Name: VirWaTest, een gebruiksmethode voor het opsporen van virussen in water monsters (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Leer VirWaTest voor het detecteren van enterische virussen in watermonsters. Deze draagbare methode verbetert de waterveiligheid in humanitaire contexten door virale pathogenen op de plaats van gebruik op te sporen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

VirWaTest was een onderzoeksproject gefinancierd door het HIF (humanitair innovatiefonds) programma van ELHRA (het verbeteren van leren & onderzoek voor humanitaire hulp). De auteurs erkennen de WASTEAMS die vriendelijk in deze studie hebben samengewerkt. De analyse van samples in Ecuador werd gefinancierd door Oxfam Ecuador en Dirección de Recheran de la Universidad de Las Americas (AMB. BRT. 17.01). S. Bofill-Mas is een Serra-Hunter Fellow aan de Universiteit van Barcelona.

1. voorbereiding en verpakking
Opmerking: de te verpakken materialen/apparatuur staat in tabel 1. Gebruik handschoenen om de reagentia te hanteren die nodig zijn voor de procesbeheersing, de concentratie reagentia, de nucleïnezuurextractie reagentia en de detectie reagentia. Draag een beschermende bril om de reagentia te hanteren die nodig zijn voor de extractie van nucleïnezuur.
<ol><li>Procescontrole
	<ol>
<li>Bereid ms2 bacteriofaag Stock Culture (American Type Culture Collection [ATCC] 15597-B1) met 1 x 1010 Pfu/ml in het laboratorium volgens de ISO-procedure 10705-1:199514.</li>
		<li>Vervolgens, aliquot 10 μL van de suspensie per buis met 1 x 108 Pfu in 10 ml buisjes en laat het water verdampen bij 37 °c. Gebruik één buis per watermonster.</li>
		<li>Bereid bovendien één buisje met 10 mL steriel gedestilleerd water per verzameld monster.</li>
	</ol></li>
	<li>Concentratie reagentia
	<ol>
<li>Gebruik voor de preflocated magere melkoplossing (PSM) de volgende bedragen om 5 10 L watermonsters te concentreren.<ol>
<li>Maak een plastic buisje met 5 g magere melk.</li>
			<li>Maak een rits plastic zak met 16,66 g zeezouten.</li>
			<li>Maak een plastic flesje met 500 mL gedistilleerd water.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bereid de reagentia die nodig zijn voor de pH-aanpassing. Gebruik de volgende bedragen om de pH van de PSM en van 5 10 L watermonsters aan te passen.<ol>
<li>Voeg 5 g citroenzuur 1-hydraat toe aan een plastic buisje van 10 mL. Let op: citroenzuur veroorzaakt ernstige irritatie wanneer het in aanraking komt met de ogen. Als dit gebeurt, spoel het oog voorzichtig met water gedurende enkele minuten. Als de irritatie aanhoudt, een arts raadplegen.</li>
			<li>Zet 2 g natriumhydroxide in een plastic buisje van 10 mL. Let op: natriumhydroxide kan ernstige brandwonden en oogbeschadigingen veroorzaken. Na inslikken de mond spoelen. Geen braken opwekken. Als het in aanraking komt met de ogen, voorzichtig afspoelen met water gedurende enkele minuten. Vervolgens, deskundig medisch advies inwinnen.</li>
			<li>Breng 25 mL steriel gedestilleerd water in een plastic bakje.</li>
			<li>Plaats 50 mL steriel gedestilleerd water in een plastic bakje.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bereid het monster conditionerings zakje dat wordt gebruikt voor de flocculatie, de conserverings oplossing die wordt gebruikt om de nucleïnezuren te behouden en het neutraliserende sachet om het afgedankte water en de materialen te neutraliseren. Gebruik de volgende bedragen voor elk 10 L-watermonster dat moet worden getest.<ol>
<li>Zet 15 g zeezouten en 8 g citroenzuur 1-hydraat in een rits plastic zakje voor het conditionerings zakje.</li>
			<li>Voeg 2 mL lysisbuffer (tabel met materialen) en 0,3 ml nucleïnezuur conserveringsmiddel (Inhoudsopgave) toe aan een buisje van 5 ml. Let op: lysisbuffer bevat guanidine thiocyanaat en Triton X-100. Contact met zuur bevilt giftig gas, en het is schadelijk bij inslikken, geïnhaleerd of in aanraking komt met de huid. Na inslikken de mond spoelen. Geen braken opwekken. Als het in aanraking komt met de huid, wassen met veel water. Vervolgens, deskundig medisch advies inwinnen. Het conserveringsmiddel voor nucleïnezuur veroorzaakt huid-en oogirritatie en is schadelijk bij inslikken. Als het in aanraking komt met de huid of de ogen, spoelen met overvloedig water gedurende enkele minuten. In ieder geval, vooral bij inslikken en zich onwel voelen, deskundig medisch advies inwinnen.</li>
			<li>Zet 40 g wasmiddel poeder in vier rits plastic zakken. Let op: poeder reinigingsmiddel veroorzaakt oogirritatie. Als het in aanraking komt met de ogen, spoelen met overvloedig water gedurende enkele minuten. Als de irritatie aanhoudt of bij inslikken, een arts raadplegen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Reagentia voor nucleïnezuur extractie
	<ol>
<li>Plaats 50 μL magnetische deeltjes (tabel met materialen) en 1 ml ethanol 96% in een buisje van 5 ml die de bindende buffer vormen. Let op: de magnetische deeltjes buffer bevat natrium azide, die een giftig gas vormt wanneer het in contact komt met zuren of zware metalen ionen en giftig is bij inname of wanneer het in aanraking komt met de huid. Indien ingenomen of in aanraking met de huid, spoel de mond of de huid met overvloedig water en deskundig medisch advies inwinnen. Ethanol is een licht ontvlambare vloeistof en damp en veroorzaakt ernstige oogirritatie. Verwijderd houden van hitte, hete oppervlakken, vonken en andere ontstekingsbronnen. Als het in aanraking komt met de huid of de ogen, spoel dan af met overvloedig water. In geval van inname van grote hoeveelheden water en/of bij inademing, ga naar buiten in de frisse lucht. In ieder geval, deskundig medisch advies inwinnen.</li>
		<li>Voeg respectievelijk 500 μL, 600 μL en 200 μL wasbuffers 1, 2 en 3 (tabel met materialen) toe aan drie buisjes van 2 ml. Let op: wasbuffers bevatten teruggehydrolyseerd thiocyanaat en teruggehydrolyseerd chloride, die schadelijk zijn bij inademing of inslikken en de huid en ogen irriteren. Contact met zuren vrijkomen zeer giftig gas. Als ze in aanraking komen met de huid of ogen, spoel dan af met overvloedig water. Na inslikken de mond met overvloedig water afspoelen. Geen braken opwekken. Altijd deskundig medisch advies inwinnen.</li>
		<li>Voeg 120 μL elutie buffer (tabel met materialen) toe aan een buis van 0,5 ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Reagentia voor HAdV en MS2 detectie Opmerking: twee verschillende nucleïnezuurextractie reacties kunnen gelijktijdig in elke PCR-test worden geanalyseerd als een 8-well Thermocycler wordt gebruikt. Voor alle PCR-assays, bereid moleculaire biologie water aligeciteerd in 1,5 mL buizen.<ol>
<li>
HAdV-detectie
		<ol>
<li>Bereid een mengsel met 10 μL 22,5 μM AdF voorwaarts primer, 10 μL van 22,5 μM AdR reverse primer en 5 μL 11,25 μM AdP-sonde (tabel 2).</li>
			<li>Voeg 2,5 μL van de mix toe aan buizen 1 tot en met 8 van een buis strook. Laat het drogen bij kamertemperatuur, sluit de buizen en houd ze beschermd tegen het licht.</li>
			<li>Snijd de strook die het verdeelt in twee strips: buizen 1-5 en buizen 6-8.</li>
			<li>Bereid een seriële verdunning van DNA-suspensies die de nucleotide-sequentie van de versterkte HAdV-regio bevatten. Lucht drogen 1 μL suspensies met 1 x 105, 1 x 107en 1 x 109 GC/ml in buizen 6-8. Opmerking: Houd de buizen met de primers, sonde en de Luchtgedroogde suspensies beschermd tegen licht.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
MS2-detectie
		<ol>
<li>Bereid een mengsel met 10 μL 25 μM pecson-2F voorwaartse primer, 10 μL 25 μM pecson-2R omgekeerde primer en 2,5 μL 25 μM PecP-2 sonde (tabel 2).</li>
			<li>Voeg 2,25 μL van de mix toe aan buizen 1 tot en met 8 van een buis strook. Laat het drogen bij kamertemperatuur, sluit de buizen en houd ze beschermd tegen het licht.</li>
			<li>Snijd de strook die het verdeelt in twee strips: buizen 1-5 en buizen 6-8.</li>
			<li>Ga verder zoals in stap 1.4.1.4 maar gebruik een standaard suspensie ontworpen voor MS2 in plaats daarvan.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. virale concentratie
Opmerking: gebruik handschoenen te allen tijde tijdens de monsterverzameling, reagens voorbereiding, flocculatie, vlokken-inzameling en afvalverwijderings procedures. Draag een beschermende bril tijdens de reagens bereidings procedure.
<ol><li>Monsterverzameling
	<ol>
<li>Verzamel een watermonster van 10 L in een vlakke bodem emmer met deksel. Verzamel voor elk monster minimaal twee replicaten. Opmerking: het is belangrijk om duidelijke emmers te gebruiken om de pellet te visualiseren. Als het watermonster gesuspendeerd materiaal bevat (bijv. zand, algen), laat het dan sediment en verzamel vervolgens het water supernatant in een nieuwe emmer.</li>
		<li>Registreer het verzamelde volume, evenals de locatie en de afhaaldatum, voor elk watermonster.</li>
		<li>Zet een magneetroerder aangesloten op een batterij onder een emmer ondersteuning en plaats de emmer met het watermonster op zijn steun. Let op: Zoek een vlakke ondergrond op een frisse plek en bewaar de emmers met de watermonsters van direct zonlicht.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding van reagentia
	<ol>
<li>
pH-aanpassing reagentia
		<ol>
<li>Giet het citroenzuur poeder en de natriumhydroxide pellets in de potten met respectievelijk 25 en 50 mL gedistilleerd water.</li>
			<li>Schud voorzichtig met de hand totdat het citroenzuur en het natriumhydroxide volledig zijn opgelost. Let op: giet het water niet over de natriumhydroxide pellets. Giet in plaats daarvan de natriumhydroxide pellets over het water.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Preflocated magere melk
		<ol>
<li>Plaats een opbergtas op een magneetroerder en giet er 500 mL gedistilleerd water in. Laat een roer magneet in de zak vallen en zet de magneetroerder aan.</li>
			<li>Giet de inhoud van een zeezout zakje en een magere melk buis in de opbergtas en roer gedurende 5 minuten op middelhoog toerental om ze op te lossen.</li>
			<li>Voeg 3 mL citroenzuur toe aan de PSM-oplossing met behulp van een Pasteur-pipet om ervoor te zorgen dat de pH tussen 3,4 en 3,6 ligt. Meet de pH van de PSM-oplossing met behulp van pH-indicator stroken. Voeg kleinere hoeveelheden citroenzuur en natriumhydroxide toe naarmate de pH dichter bij 3,5 komt.</li>
			<li>Schakel de magnetische roerder uit en zorg ervoor dat de vlokken zichtbaar zijn. Gebruik een zaklamp om de flocs te visualiseren.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Flocculatie
	<ol>
<li>Laat een roer magneet in het watervallen, stel de magnetische roerder op de maximumsnelheid in en zet hem aan. Zorg ervoor dat de roer magneet begint te draaien.</li>
		<li>Voeg 10 mL gedistilleerd water toe aan een procescontrole buis. Inverteer de buis een paar keer om de virale voorraad te hydrateren en giet de oplossing in het water.</li>
		<li>Giet de inhoud van één monster conditionerings zakje in het water en roer gedurende 5 min.</li>
		<li>Meet de pH van het watermonster met behulp van pH-indicator stroken. Voeg enkele druppels citroenzuur of natriumhydroxide toe aan het watermonster om ervoor te zorgen dat de pH tussen 3,4 en 3,6 ligt. Voeg kleinere hoeveelheden citroenzuur en natriumhydroxide toe naarmate de pH dichter bij 3,5 komt.</li>
		<li>Voeg 100 mL van de PSM-oplossing toe met een 100 mL verpakking.</li>
		<li>Sluit de emmer met het deksel, zet de magnetische roerder op minimale snelheid, en laat het water roeren voor 8 uur.</li>
		<li>Schakel de magnetische roerder uit en laat het water nog minstens 5 uur staan om de vlokken te laten vestigen.</li>
	</ol></li>
	<li>Floc collectie
	<ol>
<li>Bouw een sifoning-systeem bestaande uit een pipet controller, twee pipetten en een plastic buis om het water supernatant te zuigen voor het ontladen van het water op de flocs.<ol>
<li>Bevestig een 10 mL tape-end pipet aan de pipet controller. Bevestig de pipetpunt vervolgens aan de plastic buis.</li>
			<li>Verwijder het filter van een 10 mL pipet met open punt met een pincet en bevestig de pipet aan de plastic buis.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Plaats een lege emmer op de vloer.</li>
		<li>Dompel de punt van de pipet met open punt onder in het water. Zorg ervoor dat u het dicht bij het wateroppervlak houdt om te voorkomen dat de flocs worden verstoord. Zuig het water supernatant tot het de tape-end pipet bereikt.</li>
		<li>Knijp de plastic buis aan het uiteinde vast op de pipet met de tape en maak deze los van de pipet.</li>
		<li>Plaats de buis in een lege emmer. Laat de druk op de buis los om het water in de lege emmer te laten stromen.</li>
		<li>Knijp de plastic buis om de waterstroom te stoppen wanneer het waterniveau op het moment is om de roer magneet te bereiken en beweeg de pipet weg van de emmer.</li>
		<li>Schud de emmer om de vlokken te hervatten en giet ze in een opstaande plastic zak van 500 ml. Laat de vlokken zich 1 uur meer vestigen.</li>
		<li>Zuig de water supernatant voorzichtig op met een pipet van 50 mL en een handmatige pipet controller, waarbij de flocs niet storend worden.</li>
		<li>Aspireren de vlokken met behulp van een 100 ml pipet en breng ze over naar een 50 ml gegradueerde centrifugebuis. Noteer het uiteindelijke volume van het monster concentraat en breng 1 mL ervan over in een buisje van 5 mL met de conserverings oplossing, met behulp van een Pasteur-pipet. Opmerking: het is belangrijk dat de centrifugebuis is afgestudeerd, zodat het uiteindelijke volume van het geconcentreerde monster zo nauwkeurig mogelijk en geregistreerd kan worden gemeten.</li>
		<li>Voer de nucleïnezuur extractie in het veld. U ook de conserverings oplossing met de virussen bewaren bij 20-30 °C gedurende maximaal 15 dagen of deze naar een referentielaboratorium verzenden voor verdere analyse.</li>
	</ol></li>
	<li>Afvalverwijdering en hergebruik van materiaal
	<ol>
<li>Voeg de inhoud van een neutraliserend middel zakje toe aan de emmer met het afgedankte water. Meng het water, en laat het nog 30 min.</li>
		<li>Gooi het behandelde water weg als algemeen afval.</li>
		<li>Plaats de pipetten en de plastic buis in de emmer. Vul de emmer met water en giet de inhoud van één neutraliserend middel zakje.</li>
		<li>Was ze minstens 30 minuten om ze te steriliseren en spoel ze met overvloedig schoon water om eventueel overgebleven neutraliserend middel te verwijderen.</li>
	</ol></li>
</ol>3. nucleïnezuur extractie
Opmerking: gebruik handschoenen en draag altijd een beschermende bril tijdens de nucleïnezuur extractieprocedure.
<ol><li>
Magnetische pipet bewerking
	<ol>
<li>Raak vertrouwd met de werking van de magnetische pipet voordat u de extractie uitvoert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Nucleïnezuur extractie
	<ol>
<li>Verdeel de buisjes met de reagentia die nodig zijn voor de extractie in een rek van links naar rechts: bindings buffer, wasbuffers en elutie buffer. Stel het juiste aantal buisjes in volgens het aantal monsters of replicaten dat wordt geanalyseerd.</li>
		<li>Breng 1 mL monster concentraat over in de buis met de bindings buffer met behulp van een wegwerp Pasteur-pipet. Inverteer de buis 8x tot 10x om de oplossing te homogeniseren.</li>
		<li>Inbroed de oplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur tijdens het continu mengen, hetzij met behulp van een op zonne-energie aangedreven orbitaal of handmatig.</li>
		<li>Verzamel de magnetische deeltjes met behulp van de magnetische pipet en een schone tip, die kan worden hergebruikt voor de drie wasbuffers.</li>
		<li>Laat de magnetische deeltjes in de buis met 500 μL wasbuffer 1. Was ze door het zachtjes schudden van de oplossing met de tip voor 30 s en Verzamel ze.</li>
		<li>Breng de magnetische deeltjes over in de buis met 600 μL wasbuffer 2. Was ze door het zachtjes schudden van de oplossing met de tip voor 30 s en Verzamel ze.</li>
		<li>Breng de magnetische deeltjes over in de buis met 200 μL wasbuffer 3. Was ze door het zachtjes schudden van de oplossing met de tip voor 30 s en Verzamel ze.</li>
		<li>Laat de magnetische deeltjes in de buis met de elutie buffer los en gooi de punt weg.</li>
		<li>Inincuberen de oplossing bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten tijdens het continu mengen, met behulp van de orbitale zonne-energie. Opmerking: het mengen van de magnetische deeltjes in de elutie buffer is een cruciale stap. In geval van gebrek aan een orbitaal, continu mengen met de hand tijdens de incubatietijd.</li>
		<li>Vervang de punt op de magnetische pipet door een nieuwe en verzamel de magnetische deeltjes uit de elutie buffer. Zorg ervoor dat u de magnetische deeltjes uit de elutie buffer volledig verwijdert, omdat ze de moleculaire detectiemethoden kunnen verstoren.</li>
		<li>Gooi de punt weg met de daaraan gehechte deeltjes. Ga verder met de PCR-analyse, verzend de elutie buffer naar een referentielaboratorium of bewaar de elutie buffer bij 4 °C voor verdere analyse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. virale detectie met een batterij-aangedreven acht-buis real-time Thermo cycler
Opmerking: gebruik handschoenen en draag altijd een beschermende bril tijdens de nucleïnezuur detectieprocedure. Vervang de handschoenen voor nieuwe bij het uitvoeren van een nieuw PCR-experiment om kruisbesmetting te voorkomen.
<ol><li>
HAdV kwantitatieve PCR
	<ol>
<li>Voeg 14 μL Nuclease vrij water toe aan de buisjes 2, 4 en 5.</li>
		<li>Voeg 4 μL PCR-mix toe aan buizen 1-5.</li>
		<li>Voeg 14 μL nucleïnezuur extractie toe van Monster A tot buis 1 en 14 μL van monster B tot buis 3.</li>
		<li>Voeg 2 μL geëxtraheerde nucleïnezuren toe van Monster A tot buis 2 en 2 μL van monster B tot buis 4. Sluit de vijf-buis strip.</li>
		<li>Voeg 14 μL Nuclease vrij water toe aan de buizen 6, 7 en 8.</li>
		<li>Voeg 4 μL van deze mix toe aan buizen 6, 7 en 8, en sluit ze.</li>
		<li>Plaats beide stroken in de thermocycler en selecteer de juiste uitvoering (tabel 3).</li>
		<li>Gooi de waterbuis weg en houd het geëxtraheerde nucleïnezuur in de vriezer, indien mogelijk, of, zo niet, op een verse plek beschermd tegen licht in het geval er een tweede test moet worden uitgevoerd.</li>
		<li>Reinig de micropipetten, het rek, het werk materiaal en alle materiaal goed met een nucleïnezuur reiniger en gooi de plastic zak met de gebruikte tip, handschoenen en buizen weg. Let op: nucleïnezuur Remover is een zeer licht ontvlambare vloeistof en stoom. Adem de spray nevel niet in en Vermijd contact van de vloeistof met de ogen of de huid. Anders onmiddellijk spoelen met overvloedig water en deskundig medisch advies inwinnen.</li>
		<li>Verzamel de resultaten en analyseer de verkregen gegevens.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
MS2 kwantitatieve PCR
	<ol>
<li>Voeg 14 μL Nuclease vrij water toe aan de buisjes 2, 4 en 5.</li>
		<li>Voeg 4 μL PCR-mix en 0,5 μL reverse transcriptase-enzym toe aan buizen 1-5.</li>
		<li>Voeg 14 μL nucleïnezuur extractie toe van Monster A tot buis 1 en 14 μL van monster B tot buis 3.</li>
		<li>Voeg 1 μL geëxtraheerde nucleïnezuren toe van Monster A tot buis 2 en 1 μL van monster B tot buis 4. Sluit de vijf-buis strip.</li>
		<li>Voeg 15,5 μL Nuclease vrij water toe aan de buisjes 5, 6, 7 en 8 en sluit ze af.</li>
		<li>Voeg 4 μL PCR-mix en 0,5 μL reverse transcriptase-enzym toe aan de buisjes 6, 7 en 8.</li>
		<li>Plaats beide stroken in de thermocycler en selecteer de juiste uitvoering (tabel 3).</li>
		<li>Ga verder zoals beschreven in de stappen 4.1.8 naar 4.1.10.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>The Sphere Project. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Sphere+Project%3A+Humanitarian+Charter+and+Minimum+Standards+in+Humanitarian+Response%22">The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response</a>. , Practical Action Publishing. Rugby, UK. https://www.spherestandards.org/wp-content/uploads/2018/06/Sphere_Handbook_2011_English.pdf (2011).</li>
<li>Bartram, J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBartram%2C+J+%22Water+Safety+Plan+Manual%3AStep-by-step+risk+management+for+drinking-water+suppliers%22">Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers</a>. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/handle/10665/75141 (2009).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+for+Drinking-water+Quality%22">Guidelines for Drinking-water Quality</a>. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548151_eng.pdf?ua=1 (2011).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%2225+Years+Progress+on+Sanitation+and+Drinking+Water%22">25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water</a>. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/177752/1/9789241509145_eng.pdf?ua=1 (2015).</li>
<li>Girones, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+detection+of+pathogens+in+water+-+The+pros+and+cons+of+molecular+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular detection of pathogens in water - The pros and cons of molecular techniques.</a> Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).</li>
<li>Rodriguez-Manzano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+and+new+fecal+indicators+and+pathogens+in+sewage+treatment+plants%2C+microbiological+parameters+for+improving+the+control+of+reclaimed+water%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water.</a> Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).</li>
<li>Puig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+adenoviruses+and+enteroviruses+in+polluted+waters+by+nested+PCR+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification.</a> Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).</li>
<li>Carter, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterically+infecting+viruses%3A+Pathogenicity%2C+transmission+and+significance+for+food+and+waterborne+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection.</a> Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).</li>
<li>Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Documenting+the+epidemiologic+patterns+of+polyomaviruses+in+human+populations+by+studying+their+presence+in+urban+sewage%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage.</a> Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).</li>
<li>Bofill-Mas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+stability+of+human+adenoviruses+and+polyomavirus+JCPyV+in+wastewater+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).</li>
<li>Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+aspects+of+using+human+adenovirus+as+a+viral+water+quality+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator.</a> Water Research. 96, 308-326 (2016).</li>
<li>Calgua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+one-step+low+cost+procedure+to+concentrate+viruses+from+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples.</a> Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).</li>
<li>Bofill-Mas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effective+method+for+microbial+source+tracking+using+specific+human+and+animal+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses.</a> Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).</li>
<li>International Organization for Standardization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ISO+10705-1%3A1995%3A+Water+quality+-+Detection+and+enumeration+of+bacteriophages+-+Part+1%3A+Enumeration+of+F-specific+RNA+bacteriophages%22">ISO 10705-1:1995: Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages</a>. , https://www.iso.org/standard/18794.html (1995).</li>
<li>Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+factors+influencing+human+viral+pathogens+and+their+potential+indicator+organisms+in+the+blue+mussel%2C+Mytilus+edulis%3A+the+first+Scandinavian+report%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report.</a> Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).</li>
<li>Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+PCR+for+determining+the+infectivity+of+bacteriophage+MS2+upon+inactivation+by+heat%2C+UV-B+radiation%2C+and+singlet+oxygen%3A+Advantages+and+limitations+of+an+enzymatic+treatment+to+reduce+false-positive+results%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).</li>
<li>Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantitation+of+infectious+human+adenoviruses+and+JC+polyomaviruses+in+water+by+immunofluorescence+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay.</a> Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).</li>
<li>Bofill-Mas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effective+method+for+microbial+source+tracking+using+specific+human+and+animal+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses.</a> Journal of Visualized Experiments. (58), e2820(2011).</li>
<li>Gonzales-Gustavson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+efficiency+and+uncertainty+of+skimmed+milk+flocculation+for+the+simultaneous+concentration+and+quantification+of+water-borne+viruses%2C+bacteria+and+protozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa.</a> Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De VirWaTest methode maakt de concentratie van virussen en nucleïnezuur extractie van watermonsters op het punt van gebruik door niet-ervaren gebruikers. Het is een betaalbaar, snel en eenvoudig protocol. De concentratie is gebaseerd op het principe van organische flocculatie met behulp van magere melk, waarbij de lage pH-en hoge geleidbaarheids condities het gebruik van magere melkeiwitten in vlokken tot de virussen maken. Wanneer de vlokken sediment, het is gemakkelijk om ze te verzamelen, waardoor het mogelijk om te c...

In de eerste fasen van humanitaire noodsituaties zijn de toegang tot schoon water, sanitaire voorzieningen en hygiëne van cruciaal belang voor het voortbestaan van de betrokkenen. Daarom is het bewaken van de waterkwaliteit een prioriteit om uitbraken van water te voorkomen. Het is bekend dat verontreinigd water vaak de oorsprong van ziekten is, maar het is vaak moeilijk om de bronnen van virale uitbraken zoals het hepatitis E-virus (HEV) te bepalen, zelfs met de beschikbaarheid van conventionele laboratoriummethoden. De controle van de waterkwaliteit is gebaseerd op de kwantificering van FIB1,2,3,4. Er is echter uitgebreid gedocumenteerd dat er geen correlatie is tussen de afwezigheid van FIB en de aanwezigheid van virale watergedragen pathogenen zoals Rotavirus (RoV), Norovirus (NoV) of HEV5,6. Het gebruik van de water kwaliteitscriteria op basis van FIB kan dus leiden tot een onderschatting van de Risico's die verbonden zijn aan de aanwezigheid van watergedragen virale pathogenen. De surveillance van indicator virussen, zoals humane adenovirussen (hadv), of specifieke pathogenen zou nuttig zijn bij het bepalen van de blootstelling aan virale pathogenen en het identificeren van de potentiële bron van menselijke infectie7,8, 9,10 en bij de validering van de werkzaamheid van sanitaire maatregelen11.
Tot nu toe waren de opsporing van virussen in deze scenario's gebaseerd op vakkundig personeel en complexe logistiek. VirWaTest (virwatest.org) is gericht op de ontwikkeling van een eenvoudige, betaalbare en draagbare methode voor de concentratie en de daaropvolgende opsporing van virussen uit watermonsters op het punt van gebruik.
De virusconcentratie is gebaseerd op het principe van biologische flocculatie van 10 L watermonsters, waardoor virussen worden teruggewonnen in kleinere volumes12,13. De vlokken worden verzameld en toegevoegd aan een buffer die de virussen lyseert en voorkomt de nucleïnezuren van afbraak wanneer ze bewaard bij kamertemperatuur gedurende niet meer dan 2 weken.
De nucleïnezuur extractiemethode is gebaseerd op het gebruik van magnetische deeltjes waaraan de nucleïnezuren worden geadsorreven. Ze kunnen worden overgebracht van de ene spoel buffer naar de andere en uiteindelijk in de elutie buffer met behulp van een magnetische pipet waaraan de deeltjes hechten. Viraal nucleïnezuur suspensies verkregen kunnen worden verzonden naar een referentielaboratorium waar de detectie kan worden uitgevoerd met behulp van moleculaire methoden op basis van PCR. Voor elke extractie van nucleïnezuur worden twee verschillende hoeveelheden getest om enzymatische remming uit te voeren, ontstaan door het monster. Als alternatief, met minimale beschikbaarheid van apparatuur, kunnen PCR-tests worden uitgevoerd op het punt van gebruik. Het gehele proces is ontworpen om onafhankelijk van een stroomtoevoer te worden uitgevoerd (Figuur 1).
Een kwantitatieve PCR-test voor het opsporen van HAdV, uitgescheiden door de mens en gevonden in afvalwater monsters in hoge concentraties, is aangepast om te worden uitgevoerd op het punt van gebruik. HAdV worden gebruikt als menselijke fecale virale indicatoren. Een PCR voor de kwantificering van ms2 bacteriofaag is ook aangepast sinds ms2 wordt gebruikt in virwatest als procesbeheersing. De methode kan worden aangepast voor de opsporing van een virus van belang.
Na de ontwikkeling, de VirWaTest methode is toegepast door de gebruikers in twee verschillende instellingen in de Republiek van Centraal-Afrika (RCA) en Ecuador, het verstrekken van feedback over de toepassing van het protocol in reële situaties.
Voor onze kennis is dit de eerste procedure die de concentratie en opsporing van virussen op het punt van gebruik mogelijk maakt, onafhankelijk van elke voeding, grote apparatuur en Vries-/koelingcondities. Het wordt aanbevolen om twee replicaten van elk watermonster te verzamelen om robuuste resultaten te verkrijgen.

<table><tbody><tr><td>5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX)</td><td>Solis BioDyne</td><td>08-14-00001</td><td>Bevat Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reacties</td></tr><tr><td>8-Microtube Strips with Caps</td><td>dD Biolab</td><td>840637</td><td>Laag profiel, dunne wanden, Aangepast voor Kwantitatieve en Kwalitatieve PCR</td></tr><tr><td>Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer</td><td>GenIUL</td><td>900011674</td><td>Inclusief 12V auto-voedingsadapter</td></tr><tr><td>Bucket Support</td><td>GenIUL</td><td>900011648</td><td>Aluminium ondersteuning</td></tr><tr><td>Bucket, 10 L</td><td>Cater4You</td><td>10LTR</td><td>Polypropilene, Tamperproof, Heldere kleur</td></tr><tr><td>Centrifuge Tube, 50 mL</td><td>LabBox</td><td>CTSP-E50-050</td><td>Polypropylene, Steriel, Gegradueerd, Met Rok</td></tr><tr><td>Citric Acid 1-Hydrate, 500 g</td><td>PanReac AppliChem</td><td>1410181211</td><td>Zuiver, Farma Kwaliteit, 1 Kilogram</td></tr><tr><td>Clear PET Bottle</td><td>LabBox</td><td>FPET-500-088</td><td>Heldere Kleur, PET, Dop Niet Inbegrepen</td></tr><tr><td>Difco Skim Milk, 500 g</td><td>Becton Dickinson</td><td>232100</td><td>Gedehydrateerd</td></tr><tr><td>DNA/RNA Shield, 250 mL</td><td>Zymo Research</td><td>R1100-250</td><td>DNA/RNA Behoud Medium, 250 mL</td></tr><tr><td>Easy9 Pipette Controller</td><td>LabBox</td><td>EAS9-001-001</td><td>0.3 &mu;m filter, Pipetten van 0.1 tot 100 mL, Autoclaveerbare siliconen pipettenhouder</td></tr><tr><td>Eppendorf Tube, 0.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030121023</td><td>Polypropilene, Safe-Lock</td></tr><tr><td>Eppendorf Tube, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td>Polypropilene, Safe-Lock</td></tr><tr><td>Eppendorf Tube, 5 mL</td><td>dD Biolab</td><td>999542</td><td>Polypropyleen, Steriel, Gegradueerd</td></tr><tr><td>Ethanol 96% V/V, 1 L</td><td>Panreac AppliChem</td><td>361085-1611</td><td>Voor UV, IR & HPLC</td></tr><tr><td>Laboratory Tweezers</td><td>LabBox</td><td>FORS-007-002</td><td>Dun, Gebogen Uiteinde, L= 120 mm</td></tr><tr><td>Magnetic Stirrer</td><td>GenIUL</td><td>900017000</td><td>Batterijgevoed</td></tr><tr><td>Marker</td><td>dD Biolab</td><td>929203</td><td>Zwart, Extra Fijne Tip, Waterbestendig, Sneldrogend, Voor Plastic en Glaswerk</td></tr><tr><td>Micro Rota-Rack for Microtubes</td><td>dD Biolab</td><td>37782</td><td>4 Modules, L x B x H= 208 x 100 x 100 mm</td></tr><tr><td>Mini8 Real-Time PCR Cycler</td><td>Coyote Biosciences, China</td><td>Mini-8</td><td>Portable, Werkt met 12V Voedingen of Externe Batterijen, Twee kanalen, Capaciteit voor 8 Buizen</td></tr><tr><td>NucliSens Lysis Buffer</td><td>Biomerieux</td><td>200292</td><td>Reagentia voor maximaal 48 Isolatie, Bewaar bij Omgevingstemperatuur</td></tr><tr><td>Open Tip Serological Pipette, 10 mL</td><td>Deltalab</td><td>900136N</td><td>Steriele, Individueel Verpakt (Papier/Plastic)</td></tr><tr><td>PE Screw Cap PP28</td><td>LabBox</td><td>TP28-004-020</td><td>Voor PET Flessen</td></tr><tr><td>pH Indicator Strip</td><td>LabBox</td><td>WSPH-001-001</td><td>Bereik pH 2.8 tot pH 4.4, 50 Strips per Pakket</td></tr><tr><td>Plastic Test Tube</td><td>Quimikals</td><td>300913</td><td>Inclusief Dop</td></tr><tr><td>Polyethylene Pasteur Pipette</td><td>LabBox</td><td>PIPP-003-500</td><td>Gegradueerd, 7 mL Totaal Volume, Niet-Steriele</td></tr><tr><td>Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL</td><td>Deltalab</td><td>409726</td><td>Schroefdop, Steriele, Gegradueerd tot 100 mL</td></tr><tr><td>Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL</td><td>Deltalab</td><td>409526G</td><td>Schroefdop, Steriele, Gegradueerd tot 50 mL</td></tr><tr><td>Powder Powder Detergent</td><td>-</td><td>-</td><td>Reguliere Poederzeep voor het wassen van kleding</td></tr><tr><td>Power Cables for Magnetic Stirrer</td><td>GenIUL</td><td>900011692</td><td>Verbinding tussen batterijen en magnetische roerders</td></tr><tr><td>QuickPick Magnetic Tool</td><td>BioNobile</td><td>24001</td><td>Handgereedschap voor magnetische deeltjes</td></tr><tr><td>QuickPick Tips in Box</td><td>BioNobile</td><td>24296</td><td>RNase-Vrij, Autoclaveerbaar, 96 Eenheden</td></tr><tr><td>QuickPick XL gDNA Magnetic Particles</td><td>BioNobile</td><td>SN51100</td><td>3.2 mL</td></tr><tr><td>Sea Salts</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9883-500G</td><td>Een kunstmatige zoutmix die de samenstelling van de opgeloste zouten van oceaanwater nauw benadert</td></tr><tr><td>Silicone Tubing</td><td>LabBox</td><td>SILT-006-005</td><td>Rol van 5 Meters, Binnen &oslash; x Buiten &oslash;= 6 x 10 mm</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 - 100.5%</td><td>VWR Chemicals</td><td>28244295</td><td>Pellets, 1 Kg</td></tr><tr><td>Solar Rotary Platform</td><td>SOL-EXPERT Group</td><td>70020</td><td>Acrylaat Plaat, 10 RPM, Ondersteunt tot 300 Gram</td></tr><tr><td>SOLIScript 1-step Probe Kit</td><td>Solis BioDyne</td><td>08-57-00250</td><td>Bevat Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) en 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzym), 250 Reacties</td></tr><tr><td>SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit</td><td>BioTools</td><td>21.141-4197</td><td>Inclusief BioTools's BAW Buffer (Was Buffer 1), BAV3 Buffer (Was Buffer 2 en 3) en BRE Buffer (Elutie Buffer).</td></tr><tr><td>SpinBar Octhaedral Stirring Magnet</td><td>dD Biolab</td><td>045926</td><td>Pivot Ring, L x &oslash; = 38 x 8 mm, Blauw</td></tr><tr><td>Tape-End Serological Pipette, 10 mL</td><td>Deltalab</td><td>PN10E1</td><td>Steriele, Individueel Verpakt (Papier/Plastic)</td></tr><tr><td>Tape-End Serological Pipette, 50 mL</td><td>Deltalab</td><td>900043</td><td>Steriele, Individueel Verpakt (Papier/Plastic)</td></tr><tr><td>Termi-DNA-Tor - Nucleic Acid Remover</td><td>BioTools</td><td>22001-4

virwatest, een gebruiksmethode voor het opsporen van virussen in water monsters

VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples

Virussen die door mensen en dieren worden uitgescheiden, kunnen waterbronnen besmetten en een risico vormen voor de menselijke gezondheid wanneer dit water wordt gebruikt voor het drinken, voedsel irrigatie, wassen, enz. De klassieke fecale bacterie indicator controleert niet altijd op de aanwezigheid van virale pathogenen, dus de opsporing van virale pathogenen en virale indicatoren is relevant om maatregelen van risicobeperking vast te stellen, met name in humanitaire scenario's en in gebieden waar door water overgedragen virale uitbraken frequent zijn.
Op dit moment zijn er verschillende commerciële tests beschikbaar die de kwantificering van fecale indicator bacteriën (FIB) mogelijk maken om te testen op het punt van gebruik. Dergelijke commerciële tests zijn echter niet beschikbaar voor de opsporing van virussen. Voor de opsporing van virussen in milieuwater monsters moet een aantal liters in kleinere volumes worden geconcentreerd. Bovendien vertrouwt de opsporing van virussen eenmaal geconcentreerd op methoden zoals nucleïnezuur extractie en moleculaire detectie (bijv. polymerase-kettingreactie [PCR]-gebaseerde assays) van de virale Genomes.
De hier beschreven methode maakt de concentratie van virussen uit 10 L watermonsters, evenals de extractie van virale nucleïnezuren op het punt van gebruik, met eenvoudige en draagbare apparatuur. Dit maakt het testen van watermonsters op het punt van gebruik voor verschillende virussen mogelijk en is nuttig in humanitaire scenario's, evenals in elke context waarin een uitgerust laboratorium niet beschikbaar is. Als alternatief kan de methode het concentreren van virussen aanwezig zijn in watermonsters en de verzending van het concentraat naar een laboratorium bij kamertemperatuur voor verdere analyse.

Methodeontwikkeling
Deze procedure is ontwikkeld in het laboratorium van virussen verontreinigingen van water en voedsel met de samenwerking van GenIUL en Oxfam Intermón. Het bestaat uit drie verschillende stappen. De eerste, de virale DEELTJESCONCENTRATIE, is een aanpassing van een mageremelkflocculatie methode die eerder werd beschreven12,17,</sup...

Hier presenteren we VirWaTest, wat een eenvoudige, betaalbare en draagbare methode is voor de concentratie en detectie van virussen uit watermonsters op het punt van gebruik.

VirWaTest, een gebruiksmethode voor het opsporen van virussen in water monsters

Viruses excreted by humans and animals may contaminate water sources and pose a risk to human health when this water is used for drinking, food ...

Enterische virussen zijn meestal te vinden in verschillende aquatische reservoirs, waaronder grondwater, stilstaand water, beken, rivieren en r water. Ze worden geassocieerd met gezondheidsrisico's en zijn verantwoordelijk voor infecties bij de mens. Enterische virussen veroorzaken vaak gastro-enteritis en worden meestal overgedragen via de fecaale-orale route.Andere door water overgedragen ziekten veroorzaken acute hepatitis door hepatitis A-virus en hepatitis E-virussen, met aanzienlijke bijbehorende sterfte, vooral met betrekking tot hepatitis E bij zwangere vrouwen. De feitelijke protocollen voor het toezicht op de waterkwaliteit die zijn voorgesteld voor humanitaire contexten zijn ontworpen om bacteriën zoals E.Coli te houden als een indicator van fecale verontreiniging. Maar het is al bekend dat er geen correlatie is met andere micro-organismen zoals virussen die beter bestand zijn tegen veel activeringsprocessen.Tot nu toe werden virussen in humanitaire crisissituaties opgespoord door bestaande protocollen aan te passen aan de omstandigheden van die contexten en monsters te verzenden naar referentielaboratoria voor moleculaire detectie van virussen. Er zijn behoefte aan methoden om virale ziekteverwekkers en virale indicatoren op te sporen in het oogpunt van het verminderen van de risico's voor de volksgezondheid, het voorkomen van uitbraken en het verhogen van de efficiëntie van humanitaire interventies. Wij stellen een methode voor de detectie van virussen in 10 liter watermonsters die is verdeeld in drie stappen: Virale concentratie, nucleïnezuur extractie, en virale detectie.Al deze stappen zijn aangepast aan de methoden die momenteel in ons laboratorium worden gebruikt, en kunnen worden uitgevoerd in het oogpunt met behulp van draagbare reagentia en apparatuur, het produceren van de afhankelijken van de voeding en vriezers. Ook is een conserveermiddeloplossing toegevoegd aan de methode om de stabiliteit van nucleïnezuren te rechtvaardigen voor verzending naar referentielaboratoria indien nodig. De methode die wij voorstellen heet VirWaTest en is ontwikkeld in samenwerking met GenIUL en Intermon Oxfam.Voordat met de proef wordt begonnen, moet het aantal te testen monsters in aanmerking worden genomen voor de bereiding van reagentia en materiaal. Het wordt aanbevolen om twee replica's van elk watermonster te verzamelen om representatieve resultaten te verkrijgen. Meerdere monsters kunnen tegelijkertijd worden getest als de juiste hoeveelheid materiaal beschikbaar is.Reagentia en materialen moeten worden bereid en verpakt voordat ze worden verplaatst of verzonden naar de plaats waar de methode nodig is. De lijst van materialen en kleine apparatuur die moeten worden verpakt wordt beschreven in tabel een. Bereid een bacteriofaag MS2-bestand voor dat aan elk watermonster moet worden toegevoegd als procescontrole door de bijbehorende ISO-methode te volgen.Verdeel vervolgens 10 microliter van een suspensie met 10 tot 10 platformunits die vooraf in buizen van 10 mL zijn gemaakt en laat het water drogen. Er is één buis per watermonster nodig. Bereid bovendien één buis met 10 mLs steriel gedestilleerd water per verzameld monster.Voor de voorgevlobbele magere melkoplossing moet u een buis met de magere melk, een plastic zak met rits met het zeezout en een plastic fles met het gedestilleerde water bereiden. Voor pH-aanpassing moet u een buis met citroenzuur, een buis met natriumhydroxide en twee plastic recipiënten met 25 en 50 mLs gedestilleerd water bereiden. Voor elk te testen watermonster moet u een conditioneringszakje maken door de zeezouten en het citroenzuur toe te voegen aan een plastic zak met rits, en een conserveringsoplossing door de lysebuffer en nucleïnezuurconserveringsmiddel toe te voegen aan een buis van 5 mL.Tot slot, bereid vier neutraliserende zakjes, het toevoegen van macht wasmiddel aan vier rits plastic zakken. Voor elk te extra watermonster moet u één buis van vijf mL met magnetische deeltjes en ethanol en drie buizen van 2 mL met 500, 600 en 200 microliter wasbuffers één, twee en drie en één buis met elutiebuffers voorbereiden. Twee verschillende nucleïnezuurextracties kunnen gelijktijdig worden geanalyseerd in elke PCR-test als een Newell-thermocycler wordt gebruikt.Voor alle PCR-tests, bereid moleculaire biologie water. Bereid mengsels voor die twee primers en één specifiek bewijs voor elk doelvirus bevatten volgens de in het protocol beschreven volumes en concentraties. Voeg voor elk virus de aangegeven volumes toe in buizen één tot acht van een buizenlade.Snijd de strip, verdelen in twee strips. Buizen één tot vijf en buizen zes tot acht. Voor elk virus, luchtdroge DNA-suspensies met 10 tot 5, 10 tot 7, en 10 tot 9 en bekende kopieën vooraf gemaakt in buizen zes, zeven en acht.Dit concentratieprotocol is gebaseerd op het principe van organische flocculatie waarmee de lage pH en de hoge geleidbaarheidsconditie de magere melkeiwitten aandrijft om zich te organiseren in flocs waar de virussen op absorberen. Zodra de flocs zijn geregeld, kunnen ze gemakkelijk worden verzameld. Verzamel een 10 liter watermonster in een platte emmer voorzien van een deksel.Als het verzamelen van een pijp, laat het water lopen voor een paar seconden voor het verzamelen van het water. Het is belangrijk om duidelijke emmers te gebruiken om pellets te visualiseren. Zoek naar een vlakke ruimte in een frisse plaats ver van direct zonlicht Plaats een magnetische roerder aangesloten op een batterij onder de emmer ondersteuning en plaats de emmer met het watermonster op elke steun.Heroverweeg het citroenzuur en de natriumhydroxide en schud totdat ze volledig zijn opgelost. Giet 500 mLs gedestilleerd water in een stand-up zak en plaats de zak op een magnetische roerder. Voeg de inhoud van een zeezout zakje en de inhoud van een magere melkbuis en roer gedurende vijf minuten op gemiddelde snelheid.Pas de pH van de flocculated magere melk met citroenzuur en natriumhydroxide aan op een pH tussen 3,4 en 3,6. Schakel de magneetroerder uit en zorg ervoor dat de flocs zichtbaar zijn. Een zaklamp kan helpen bij het visualiseren van de flocs.Laat een roerende magneet in het water vallen. Zet de magnetische roerder op maximale snelheid en zet hem aan. Voeg 10 mLs gedestilleerd water toe aan een procesgestuurde buis.Omkeren het een paar keer en giet de oplossing in het water. Giet de inhoud van een monster conditionering zakje in het water en roer gedurende vijf minuten. Zorg ervoor dat de pH van het watermonster, dat tussen 3,4 en 3,6 moet liggen.Pas indien nodig de pH aan. Voeg 100 mLs voorgevloekte magere melkoplossing toe, sluit de emmer af met het deksel en laat het water acht uur roeren bij minimale snelheid. Zet na acht uur de magneetroerder uit en laat de flocs minstens vijf uur langer wachten.Met een systeem op basis van het gebruik van een pipet controller, een plastic buis, en een paar pipetten, gooi de supernatant, oppassen niet te verstoren de flocs op de emmer bodem. Wanneer het waterniveau op het punt staat de roermagneet te bereiken, knijpt u in de plastic buis om de waterstroom te stoppen en de pipet uit de emmer te verplaatsen. Schud de emmer om de flocs opnieuw op te zetten en giet ze in een stand-up plastic zak.Laat de flocs genoegen nemen met een extra uur. Voorzichtig aanzuigen het water supernatant met behulp van een pipet vermijden om de flocs verstoren. Aspirate de flocs met behulp van een pipet en breng ze in een conische buis.Noteer het uiteindelijke volume van het monsterconcentraat en breng 1 mL over naar een buis met de conserveermiddeloplossing. De suspensie kan worden gebruikt om de nucleïnezuurextractie in het veld uit te voeren, of naar een referentielaboratorium worden verzonden voor verdere analyse. Het water dat tijdens het verzamelen van de flocs wordt weggegooid, moet vóór verwijdering worden behandeld.Voeg de inhoud van een neutraliserend middelzakje toe aan de emmer met het afgedankte water. Meng het water en laat het nog dertig minuten staan. Gooi vervolgens het behandelde water weg als algemeen afval.De magnetische deeltjes kunnen met behulp van een magnetische pipet van de ene buis naar de andere worden overgebracht. Wen aan de werking van een magnetische pipet voordat u de extractie uitvoert. Schik de buizen met het reagens dat nodig is voor extractie in een rek.Dat wil zeggen, van links naar rechts:bindende buffer, wasbuffers en elutiebuffer. Breng 1 mL monsterconcentraat over aan de buis met de bindingsbuffer met behulp van een plastic wegwerppipet. Keer de buis tien keer om om de oplossing te optimaliseren.Broed de oplossing tien minuten lang op kamertemperatuur uit terwijl u continu mengt met behulp van een solo orbitale of handmatig. Verzamel de magnetische deeltjes met behulp van een magnetische pipet en een schone punt die kan worden hergebruikt voor de drie wasbuffers en laat de magnetische deeltjes in de buis met wasbuffer een. Was ze door zachtjes schudden van de oplossing met de tip voor dertig seconden en verzamel ze.Herhaal deze wasprocedure voor het wassen van buffers twee en drie. Verzamel de magnetische deeltjes in wasbuffer drie en laat ze los in de buis met de elutiebuffer. Gooi vervolgens de tip weg.Broed de oplossing vijf minuten lang op kamertemperatuur terwijl u continu mengt met behulp van de solo orbitale. Vervang de punt op de magnetische pipet door een en verzamel alle magnetische deeltjes uit de elutiebuffer. Gooi de punt weg met de deeltjes eraan.Het nucleïnezuur blijft in de elutiebuffer, die moet worden opgeslagen voor verdere analyse of verzending. Gebruik een vijf-buis en een drie-buis strip bereid om menselijke adenovirussen te detecteren. Voeg water, PCR mix, en nucleïnezuur extratie aan buizen een tot en met vijf volgens het protocol.Voeg daarna water en PCR mix toe aan buizen zes tot en met acht. Plaats beide strips in de thermocycler en selecteer de juiste run. Zodra de run is voltooid, verzamelt u de resultaten en analyseert u verkregen gegevens.Alleen wanneer virale tests negatief hebben geresulteerd, moet MS2-detectie worden uitgevoerd. Gebruik buisstrips die zijn voorbereid voor MS2-detectie en selecteer het juiste thermische profiel voor de PCR. De VirWaTest magnetische nucleïnezuur extractie werd vergeleken met QIAgen virale RNA, nagebootst door het testen van watermonsters verrijkt met menselijke adenovirussen en MS2.Reductie test p-waarde toont aanzienlijk hogere virale terugvorderingen met behulp van VirWaTest dan QiAgen als een extractie methode voor beide virussen getest. De ontwikkelde methode voor virale concentratie werd in het veld getest met de medewerking van Oxfam-wasteams in Bangui, Centraal-Afrikaanse Republiek en in Pedernales, Ecuador, die watermonsters verzamelden, geconcentreerd door de ontwikkelde concentratiemethode toe te passen, en stuurde ze naar het laboratorium in Barcelona voor nucleïnezuurextractie en virale kwantificering. In Ecuador werden menselijke adenovirussen aangetroffen in alle geteste monsters, terwijl één op de vijf monsters die in Bangui werden verzameld en geconcentreerd positief op menselijke adenovirussen testte.De ontwikkelde methode is nuttig gebleken toen het werd geëvalueerd door wasteams van Oxfam Intermon in Bangui, Centraal-Afrikaanse Republiek en door een ander team in Pedernales, Ecuador. VirWaTest kan deel uitmaken van een systeem voor vroegtijdige waarschuwing of kan worden gebruikt bij het onderzoek naar uitbraken door organisaties die betrokken zijn bij watersanering. Deze apparatuur vergemakkelijkt de analyse van virale ziekteverwekkers in water en de verbetering van het beheer van de waterveiligheid met als doel het verminderen van incidenten van virale ziekten in humanitaire crisiscontexten.

virwatest-point-use-method-for-detection-viruses-water

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De omloopsnelheid van virussen in zee-en zoetwater-systemen kan worden geschat door een reductie en herhaling techniek. De gegevens kunnen de onderzoekers om de tarieven van de virus-gemedieerde microbiële sterfte in aquatische systemen af ​​te leiden.

Het schatten van Virus Productie tarieven in aquatische systemen

De studie beschrijft een kosteneffectieve methode voor de identificatie van de bron van fecale / urine besmetting of verontreiniging door nitraten in het water met behulp van qPCR voor de specifieke kwantificering van de mens / varkens / rund DNA-virussen, adenovirussen en polyomavirussen, voorgesteld als MST tools.

Kosteneffectieve methode voor Microbiële Source Tracking Met behulp van specifieke menselijke en dierlijke virussen

Dit protocol beschrijft het gebruik van een tangentiële stroming holle-fiber ultrafiltratie monsterconcentratie en een warmte dissociatie als andere stappen voor het detecteren van...

Een aangepaste EPA-methode 1623, dat tangentiële Flow holle-vezel ultrafiltratie en warmte Dissociatie stappen gebruikt om te detecteren op waterbasis<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; En<em&gt; Giardia spp.</em

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

Er werd een benadering ontwikkeld voor het identificeren van optimale virale concentratiecondities voor kleine watermonsters met behulp van spikes van humaan adenovirus. De hier beschreven technieken worden gebruikt om concentratieparameters voor andere virale doelen te identificeren en worden toegepast op grootschalige virale concentratie-experimenten.

Een klein volume Procedure voor Virale Concentratie van het Water

EPA-methode 1615 gebruikt een elektropositieve filter om enterovirussen en norovirusessen te concentreren in milieu- en drinkwater. Dit manuscript beschrijft de procedure voor het verzamelen van monsters voor analyse volgens Methode 1615.

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in water per cultuur en RT-qPCR. I. Het verzamelen van Virus Samples

Hier presenteren we een procedure om totale cultiveerbare virussen te meten met behulp van de Buffalo Green Monkey niercel lijn. De procedure biedt een gestandaardiseerd hulpmiddel voor het meten van het voorkomen van infectieuze virussen in milieu- en drinkwater.

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in Water per cultuur en RT-qPCR. II. Totaal kweekbare Virus Assay

Hier presenteren we een procedure om enterovirus en norovirus in milieu- en drinkwater te kwantificeren met behulp van reverse transcriptie-kwantitatieve PCR. De gemiddelde virusterugwinning uit grondwater met deze gestandaardiseerde procedure van EPA-methode 1615 was 20% voor poliovirus en 30% voor muur-norovirus.

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in water per cultuur en RT-qPCR. Deel III. Virus Detectie door RT-qPCR

Een anion wisselen hars gebaseerde methode, aangepast aan vloeistof impingement gebaseerde bioaerosol bemonstering van virussen is aangetoond. Wanneer gekoppeld aan downstream moleculaire detectie, zorgt de methode voor facile en gevoelige detectie van virussen van bioaerosols.

Detectie van virussen van Bioaerosols met behulp van Anion Exchange hars

Virusconcentratie uit milieuwater- en afvalwatermonsters is een uitdagende taak, voornamelijk uitgevoerd voor de identificatie en kwantificering van virussen. Hoewel er verschillende virusconcentratiemethoden zijn ontwikkeld en getest, tonen we hier de effectiviteit aan van ultrafiltratie en magere melkvlokking voor RNA-virussen met verschillende monstertypen.

Concentratie van virusdeeltjes uit milieuwater- en afvalwatermonsters met behulp van magere melkflocculatie en ultrafiltratie

Leer VirWaTest voor het detecteren van enterische virussen in watermonsters. Deze draagbare methode verbetert de waterveiligheid in humanitaire contexten door virale pathogenen op de plaats van gebruik op te sporen.

VirWaTest, een gebruiksmethode voor het opsporen van virussen in water monsters

Meer video's verkennen