiPSC-CMs, of een gelijk volume van PBS in de muis myoiumcard op elke site, een in het infarct gebied en twee in de gebieden rond het infarct. 12 uur voor het uitvoeren van calcium voorbijgaande en contractiliteit detectie, voeg 10-micromolar Y-27632, 100-nanomolar RA, een micromolar verapamil, of een gelijk volume van PBS in de cultuur medium van hiPSC-CMs.

Gooi vervolgens het medium weg en was de plaat één keer met PBS. Verander het medium in een red-free DMEM die 0,02 gewicht per volume per volume van oppervlakteactieve polyol, vijf-micromolar calcium indicator, en de overeenkomstige Y-27632, RA, verapamil, of een gelijk volume van PBS, en incubeer de plaat op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten. Na de incubatie, gooi de supernatant, was de cellen met de kleurstof-vrije DMEM drie keer, en laat het medium rusten voor 30 minuten om de mapping kleurstof te ont-esterificeren.

Plaats de celgezaaide coverslip in een open badkamer en steek de kamer in een microincubatiesysteem dat met een automatische temperatuurregelaar in evenwicht is tot 37 graden Celsius. Doorsfuus met de oplossing van Tyrode en voeg continu RI, RA of PBS toe aan de perfusieoplossing. Gebruik een omgekeerde fluorescentie microscoop en een laser scanning hoofd om spontane calcium voorbijgaande record door gebruik te maken van een x-t lijn scan.

Noteer de spontane samentrekking van hiPSC-CMs met behulp van de differentiële interferentie contrast functionaliteit van de confocale microscoop. De overlevingskans van de getransplanteerde cellen werd bevestigd door de verhoogde luciferase activiteit. De verhoogde menselijke cardiale troponine T en menselijke nucleaire antigeenexpressie toonden aan dat Y-27632 voorbehandeling de celengraftment aanzienlijk kon verbeteren.

Y-27632 voorbehandelde cellen vertoonden een grotere en meer gedefinieerde staafvormige cytoskeletale structuur. Ook verminderde Y-27632 voorbehandeling TUNEL-positieve cellen, wat wijst op de verminderde getransplanteerde hiPSC-CM apoptose in vivo. Westelijke vlek stelde voor dat Y-27632 voorbehandeling verhoogde uitdrukking van integrin bèta-1 en N-cadherin en verminderde de uitdrukking van fosfo-myosin lichte ketting 2.

Deze verandering werd genormaliseerd 72 uur na Y-27632 terugtrekking. In vitro mouse HL-1 celbevestigingsexperimenten gaven aan dat de voorbehandeling van Y-27632 de hiPSC-CM-hechting ten opzichte van HL-1 aanzienlijk verhoogde. Y-27632 voorbehandeling verminderde de contractiele kracht, de piek calcium voorbijgaande fluorescentie, en de calcium voorbijgaande duur.

Y-27632 voorbehandeling gereguleerd cardiomyocyte contractie door het aanzienlijk verminderen van de expressie van cTnI en cTnT. Vergelijkbaar met Y-27632, verapamil voorbehandeling verhoogde de luciferase activiteit en het aantal hcTnT / HNA dubbel-positieve cellen. De belangrijkste stap is om cellen in de behandelingsgroep gedurende 12 uur te kweken in Rb-plus medium aangevuld met 10-micromolar Y-27632.

Op basis van deze methode is een langzame afgifte van Y-27632 om de cel- engraftmentsnelheid verder te verhogen een veelbelovende strategie. Deze techniek maakt de weg vrij voor onderzoekers om de fysiologie en functie van hiPSC van CMs in vivo te bestuderen. Het kleine molecuul CHIR99021 dat wordt gebruikt voor cardiomyocytendifferentiatie is gevaarlijk, wat ademhalingsirritatie kan veroorzaken.

Gelieve niet in te nemen of inademen door een manier.