VirWaTest, een gebruiksmethode voor het opsporen van virussen in water monsters

Enterische virussen zijn meestal te vinden in verschillende aquatische reservoirs, waaronder grondwater, stilstaand water, beken, rivieren en r water. Ze worden geassocieerd met gezondheidsrisico's en zijn verantwoordelijk voor infecties bij de mens. Enterische virussen veroorzaken vaak gastro-enteritis en worden meestal overgedragen via de fecaale-orale route.

Andere door water overgedragen ziekten veroorzaken acute hepatitis door hepatitis A-virus en hepatitis E-virussen, met aanzienlijke bijbehorende sterfte, vooral met betrekking tot hepatitis E bij zwangere vrouwen. De feitelijke protocollen voor het toezicht op de waterkwaliteit die zijn voorgesteld voor humanitaire contexten zijn ontworpen om bacteriën zoals E.Coli te houden als een indicator van fecale verontreiniging. Maar het is al bekend dat er geen correlatie is met andere micro-organismen zoals virussen die beter bestand zijn tegen veel activeringsprocessen.

Tot nu toe werden virussen in humanitaire crisissituaties opgespoord door bestaande protocollen aan te passen aan de omstandigheden van die contexten en monsters te verzenden naar referentielaboratoria voor moleculaire detectie van virussen. Er zijn behoefte aan methoden om virale ziekteverwekkers en virale indicatoren op te sporen in het oogpunt van het verminderen van de risico's voor de volksgezondheid, het voorkomen van uitbraken en het verhogen van de efficiëntie van humanitaire interventies. Wij stellen een methode voor de detectie van virussen in 10 liter watermonsters die is verdeeld in drie stappen: Virale concentratie, nucleïnezuur extractie, en virale detectie.

Al deze stappen zijn aangepast aan de methoden die momenteel in ons laboratorium worden gebruikt, en kunnen worden uitgevoerd in het oogpunt met behulp van draagbare reagentia en apparatuur, het produceren van de afhankelijken van de voeding en vriezers. Ook is een conserveermiddeloplossing toegevoegd aan de methode om de stabiliteit van nucleïnezuren te rechtvaardigen voor verzending naar referentielaboratoria indien nodig. De methode die wij voorstellen heet VirWaTest en is ontwikkeld in samenwerking met GenIUL en Intermon Oxfam.

Voordat met de proef wordt begonnen, moet het aantal te testen monsters in aanmerking worden genomen voor de bereiding van reagentia en materiaal. Het wordt aanbevolen om twee replica's van elk watermonster te verzamelen om representatieve resultaten te verkrijgen. Meerdere monsters kunnen tegelijkertijd worden getest als de juiste hoeveelheid materiaal beschikbaar is.

Reagentia en materialen moeten worden bereid en verpakt voordat ze worden verplaatst of verzonden naar de plaats waar de methode nodig is. De lijst van materialen en kleine apparatuur die moeten worden verpakt wordt beschreven in tabel een. Bereid een bacteriofaag MS2-bestand voor dat aan elk watermonster moet worden toegevoegd als procescontrole door de bijbehorende ISO-methode te volgen.

Verdeel vervolgens 10 microliter van een suspensie met 10 tot 10 platformunits die vooraf in buizen van 10 mL zijn gemaakt en laat het water drogen. Er is één buis per watermonster nodig. Bereid bovendien één buis met 10 mLs steriel gedestilleerd water per verzameld monster.

Voor de voorgevlobbele magere melkoplossing moet u een buis met de magere melk, een plastic zak met rits met het zeezout en een plastic fles met het gedestilleerde water bereiden. Voor pH-aanpassing moet u een buis met citroenzuur, een buis met natriumhydroxide en twee plastic recipiënten met 25 en 50 mLs gedestilleerd water bereiden. Voor elk te testen watermonster moet u een conditioneringszakje maken door de zeezouten en het citroenzuur toe te voegen aan een plastic zak met rits, en een conserveringsoplossing door de lysebuffer en nucleïnezuurconserveringsmiddel toe te voegen aan een buis van 5 mL.

Tot slot, bereid vier neutraliserende zakjes, het toevoegen van macht wasmiddel aan vier rits plastic zakken. Voor elk te extra watermonster moet u één buis van vijf mL met magnetische deeltjes en ethanol en drie buizen van 2 mL met 500, 600 en 200 microliter wasbuffers één, twee en drie en één buis met elutiebuffers voorbereiden. Twee verschillende nucleïnezuurextracties kunnen gelijktijdig worden geanalyseerd in elke PCR-test als een Newell-thermocycler wordt gebruikt.

Voor alle PCR-tests, bereid moleculaire biologie water. Bereid mengsels voor die twee primers en één specifiek bewijs voor elk doelvirus bevatten volgens de in het protocol beschreven volumes en concentraties. Voeg voor elk virus de aangegeven volumes toe in buizen één tot acht van een buizenlade.

Snijd de strip, verdelen in twee strips. Buizen één tot vijf en buizen zes tot acht. Voor elk virus, luchtdroge DNA-suspensies met 10 tot 5, 10 tot 7, en 10 tot 9 en bekende kopieën vooraf gemaakt in buizen zes, zeven en acht.

Dit concentratieprotocol is gebaseerd op het principe van organische flocculatie waarmee de lage pH en de hoge geleidbaarheidsconditie de magere melkeiwitten aandrijft om zich te organiseren in flocs waar de virussen op absorberen. Zodra de flocs zijn geregeld, kunnen ze gemakkelijk worden verzameld. Verzamel een 10 liter watermonster in een platte emmer voorzien van een deksel.

Als het verzamelen van een pijp, laat het water lopen voor een paar seconden voor het verzamelen van het water. Het is belangrijk om duidelijke emmers te gebruiken om pellets te visualiseren. Zoek naar een vlakke ruimte in een frisse plaats ver van direct zonlicht Plaats een magnetische roerder aangesloten op een batterij onder de emmer ondersteuning en plaats de emmer met het watermonster op elke steun.

Heroverweeg het citroenzuur en de natriumhydroxide en schud totdat ze volledig zijn opgelost. Giet 500 mLs gedestilleerd water in een stand-up zak en plaats de zak op een magnetische roerder. Voeg de inhoud van een zeezout zakje en de inhoud van een magere melkbuis en roer gedurende vijf minuten op gemiddelde snelheid.

Pas de pH van de flocculated magere melk met citroenzuur en natriumhydroxide aan op een pH tussen 3,4 en 3,6. Schakel de magneetroerder uit en zorg ervoor dat de flocs zichtbaar zijn. Een zaklamp kan helpen bij het visualiseren van de flocs.

Laat een roerende magneet in het water vallen. Zet de magnetische roerder op maximale snelheid en zet hem aan. Voeg 10 mLs gedestilleerd water toe aan een procesgestuurde buis.

Omkeren het een paar keer en giet de oplossing in het water. Giet de inhoud van een monster conditionering zakje in het water en roer gedurende vijf minuten. Zorg ervoor dat de pH van het watermonster, dat tussen 3,4 en 3,6 moet liggen.

Pas indien nodig de pH aan. Voeg 100 mLs voorgevloekte magere melkoplossing toe, sluit de emmer af met het deksel en laat het water acht uur roeren bij minimale snelheid. Zet na acht uur de magneetroerder uit en laat de flocs minstens vijf uur langer wachten.

Met een systeem op basis van het gebruik van een pipet controller, een plastic buis, en een paar pipetten, gooi de supernatant, oppassen niet te verstoren de flocs op de emmer bodem. Wanneer het waterniveau op het punt staat de roermagneet te bereiken, knijpt u in de plastic buis om de waterstroom te stoppen en de pipet uit de emmer te verplaatsen. Schud de emmer om de flocs opnieuw op te zetten en giet ze in een stand-up plastic zak.

Laat de flocs genoegen nemen met een extra uur. Voorzichtig aanzuigen het water supernatant met behulp van een pipet vermijden om de flocs verstoren. Aspirate de flocs met behulp van een pipet en breng ze in een conische buis.

Noteer het uiteindelijke volume van het monsterconcentraat en breng 1 mL over naar een buis met de conserveermiddeloplossing. De suspensie kan worden gebruikt om de nucleïnezuurextractie in het veld uit te voeren, of naar een referentielaboratorium worden verzonden voor verdere analyse. Het water dat tijdens het verzamelen van de flocs wordt weggegooid, moet vóór verwijdering worden behandeld.

Voeg de inhoud van een neutraliserend middelzakje toe aan de emmer met het afgedankte water. Meng het water en laat het nog dertig minuten staan. Gooi vervolgens het behandelde water weg als algemeen afval.

De magnetische deeltjes kunnen met behulp van een magnetische pipet van de ene buis naar de andere worden overgebracht. Wen aan de werking van een magnetische pipet voordat u de extractie uitvoert. Schik de buizen met het reagens dat nodig is voor extractie in een rek.

Dat wil zeggen, van links naar rechts:bindende buffer, wasbuffers en elutiebuffer. Breng 1 mL monsterconcentraat over aan de buis met de bindingsbuffer met behulp van een plastic wegwerppipet. Keer de buis tien keer om om de oplossing te optimaliseren.

Broed de oplossing tien minuten lang op kamertemperatuur uit terwijl u continu mengt met behulp van een solo orbitale of handmatig. Verzamel de magnetische deeltjes met behulp van een magnetische pipet en een schone punt die kan worden hergebruikt voor de drie wasbuffers en laat de magnetische deeltjes in de buis met wasbuffer een. Was ze door zachtjes schudden van de oplossing met de tip voor dertig seconden en verzamel ze.

Herhaal deze wasprocedure voor het wassen van buffers twee en drie. Verzamel de magnetische deeltjes in wasbuffer drie en laat ze los in de buis met de elutiebuffer. Gooi vervolgens de tip weg.

Broed de oplossing vijf minuten lang op kamertemperatuur terwijl u continu mengt met behulp van de solo orbitale. Vervang de punt op de magnetische pipet door een en verzamel alle magnetische deeltjes uit de elutiebuffer. Gooi de punt weg met de deeltjes eraan.

Het nucleïnezuur blijft in de elutiebuffer, die moet worden opgeslagen voor verdere analyse of verzending. Gebruik een vijf-buis en een drie-buis strip bereid om menselijke adenovirussen te detecteren. Voeg water, PCR mix, en nucleïnezuur extratie aan buizen een tot en met vijf volgens het protocol.

Voeg daarna water en PCR mix toe aan buizen zes tot en met acht. Plaats beide strips in de thermocycler en selecteer de juiste run. Zodra de run is voltooid, verzamelt u de resultaten en analyseert u verkregen gegevens.

Alleen wanneer virale tests negatief hebben geresulteerd, moet MS2-detectie worden uitgevoerd. Gebruik buisstrips die zijn voorbereid voor MS2-detectie en selecteer het juiste thermische profiel voor de PCR. De VirWaTest magnetische nucleïnezuur extractie werd vergeleken met QIAgen virale RNA, nagebootst door het testen van watermonsters verrijkt met menselijke adenovirussen en MS2.

Reductie test p-waarde toont aanzienlijk hogere virale terugvorderingen met behulp van VirWaTest dan QiAgen als een extractie methode voor beide virussen getest. De ontwikkelde methode voor virale concentratie werd in het veld getest met de medewerking van Oxfam-wasteams in Bangui, Centraal-Afrikaanse Republiek en in Pedernales, Ecuador, die watermonsters verzamelden, geconcentreerd door de ontwikkelde concentratiemethode toe te passen, en stuurde ze naar het laboratorium in Barcelona voor nucleïnezuurextractie en virale kwantificering. In Ecuador werden menselijke adenovirussen aangetroffen in alle geteste monsters, terwijl één op de vijf monsters die in Bangui werden verzameld en geconcentreerd positief op menselijke adenovirussen testte.

De ontwikkelde methode is nuttig gebleken toen het werd geëvalueerd door wasteams van Oxfam Intermon in Bangui, Centraal-Afrikaanse Republiek en door een ander team in Pedernales, Ecuador. VirWaTest kan deel uitmaken van een systeem voor vroegtijdige waarschuwing of kan worden gebruikt bij het onderzoek naar uitbraken door organisaties die betrokken zijn bij watersanering. Deze apparatuur vergemakkelijkt de analyse van virale ziekteverwekkers in water en de verbetering van het beheer van de waterveiligheid met als doel het verminderen van incidenten van virale ziekten in humanitaire crisiscontexten.