Een convergerende strategie voor het genereren van een virtueel Gesequentieerde cDNA-Bibliotheek van niet-gerefereerde Pacifische oesters

De belangrijkste vraag die we met deze methode willen beantwoorden, is hoe we RNA-monsters van materiaal dat op lokale voedselmarkten is gekocht, kunnen gebruiken voor het klonen van biotechnologisch relevante genen? Hier gebruiken we Pacific oesters als een case study voor het aantonen van deze aanpak en mogelijke verdere toepassing. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat conventionele genoom- of cDNA-sequencing van de oestermonsters kan worden omzeild.

In plaats daarvan werden sequenties van de cytochrome c oxidase subunit I en NADH dehydrogenase vergeleken met openbaar beschikbare referentiesequenties van de Pacifische oester om het meest verwante exemplaar te selecteren. De cDNA die uit dit monster wordt bereid, kan direct worden gebruikt voor het klonen van biotechnologisch relevante genen, die kunnen worden geselecteerd aan de hand van de openbare sequentie-informatie. Het aantonen van de procedure zal Yongmei Lyu en Yuquan Li, twee afgestudeerde studenten van de Glycomics en Glycan Bioengineering Research Center aan de Nanjing Agricultural University.

Om oesterweefsel monster voor te bereiden, gebruik maken van een gesteriliseerde scalpel uit te snijden ongeveer 100 milligram homogeen zacht weefsel uit de geschatte geometrische centrum van elke oester monster. Breng het monster over in een mortel gevuld met 50 milliliter vloeibare stikstof. Maal het flash-bevroren oesterweefsel tot een fijn poeder.

Weeg 75 milligram bevroren weefsel van elk monster af in een steriele centrifugebuis van 1,5 milliliter en meng met één milliliter guanidinium thiocyanaat-fenol extractiereegmiddel. De meest kritieke stap van deze procedure is de RNA-extractiestap. Om RNA-afbraak te minimaliseren, is het essentieel om de tijd tussen het oogsten van het oesterweefsel en de RNA-extractie te verminderen.

Centrifugeren het monster op 14, 000 keer g en vier graden Celsius gedurende 15 minuten. Breng de supernatant naar een nieuwe 1,5-milliliter centrifuge buis, voeg 200 microliter chloroform, en meng grondig op een vortex mixer gedurende 10 tot 15 seconden totdat het mengsel wordt melkachtig wit. Vervolgens centrifuge gedurende 15 minuten zoals eerder gedaan.

Breng met een pipet van 200 microliter de bovenste waterige laag, zonder de interfase te verstoren, voorzichtig over in een nieuwe 1,5-milliliter centrifugebuis. Voeg 500 microliter isopropylalcohol toe aan de centrifugebuis en draai zachtjes om de monsters te mengen. Laat de monsters dan 20 minuten op ijs staan.

Centrifuge op 14,000 keer g en vier graden Celsius gedurende acht minuten, en verwijder de supernatant. Resuspend de pellet in een milliliter van 75%ethanol, en centrifuge op 14,000 keer g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Verwijder alle supernatant, en herhaal de was in ethanol.

Droog de pellets zes minuten op kamertemperatuur. Los vervolgens de gedroogde RNA-pellet op in 25 microliters met DEPC-behandeld water en houd de buis op ijs. Gebruik de RNA-monsters binnen 24 uur.

Om een cDNA-bibliotheek te genereren, moet u eerst een reactiemengsel voor elk RNA-monster bereiden in een PCR-buis met 300 microliter door oplossingen toe te voegen volgens het manuscript. Voeg een microliter van het geëxtraheerde RNA-monster in de buis. Incubeer het mengsel in een PCR thermocycler gedurende 60 minuten bij 42 graden Celsius, en verhoog de temperatuur vervolgens tot 95 graden Celsius gedurende vijf minuten.

Bewaar de gegenereerde cDNA-bibliotheek tot 12 maanden bij min 20 graden Celsius. Voeg eerst een microliter van de gegenereerde cDNA-bibliotheek toe aan buizen met PCR-mengsels, bereid volgens het manuscript. Plaats de PCR-buizen in de PCR-thermocycler en voer de PCR-versterking uit met een eerste denaturatiestap en 35 PCR-reactiecycli bestaande uit een annealing-stap, een verlengingsstap en een denaturatiestap volgens het manuscript.

Voer na de cycli een laatste rekstap uit gedurende vijf minuten. Gebruik vijf microliters van het PCR-product om de kwaliteit te controleren door agarose gel elektroforese. Observeer het versterkte COX1- of ND-gen als één band op respectievelijk 759 of 748 basisparen.

Om de rest van het PCR-product te zuiveren, voegt u 100 microliter DNA-bindende buffer toe met hoge concentraties chaotropische zouten aan elk monster. Vortex kort om de inhoud te mengen. Plaats een zuiveringskolom in een twee-milliliter centrifugebuis.

Pipette het reactiemengsel in de kolom. Plaats de buis met de gemonteerde kolom in een centrifuge op 14,000 keer g gedurende een minuut bij kamertemperatuur. Na het weggooien van het filtraat uit de twee-milliliter centrifuge buis, was twee keer met 700 en 400 microliter wasoplossing W2 door centrifugeren op 14.000 keer g.

Verwarm vervolgens een milliliter gedeïniseerd water tot 65 graden Celsius in een metalen blokverwarming. Breng de kolom in een nieuwe 1,5-milliliter centrifugebuis en pipet 25 microliter van het voorverwarmde gedeïmiseerde water naar het midden van het witte kolommembraan. Laat het membraan een minuut weken bij kamertemperatuur.

Vercentrifugeren vervolgens de buis met de kolom op 14.000 keer g gedurende een minuut bij kamertemperatuur. Gooi de kolom weg en bewaar het gezuiverde PCR-product voor maximaal 12 maanden bij min 20 graden Celsius. Optioneel kunnen de COX1- of ND-reverse primers ook worden gebruikt voor bidirectionele sequencing.

Gebruik voor Sanger sequencing de relevante COX1 of ND forward primer. Na het ophalen van de sequencing resultaten, vergelijk de sequenties met de genoom sequentie van de Pacific oyster referentie stam met behulp van de NCBI Nucleotide BLAST online tool. Gebruik respectievelijke voorwaartse en omgekeerde primers van MgUGD- en MgUXS-genen om door PCR te versterken en te zuiveren zoals eerder gedaan.

Na het uitbroeden van gezuiverde PCR-producten met spijsverteringsbuffer, bereid de voorverteerde pET-30a vector door het oplossen van 500 nanogram pET-30a in een 1,5-milliliter centrifuge buis, en voeg gedeïmiseerd water aan de top tot 16 microliter. Voeg vervolgens twee microliters van 10-keer geconcentreerde spijsverteringsbuffer en één microliter elk van de 20 eenheden beperking endonucleases Nde1 en Xho1 in de buis. Broed het mengsel drie uur lang uit op 37 graden Celsius.

Voeg daarna een microliter van een-eenheid alkalische fosforschisede toe en incubeer een uur lang bij 37 graden Celsius. Plaats vervolgens de buis in een voorverwarmde metalen blokverwarming op 75 graden Celsius gedurende 10 minuten om de alkalische fosforfosfatase te activeren. Na het kweken van E.coli BL21 cellen met de MgUGD en MgUXS genen, breng de cultuur in 400-milliliter LB medium in een twee-liter schudden kolf, en plaats het op een shaker bij 200 rpm bij een temperatuur van 37 graden Celsius.

Controleer na drie uur de optische dichtheid op een fotometer op een golflengte van 600 nanometer en zorg ervoor dat deze een absorptie van ongeveer 0,5 bereikt. Verlaag vervolgens de shakertemperatuur tot 20 graden Celsius. Voeg 400 microliter van een molaire IPTG toe om de expressie van de recombinante eiwitten gedurende drie uur te induceren.

Na het oogsten van de cellen, verstoren de cellen door sonicatie gedurende 20 minuten op vier graden Celsius. Centrifuge op 14,000 keer g en vier graden Celsius gedurende 20 minuten, en het verzamelen van de supernatant in een nieuwe buis voor de activiteit test. Na de activiteitstest, blus de reacties door 20 microliter methanol en 40 microliter van chloroform toe te voegen aan de MgUXS- en MgUGD-mengsels.

Vortex de mengsels van het monster, en centrifugeren op 14,000 keer g gedurende zes minuten en vier graden Celsius. Verzamel de bovenste waterige laag van elke buis in nieuwe buizen voor MALDI-TOF massaspectrometrie. In dit experiment werden sequentieuitlijning van de COX1- en ND-gensequenties van een zeer uiteenlopende specimen vergeleken met de referentie-Pacifische oestersoort.

De rode pijlen tonen nucleotideverschillen tussen de referentiesequentie en de volgorde van de verkregen cDNA-monsters. De sequenties van de COX1- en ND-genen van een nauw verwant oesterexemplaar vertonen een lage divergentie van de referentie-Pacifische oestersoort. MALDI-TOF massaspectrometrie toont een succesvolle toepassing van de cDNA-bibliotheek om de industrieel relevante genen MgUGD en MgUXS te klonen.

Het gelbeeld identificeert ook UDP-glucuronic zuur en UDP-xylose gegenereerd door de enzymatische werking van de achtereenvolgend uitgedrukte en gezuiverde MgUGD en MgUXS. Deze methode vereist geen perfecte match tussen de referentiesequentie en de verkregen markersequenties en moet de onderzoeker het vertrouwen geven om met niet-gereferenced oesters te werken. In principe kan deze methode worden toegepast op elk niet-gerefereerd biologisch monster waarvoor sequenties van een nauw verwante referentiesoort openbaar beschikbaar zijn.

Deze methode stelt niet-deskundige onderzoekers in staat om gemakkelijk toegang te krijgen tot genetisch materiaal van potentieel biologisch belang en maakt de weg vrij voor meer wetenschappers om te werken met gemakkelijk toegankelijke maar onvolledig geïdentificeerde biologische monsters.