Name: In vivo directe herprogrammering van ingezeten gliacellen in interneuronen door intracerebrale injectie van virale vectoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Leer hoe je in vivo gliacellen omzet in parvalbumine-positieve interneuronen met AAV-virale vectoren in muismodellen. Deze methode biedt inzichten voor celvervangende therapieën bij psychiatrische aandoeningen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Marcella Birtele werd gefinancierd door het EU Horizon 2020 programma (H2020-MSCA-ITN-2015) onder de Marie Skłodowska-Curie innovatieve opleidingsnetwerken en subsidieovereenkomst nr. 676408. Daniella Rylander Ottosson is gefinancierd door de Zweedse Onderzoeksraad (2017-01234).

<ol><li>Barker, R. A., Parmar, M., Studer, L., Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Trials+of+Stem+Cell-Derived+Dopamine+Neurons+for+Parkinson%27s+Disease%3A+Dawn+of+a+New+Era%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human Trials of Stem Cell-Derived Dopamine Neurons for Parkinson's Disease: Dawn of a New Era.</a> Cell Stem Cell. 21 (5), 569-573 (2017).</li>
<li>Southwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneurons+from+embryonic+development+to+cell-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interneurons from embryonic development to cell-based therapy.</a> Science. 344 (6180), 1240622(2014).</li>
<li>Parmar, M., Torper, O., Drouin-Ouellet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+therapy+for+Parkinson%27s+disease%3A+A+journey+through+decades+toward+the+light+side+of+the+Force%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cell-based therapy for Parkinson's disease: A journey through decades toward the light side of the Force.</a> European Journal of Neuroscience. , (2018).</li>
<li>Torper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Reprogramming+of+Striatal+NG2+Glia+into+Functional+Neurons+that+Integrate+into+Local+Host+Circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry.</a> Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).</li>
<li>Su, Z., Niu, W., Liu, M. L., Zou, Y., Zhang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+conversion+of+astrocytes+to+neurons+in+the+injured+adult+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">In vivo conversion of astrocytes to neurons in the injured adult spinal cord.</a> Nature Communication. 5, 3338(2014).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascl1+Converts+Dorsal+Midbrain+Astrocytes+into+Functional+Neurons+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ascl1 Converts Dorsal Midbrain Astrocytes into Functional Neurons In Vivo.</a> Journal of Neuroscience. 35 (25), 9336-9355 (2015).</li>
<li>Guo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+direct+reprogramming+of+reactive+glial+cells+into+functional+neurons+after+brain+injury+and+in+an+Alzheimer%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an Alzheimer's disease model.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 188-202 (2014).</li>
<li>Grande, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+impact+on+direct+neuronal+reprogramming+in+vivo+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Environmental impact on direct neuronal reprogramming in vivo in the adult brain.</a> Nature Communication. 4, 2373(2013).</li>
<li>Niu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+of+astrocytes+to+neuroblasts+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming of astrocytes to neuroblasts in the adult brain.</a> Nature Cell Biology. 15 (10), 1164-1175 (2013).</li>
<li>Weinberg, M. S., Criswell, H. E., Powell, S. K., Bhatt, A. P., McCown, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+Vector+Reprogramming+of+Adult+Resident+Striatal+Oligodendrocytes+into+Functional+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Viral Vector Reprogramming of Adult Resident Striatal Oligodendrocytes into Functional Neurons.</a> Molecular Therapy. 25 (4), 928-934 (2017).</li>
<li>Pereira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Reprogramming+of+Resident+NG2+Glia+into+Neurons+with+Properties+of+Fast-Spiking+Parvalbumin-Containing+Interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct Reprogramming of Resident NG2 Glia into Neurons with Properties of Fast-Spiking Parvalbumin-Containing Interneurons.</a> Stem Cell Reports. 9 (3), 742-751 (2017).</li>
<li>Rivetti di Val Cervo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+functional+dopamine+neurons+from+human+astrocytes+in+vitro+and+mouse+astrocytes+in+a+Parkinson%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Induction of functional dopamine neurons from human astrocytes in vitro and mouse astrocytes in a Parkinson's disease model.</a> Nature Biotechnology. 35 (5), 444-452 (2017).</li>
<li>Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper-free+Production+of+Laboratory+Grade+AAV+and+Purification+by+Iodixanol+Density+Gradient+Centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Methods+%26+Clinial+Development%22%5BJournal%5D)">Helper-free Production of Laboratory Grade AAV and Purification by Iodixanol Density Gradient Centrifugation.</a> Molecular Therapy Methods & Clinial Development. 10, 1-7 (2018).</li>
<li>Torper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+neurons+via+direct+conversion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Generation of induced neurons via direct conversion in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 7038-7043 (2013).</li>
<li>Kawaguchi, Y., Kubota, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+physiological+subgroupings+of+nonpyramidal+cells+with+parvalbumin-+and+calbindinD28k-immunoreactive+neurons+in+layer+V+of+rat+frontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Correlation of physiological subgroupings of nonpyramidal cells with parvalbumin- and calbindinD28k-immunoreactive neurons in layer V of rat frontal cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 70 (1), 387-396 (1993).</li>
<li>Grealish, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+A9+dopamine+neuron+component+in+grafts+of+ventral+mesencephalon+is+an+important+determinant+for+recovery+of+motor+function+in+a+rat+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The A9 dopamine neuron component in grafts of ventral mesencephalon is an important determinant for recovery of motor function in a rat model of Parkinson's disease.</a> Brain. 133 (Pt 2), 482-495 (2010).</li>
<li>Thompson, L., Barraud, P., Andersson, E., Kirik, D., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+dopaminergic+neurons+of+nigral+and+ventral+tegmental+area+subtypes+in+grafts+of+fetal+ventral+mesencephalon+based+on+cell+morphology%2C+protein+expression%2C+and+efferent+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of dopaminergic neurons of nigral and ventral tegmental area subtypes in grafts of fetal ventral mesencephalon based on cell morphology, protein expression, and efferent projections.</a> Journal of Neuroscience. 25 (27), 6467-6477 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In vivo kan direct herprogrammering worden gerealiseerd met behulp van AAV FLEX vectoren in CRE-uitdrukken muis stammen. Het is belangrijk op te merken dat verschillen tussen de muis stammen met betrekking tot herprogrammering werkzaamheid zijn waargenomen. Voor in vivo herprogrammering in het striatum is de NG2-CRE-muis lijn het meest efficiënt gebleken in vergelijking met andere stammen. Voordat u begint met het gebruik van een nieuwe diersoort, is het belangrijk om de richtlijnen van de muis provider met betrekking tot CRE-expressie na verloop van tijd te controleren, omdat de leeftijd van dieren vaak de specificiteit van deze eiwit expressie beïnvloedt. In onze studies werden dieren ouder dan 12 weken niet gebruikt voor in vivo herprogrammering omdat er een risico bestond voor CRE-expressie in andere cellen dan NG2 glia. De constante aanwezigheid en bewaking van controledieren die alleen met Synapsin-FLEX-GFP-constructie worden geïnjecteerd, wordt geadviseerd. Dit maakt het mogelijk om de dieren te monitoren op GFP-positieve cellen die niet aanwezig mogen zijn als er geen herprogrammering genen (ALN) worden gebruikt.
Om de nieuw geherprogrammeerde neuronen te identificeren, is een neuron-specifieke identificatiemethode zoals beschreven in dit Protocol van het allergrootste belang. Dit zorgt voor een juiste identificatie en onderscheid van de geherprogrammeerde neuronen van de endogene omringende cellen die van bijzonder belang is bij het herprogrammeren in een homotopische regio.
Het is ook belangrijk om te richten op de juiste structuur voor virale injectie. Daarom is de stereotaxic chirurgie voor virale injectie belangrijk en moet worden benaderd met nauwkeurigheid, vooral bij het richten van kleinere structuren van de hersenen.
We hebben al eerder11 laten zien dat het niet betrouwbaar is om de uitkomst van in vivo herprogrammering te voorspellen op basis van in vitro herprogrammatie experimenten met dezelfde herprogrammeeringfactoren. Alle factoren die van belang zijn, moeten daarom in vivo worden getest. In onze handen geven veel verschillende factor combinaties hetzelfde subtype van neuronen (d.w.z. interneuronen11 in vivo), ondanks het feit dat deze genen betrokken zijn bij de ontwikkeling van andere neuronen.
Hele cel patch klem voor geherprogrammeerde neuronen is een delicate techniek en weefsel verwerking is belangrijk voor een goed resultaat. Perfusie met ijskoude Krebs-oplossing verbetert de weefsel kwaliteit. Ook, gepatched neuronen moeten zorgvuldig worden behandeld. Zelfs als rijping en fenotypische identiteit van geherprogrammeerde neuronen enigszins kan worden beoordeeld met behulp van Whole-Cell Patch clamp, zijn deze cellen niet volledig vergelijkbaar met hun endogene tegenhangers. Aanvullende soorten analyses, zoals genoom volgordebepaling (bijv. RNA-sequencing), moeten worden gebruikt om de geherprogrammeerde celidentiteit verder te bevestigen.
De hierin beschreven techniek kan worden overwogen voor de ontwikkeling van toekomstige therapieën waarbij neuronale vervanging nodig is in de hersenen. Hoewel in vivo herprogrammering nog in het beginstadium is en de vertaling in de mens nog niet is voorzien, kan deze techniek een methode bieden om de exogene genfunctie in de hersenen te beoordelen en celrijping in vivo te bestuderen.

Het algemene doel van deze methode is om hersenen Resident glia in vivo efficiënt om te zetten in functionele en subtype-specifieke neuronen zoals parvalbumine-uitdrukken van interneuronen. Dit biedt een stap voorwaarts in de richting van de ontwikkeling van een alternatieve cel vervangende therapie voor hersenziekten zonder de noodzaak voor een exogene celbron. Het creëert ook een hulpmiddel om cel Fate switches in situ te bestuderen.
De hersenen heeft slechts een beperkte capaciteit voor het genereren van nieuwe neuronen. Daarom is er in neurologische ziekten een behoefte aan exogene celbronnen voor hersen herstel. Voor deze, verschillende bronnen van cellen zijn onderworpen aan intens onderzoek door de jaren heen, met inbegrip van cellen van primair weefsel, stamcel-afgeleide cellen en geherprogrammeerde cellen1,2,3. Directe herprogrammering van de ingezeten hersencellen in neuronen is een recente aanpak die een aantrekkelijke methode voor hersen herstel zou kunnen bieden omdat het de eigen cellen van de patiënt gebruikt voor het genereren van nieuwe neuronen in de hersenen. Tot op heden hebben verschillende rapporten in vivo herprogrammering aangetoond via virale vector levering in de hersenen4,5,6,78,9 in verschillende hersengebieden, zoals de cortex, het ruggenmerg, het striatum en de veroorzaakt5,10,11, evenals in intact en lesioned hersenen5,8,11,12. Zowel remmende als excitatory neuronen zijn verkregen4,8, maar de precieze fenotype of functionaliteit van deze cellen is nog niet in detail geanalyseerd.
In dit protocol beschrijven we een efficiëntere herprogrammering en celspecifieke identificatie van in vivo herprogrammeerde neuronen. Wij bieden een protocol voor de functionele beoordeling van de neuronale rijping en fenotype karakterisatie op basis van functionaliteit en immunohistochemische eigenschappen.
We gebruikten een CRE-inducible AAV vector en een GFP reporter om de in vivo geherprogrammeerde neuronen te identificeren. Deze keuze van virale vectoren heeft het voordeel van het infecteren van zowel scheidings-als niet-scheidings cellen van de hersenen, waardoor het aantal beoogde cellen toeneemt, als alternatief voor het gebruik van retrovirus7,8. Een neuron-specifieke synapsin-gedreven FLEX Reporter (GFP), stelde ons in staat om de nieuw gegenereerde neuronen specifiek te detecteren. Eerdere studies hebben subtype-specifieke promoters gebruikt voor in vivo herprogrammering7,9, die ook de uitdrukking van herprogrammering van genen en verslaggevers in specifieke celtypen mogelijk maken. Deze methode vereist echter verdere identificatie van geherprogrammeerde neuronen door middel van een postmortemanalyse van de co-expressie van reporter en neuronale markers. Het gebruik van een neuron-specifieke Reporter, zoals beschreven in dit document, maakt een directe identificatie mogelijk. Dit biedt een direct bewijs van een succesvolle conversie en maakt een live-celidentificatie mogelijk die nodig is voor Patch-clamp elektrofysiologie.

<table><tbody><tr><td>REAGENTS VOOR AAV5 CLONING EN VIRALE VECTORBEREIDING</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAAV-CA-FLEX</td><td>AddGene</td><td>38042</td><td></td></tr><tr><td>Ascl1</td><td>AddGene</td><td>67291</td><td>NM_008553.4</td></tr><tr><td>Lmx1a</td><td>AddGene</td><td>33013</td><td>NM_0033652.5</td></tr><tr><td>Nurr1</td><td>AddGene</td><td>35000</td><td>NM_013613.2</td></tr><tr><td>GFP-syn</td><td>AddGene</td><td>30456</td><td></td></tr><tr><td>LoxP (FLEX) sequence 1</td><td></td><td></td><td>GATCTccataacttcgtataaagtatcctatac gaagttatatcaaaataggaagaccaatgcttc accatcgacccgaattgccaagcatcaccatcg acccataacttcgtataatgtatgctatacgaa gttatactagtcccgggaaggcgaagacgcgga agaggctctaga</td></tr><tr><td>LoxP (FLEX) sequences 2</td><td></td><td></td><td>tactagtataacttcgtataggatactttatac gaagttatcattgggattcttcctattttgatc caagcatcaccatcgaccctctagtccacatct caccatcgacccataacttcgtatagcatacat tatacgaagttatgtccctcgaagaggttcgaa ttcgtttaaacGGTACCCTCGAC</td></tr><tr><td>pDP5</td><td>Plasmid Factory</td><td>PF435</td><td></td></tr><tr><td>pDP6</td><td>Plasmid Factory</td><td>PF436</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetal bovine serum)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)+ Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61965026</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffer Saline)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>HEK293 cells</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85120602-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Flasks</td><td>BD Falcon</td><td>10078780</td><td>175 cm2</td></tr><tr><td>Tris H-CL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10812846001</td><td> Voor TE-buffer gebruik 10 mM, pH 8.0; voor lysisbuffer gebruik 50mM, pH 8.5; voor IE-buffer gebruik 20 mM, pH 8.0; voor elutiebuffer gebruik 20 mM, pH 8.0 </td></tr><tr><td>EDTA</td><td>EDTA: Invitrogen</td><td>EDTA: AM9260G</td><td> Voor TE-buffer gebruik 1 mM EDTA </td></tr><tr><td>Ultrapure water</td><td></td><td></td><td> zie Ultrapure watersysteem </td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SigmaAldrich</td><td>C5080</td><td>2.5 M</td></tr><tr><td>Dulbecco&acute;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td> VOOR HBS gebruik 140 mM; voor Lysis Buffer gebruik 150 mM; voor IE-buffer gebruik 15 mM; voor elutiebuffer gebruik 250 mM </td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td> Voor lysisbuffer: 1 mM </td></tr><tr><td>Ultracentrifuge sealing tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>Quick-Seal&reg;&nbsp;Polypropylene Tube</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep&trade;&nbsp;Density Gradient Medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1556-250ML</td><td></td></tr><tr><td>10-mL syringe-18G needle</td><td>BD</td><td>305064</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory glass bottles</td><td>VWR</td><td>?</td><td></td></tr><tr><td>Anion exchange filter</td><td>PALL laboratory</td><td>MSTG25Q6</td><td> Acrodisc-eenheid met Mustang Q-membraan </td></tr><tr><td>Centrifugal filter unit</td><td>Merck</td><td>Z740210-24EA</td><td> Amicon Ultra-4-apparaat </td></tr><tr><td>Endotoxin-Free Plasmid DNA Isolation Kits</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A33073</td><td></td></tr><tr><td>Na2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>Falcon tube</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Corning 352196</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tube</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Corning 352070</td><td></td></tr><tr><td>Glass Vials</td><td>Novatech</td><td>30209-1232</td><td> CGGCCTCAGFGAGCGA </td></tr><tr><td>Forward Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence</td><td></td><td></td><td> GGAACCCCTAGTGATGGAGTT </td></tr><tr><td>Reverse Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence</td><td></td><td></td><td> CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG </td></tr><tr><td>5&acute;FAM / 3&acute;BHQ1 probe</td><td>Jena Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 mm filter</td><td>Merck</td><td>SLGV004SL</td><td>Millex-GV-filter</td></tr><tr><td>APPARATUUR AAV5 VIRALE VECTORBEREIDING</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vriezer -20 &deg;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vriezer -80 &deg;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koelkast +4 &deg;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV viral room</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure Water systeem</td><td>Merck</td><td>Milli-Q&reg; IQ 7000</td><td></td></tr><tr><td>Vortexmixer</td><td>VWR</td><td>444-0004</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge</td><td></td></tr><tr><td>Autoclaaf</td><td>Tuttnauer</td><td>2540 EL</td><td></td></tr><tr><td>Polymerase Chain Reaction (PCR)</td><td>BioRad</td><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td></td></tr><tr><td>Quantitative PCR (qPCR)</td><td>Roche</td><td>LightCycler&reg; 480 System</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Sorvall ST16</td><td></td></tr><tr><td>Waterbad</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TSGP02</td><td></td></tr><tr><td>DIERMODEL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NG2-Cre muizen</td><td>Jackson</td><td>NG2-CrexB6129, Stock #008533</td><td></td></tr><tr><td>REAGENTS VOOR INJECTIE VAN REPROGRAMMING FACTOREN IN DE HERSENEN</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Apoteket AB</td><td></td><td>70%</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Solveco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolfurane</td><td>Apoteket AB</td><td></td><td> Verdund tot 1% oplossing met warm water. </td></tr><tr><td>Virkon</td><td>Viroderm</td><td>7511&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Apoteket AB</td><td>P0500000</td><td> i.p. voor terminale procedure in een dosis van 60 mg/ml. </td></tr>

in vivo directe herprogrammering van ingezeten gliacellen in interneuronen door intracerebrale injectie van virale vectoren

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

Het omzetten van Resident glia in de hersenen in functionele en subtype-specifieke neuronen in vivo biedt een stap voorwaarts in de richting van de ontwikkeling van alternatieve celvervangende therapieën terwijl het ook instrumenten creëert om het lot van cellen in situ te bestuderen. Tot op heden, het is mogelijk om te verkrijgen van neuronen via in vivo herprogrammering, maar de precieze fenotype van deze neuronen of hoe ze volwassen is niet in detail geanalyseerd. In dit protocol beschrijven we een efficiëntere conversie en celspecifieke identificatie van de in vivo herprogrammeerde neuronen, met behulp van een AAV-gebaseerd virale vector systeem. We bieden ook een protocol voor de functionele beoordeling van de neuronale rijping van de geherprogrammeerde cellen. Door het injecteren van Flip-excisie (FLEX) vectoren, met de herprogrammering en synapsin-driven reporter genen naar specifieke celtypen in de hersenen die dienen als het doelwit voor het herprogrammeren van de cel. Deze techniek maakt de eenvoudige identificatie van nieuw geherprogrammeerde neuronen mogelijk. Resultaten tonen aan dat de verkregen geherprogrammeerde neuronen functioneel volwassen na verloop van tijd, ontvangen synaptische contacten en Toon elektrofysiologische eigenschappen van verschillende soorten interneuronen. Met behulp van de transcriptiefactoren Ascl1, Lmx1a en Nurr1 hebben de meeste herprogrammeerde cellen eigenschappen van snel spiking, parvalbumine-bevattende interneuronen.

De injectie van AAV-vectoren wordt gebruikt voor het succesvol herprogrammeren van Resident NG2 glia-cellen in neuronen in het NG2-CRE-muis striatum (Figuur 1a). Om specifiek te richten ng2 glia, Flex vectoren met reprogramming/reporter genen, worden ingevoegd in een antisense-richting en geflankeerd door twee paren van anti parallel, van loxp sites (Figuur 1b). Elk van de drie Herprogrammeerbare genen (Ascl1, Lmx1a en Nurr1) wordt onder controle van de alomtegenwoordige CBA-promotor op individuele vectoren geplaatst. Om ervoor te zorgen dat GFP-expressie beperkt is tot geherprogrammeerde neuronen afkomstig van een CRE-uitdrukken cel, wordt GFP onder de controle van de neuron-specifieke synapsin Promoter geplaatst, (ook in een FLEX vector).
Het gebruik van de combinatie van herprogrammering en reporter constructies maakt het mogelijk voor het genereren van GFP-positieve neuronen in de muis striatum (figuur 1c, C '). Het gebruik van de reporter construct zonder de aanwezigheid van herprogrammatie genen oplevert geen GFP-positieve neuronen (figuur 1d).
De geherprogrammeerde neuronen die biocytin-gevuld zijn, zijn zichtbaar na postmortemimmuno-kleuring (Figuur 2a). Als conversie succesvol is, moet er uitgebreide neuronale morfologie zijn. De elektrofysiologische opnames van geherprogrammeerde neuronen tonen de aanwezigheid van postsynaptische functionele verbindingen met spontane activiteitsmaatregelen (Figuur 2b, C). Dit kan worden geblokkeerd met ofwel ionotropic GABAergic of glutamaterge Blocker (picrotoxin of cnqx), suggereren zowel excitatory en remmende synaptische input voor de geherprogrammeerde neuronen. Het optreden van spontane activiteit neemt toe met de tijd na virale injectie (figuur 2D), wat duidt op een geleidelijke rijping.
Stroom-geïnduceerde actie potentialen zijn aanwezig in functionele neuronen. De actie potentialen toenemen in aantal na verloop van tijd na de conversie (figuur 2e). Dit wijst verder rijping in neuronale functie. In een onvolgroeide neuron, stroom zal induceren ofwel geen of zeer weinig actie potentialen (figuur 2F).
Het afvuren van een neuron is een specifiek celtype omdat het afhankelijk is van factoren zoals de morfologie van de cellen en de kanaal expressie15. De opgenomen patronen in de in vivo geherprogrammeerde neuronen kunnen worden onderscheiden in groepen en vergeleken met die van endogene neuronale subtypen, bijvoorbeeld snelle spikkelinterneuronen (cel type B, Figuur 3b) of andere celtypen (Figuur 3a, C, D ). De waargenomen elektrofysiologische verschillen kunnen worden bevestigd door de aanwezigheid van specifieke subtype markers en co-expressie met GFP (figuur 3e-H). In totaal geeft deze gegevens aan dat de geherprogrammeerde neuronen in het striatum eigenschappen hebben van verschillende soorten interneuronen, zoals parvalbumine-, ChAt-en npy-uitdrukken van interneuronen, evenals een striatale medium stekelige neuron Identity (DARPP32 +) ( Figuur 3e -H).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig1.jpg"> Figuur 1: in vivo herprogrammering van Resident ng2 glia in neuronen. A) Schematische weergave van AAV-virus-gemedieerde in vivo herprogrammering van striatale ng2 glia. B) Schematische weergave van AAV5 flexconstructies die worden gebruikt voor in vivo herprogrammering, waarbij genexpressie wordt gereguleerd door CRE-expressie in de beoogde cellen. (C en c ') in vivo geherprogrammeerde neuronen, resulterend uit SYN-GFP + ALN injectie in het striatum. D) afwezigheid van geherprogrammeerde neuronen wanneer er geen herprogrammatie factoren worden toegevoegd aan de virale cocktail, en alleen reporter construct in vivo wordt geïnjecteerd. Schaal staven = 100 mm (C), 25 mm (C '), 25 mm (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig2.jpg"> Figuur 2: in vivo herprogrammeerde neuronen zijn functioneel en vertonen rijping na verloop van tijd. A) met biocytine gevuld geherprogrammeerd neuron, toont volwassen neuronale morfologie, waaronder dendritische stekels. Traces toont (B) remmende (GABAergic) activiteit die is geblokkeerd met picrotoxine, een Gabaeen receptor antagonist en (C) excitatory activiteit die is geblokkeerd met cnqx, een AMPA receptor antagonist. (D) het aantal neuronen met postsynaptische activiteit neemt na verloop van tijd toe. (E) gepatchte neuronen vertonen al herhaalde afvuren na 5 weken na de injectie (w.p.i.) en blijven tonen dat bij 8 en 12 W.p.i. (F) stroom-geïnduceerde actiepotentiaal en postsynaptische activiteit van een onvolgroeid neuron, met weinig synaptische evenementen en weinig actie potentialen in vergelijking met B en D. schaalbalk = 25 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig3v2.jpg"> Figuur 3: in vivo herprogrammeerde neuronen tonen immunohistochemische en elektrofysiologische eigenschappen van striatale interneuronen. (a-D) De ontstekings patronen van in vivo herprogrammeerde neuronen kunnen van verschillende types zijn: (a) type a is vergelijkbaar met endogene medium stekelige neuron (DARPP32 +); (B) vergelijkbaar met Fast-SPIKING (PV +) interneuronen; (C) vergelijkbaar met laagdrempelige stekelige neuronen met prominente SAG (npy +); D) neuronen die met grote after-hyperpolarisatie afvuren (chat +). (E-H) Confocale beelden die de co-lokalisatie van GFP en de Interneuron markers PV (E), ChAT (F), npy (G) en projectie neuron marker DARPP32 (H) tonen. Alle schaal staven = 50 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig3v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Dit protocol is gericht op het genereren van direct geherprogrammeerde interneuronen in vivo, met behulp van een AAV-gebaseerd virale systeem in de hersenen en een FLEX synapsin-driven GFP Reporter, die het mogelijk maakt voor celidentificatie en verdere analyse in vivo.

In vivo directe herprogrammering van ingezeten gliacellen in interneuronen door intracerebrale injectie van virale vectoren

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

Dit protocol toont aan dat het mogelijk is om nieuwe neuronen direct in de hersenen te genereren van resident glia en dat deze geherprogrammeerde cellen rijpen tot subtype-specifieke neuronen. Het belangrijkste voordeel is de cre-afhankelijke AAV virus dat specifieke targeting van de NG2-glia en de GFP verslaggever die de geherprogrammeerde neuronen labels voor analyse mogelijk maakt. Het genereren van nieuwe neuronen in de hersenen kan leiden tot toekomstige ontwikkeling voor celvervangende therapieën in de hersenen.In ons protocol genereren we de parvalbumine-positieve interneurons die implicaties hebben voor psychiatrische stoornissen. In vivo herprogrammering kan worden toegepast op andere hersengebieden en circuits, afhankelijk van welke neuronale fenotype en neurologische aandoening u wilt richten. Demonstreren van de procedure zal Jenny Johansson: een technicus, Maria Pereira: een voormalige promovendus, en Marcella Birtele: een promovendus in ons lab.Voor de productie van AAV5 virale vector, zaad HEK293T cellen met standaard cultuur medium in vijf T175 kolven. Wanneer de cellen 50 tot 70% samenvloeiing bereiken, bereidt u de volgende mix voor op transvectie. In een 50 milliliter centrifuge buis, voeg gelijke molaire hoeveelheden vector plasmid, en pDG-serie helper plasmid.Voeg Tris-EDTA buffer toe aan een eindvolume van 144 microliters en voeg vervolgens ultrazuiver water toe om te resulteren in een totaal volume van 1296 microliters en mix. Voeg vervolgens 144 microliters van 2,5 molaire calciumchloride toe en meng. Voeg daarna direct 1,92 milliliter HBS toe aan de DNA-oplossing en vortex.Incubeer bij kamertemperatuur gedurende precies 60 seconden. Breng de oplossing vervolgens over op 28 milliliter vers celkweekmedium en mix. Vervang het medium in de kolven door het medium dat een transvectionmix bevat.Wacht drie dagen en breng de media over op afval. Voeg vijf milliliter oogstbuffer toe aan elke kolf en voeg vervolgens nog eens vier milliliter DPBS toe aan elke kolf om de resterende cellen te spoelen en te poolen met de celoplossing. Centrifugeren de geoogste cellen op 1, 000 x g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.Verwijder na centrifugatie de supernatant en los de pellet op in 15 milliliter lysisbuffer. Vries de 50 milliliter centrifugebuis 15 minuten op droogijs en bewaar in een min 20 graden Celsius vriezer. Ontdooi voor gebruik de geoogste cel in een waterbad bij 37 graden Celsius.Voer in deze procedure AAV-zuivering uit door iodixanol gradiënt ultracentrifugatie en gebruik ultracentrifugeplafondbuizen met centrifugatie bij 350, 000 x g gedurende een uur en 45 minuten bij kamertemperatuur. Om de AAV-fase te extraheren, plaatst u een spuit van 10 milliliter met een naald van 18 meter op ongeveer twee millimeter onder de 40 tot 60%-fasegrens met de schuine kant naar boven gericht en trek u zich terug. Zorg ervoor dat u stopt voordat u de eiwitband bereikt nadat vijf tot zes milliliter van de virale vector is geëxtraheerd.Vervolgens, zuiveren en concentreren van de verdunde iodixanol gradiënt door middel van een anion uitwisseling filter, door te duwen door met een snelheid niet sneller dan een druppel per seconde. Duw vervolgens drie milliliter IE-buffer langzaam door het filter om het te wassen. Vervolgens elute het mengsel in een centrifugaal filter eenheid met een tot twee milliliter elutie buffer.Voeg DPBS toe aan het apparaat aan een eindvolume van vier milliliter. Centrifuge bij 2,000 x g bij kamertemperatuur tot minder dan 0,5 milliliter DPBS in het filter blijft achter. Verwijder daarna vloeistof uit de bodem van de buis, vul met vier milliliter DPBS en centrifuge opnieuw.Herhaal deze stap nog twee keer, zorg ervoor dat het volume van geconcentreerde vector op het filter is ongeveer 200 microliter na de laatste centrifugatie. Verwijder de 200 microliter geconcentreerde vector met behulp van een pipet, en duw het door een 0,22 micrometer filter te steriliseren. Vervolgens aliquot 200 microliters in een glazen flacon met ingesloten insert.Als u herprogrammeringsfactoren wilt injecteren, plaatst u een verdoofde muis in het stereotaxic-frame. Toedien de juiste analgesie aan het begin van de operatie en breng vervolgens het puntje van de glazen capillaire van de injectienaald net boven bregma. Zorg ervoor dat de capillaire tip perfect recht in zowel A-P en M-L vliegtuigen.Stel zowel de M-L- als A-P-waarden opnieuw in op 0,0 op de digitale coördinaatteller. Om ervoor te zorgen dat het hoofd van het dier zich in een perfect vlakke positie bevindt, gebruikt u de digitale coördinaatteller om de D-V-coördinaatwaarde te meten wanneer de A-P-arm op plus 2.0 en min 2,0 staat. Pas de hoogte van de tandbalk en de oorbalk dienovereenkomstig aan.Til daarna de spuit iets op en boor een gat met behulp van een tandboor bij de injectiecoördinaten. Begin te boren op de site, werken in een cirkelvormige en zachte manier. Plaats vervolgens een stukje katoenen gaas over de open incisie en spoel de spuit door met een zoutoplossing.Na het spoelen, het opstellen van een luchtbel en vervolgens een microliter van de oplossing met de virale vector. Zorg ervoor dat de virale oplossing gemakkelijk kan worden gevisualiseerd onder de luchtbel. Vervolgens, lager de spuit, vordert langzaam naar de gewenste diepte, en zorg ervoor dat de baan vrij is van botfragmenten.Injecteer vervolgens een microliter van de virale oplossing met een snelheid van 0,4 microliter per minuut. Wanneer de injectie is gedaan, laat twee minuten voor diffusie voor spuit ontwenning. Trek na diffusie de spuit langzaam in totdat de punt van de capillaire volledig uit de hersenen wordt teruggetrokken, sluit de incisie voorzichtig en verwijder het dier uit het stereotaxicframe.Controleer het dier in een postoperatieve station tot het bewustzijn is herwonnen. Dieren worden tot 12 weken na de virusinjectie gehouden om ingezeten glia te laten herprogrammeren in volwassen neuronen. Om hersenen plakjes voor te bereiden voor elektrofysiologie met behulp van een vibratome, sectie de hersenen van de meest rostral deel naar het striatale niveau op hoge snelheid.Vervolgens sectie de striatum coronale op 275 micrometer op 0,1 millimeter per seconde. Verwijder na elke sectie voorzichtig de niet-geïnjecteerde striatale kant en breng de geïnjecteerde kant over in een flacon met een bodemnet en zuurstofrijk CREB-zinschuifje in het waterbad bij kamertemperatuur. Houd de flacon op kamertemperatuur totdat alle secties zijn doorgesneden.Daarna, langzaam verhogen van de temperatuur van het waterbad tot 37 graden Celsius en laat het voor 30 minuten, zet dan de kachel en laat het afkoelen tot kamertemperatuur. Na het overbrengen van een weefselsectie naar een opnamekamer voor elektrofysiologie, monteer de glazen pipet op de opnameelektrode en laat deze in de oplossing zakken. Controleer de weerstand van de elektrode.Nader vervolgens langzaam de geherprogrammeerde cel met de pipet, waarbij een lichte positieve druk in de elektrode wordt gehouden om te voorkomen dat de tip wordt aangesloten en controleer of de cel GFP-positief is voordat deze wordt gepatcht. Wanneer de cel wordt gepatcht, moet u de cel in de huidige klem van min 60 tot min 70 millivolt houden en 500 milliseconde stromen injecteren van min 20 tot plus 90 picoamperes met 10 picoampere stappen om actiemogelijkheden te induceren. Dit is indicatief voor een neuronale rijping en succesvolle herprogrammering.Schakel vervolgens over op spanningsklem en meet het binnen natrium en vertraagde corrigerende kaliumstromen bij depolarisatiestappen van 10 millivolt. Hier is een post opgenomen biocytine gevuld geherprogrammeerd neuron dat volwassen neuronale morfologie en de dendritische stekels toont. Hier tonen elektrofysiologische opnames van de geherprogrammeerde neuronen de aanwezigheid van postsynaptische functionele verbindingen met spontane activiteitsmaatregelen.Sporen tonen de remmende activiteit die wordt geblokkeerd met picrotoxine, een GABAA receptor antagonist en de excitatory activiteit die wordt geblokkeerd met CNQX, een AMPA receptor antagonist. De gepatchte neuronen tonen al postynaptische activiteit na vijf weken na de injectie, en blijven op acht en 12 weken na de injectie. Het aantal neuronen met de huidige geïnduceerde actie mogelijkheden neemt ook toe in de tijd.Een meer gedetailleerde analyse bleek verschillende verschillende vuren patronen waar de meerderheid van de cellen tonen snelle spiking activiteit vergelijkbaar met parvalbumin interneurons. Immunohistochemische analyse na 12 weken toonde verder co-expressie van de verslaggever GFP en de parvalbumine. Na deze procedure u de genexpressie onderzoeken met patch seek techniek of de driedimensionale synaptische connectiviteit beoordelen met monosynaptische tracering en iDISCO.Nu het mogelijk is om resident glia te herprogrammeren tot parvalbumine die interneurons uitdrukt, zijn we begonnen om te onderzoeken of deze authentiek zijn en kunnen worden gebruikt als een therapeutisch hulpmiddel. Vergeet niet om de vastgestelde protocollen en richtlijnen te volgen bij het hanteren van dieren en het gebruik van het AAV-virus.

in-vivo-direct-reprogramming-resident-glial-cells-into-interneurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier presenteren we de intracraniële injectie van AAV-vectoren voor TL-etikettering van neuronen en glia in de visuele cortex.

Intracraniële Injectie van adeno-geassocieerde virale vectoren

This video demonstrates a protocol to evaluate the maturation and reprogramming of glial cells into neurons in a transfected mouse striatum slice. The experiment measures resting membrane potential and response to current injections using neuron-specific fluorescent markers and electrophysiological techniques. Voltage spikes during these measurements indicate successful neuronal maturation and reprogramming.

Electrophysiological Recordings of Reprogrammed Neurons in a Mouse Brain Slice

Source: Pereira, M. et. al., In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates stereotaxic injection of an adeno-associated virus into the cerebral cortex of a transgenic mouse to deliver Cre-dependent neuronal reprogramming and fluorescent reporter genes into glial cells.

Stereotaxic Injection of Viral Vectors for Glial Cell Reprogramming in a Mouse Model

Targeting hersen-ingezeten cellen voor directe afstamming-herprogrammering biedt nieuwe perspectieven voor de hersenen reparatie. Hier beschrijven we een protocol hoe culturen verrijkt voor hersen-ingezeten pericytes van de menselijke hersenschors volwassen opstellen en deze om te zetten naar geïnduceerde neuronen door-retrovirus gemedieerde expressie van de transcriptiefactoren Sox2 en Ascl1.

Lineage-herprogrammering van pericyte-afgeleide cellen van het volwassen menselijke hersenen in Induced Neuronen

Hier demonstreren we een techniek voor wijdverspreide neuronale transductie door intraventriculaire injectie van adeno-geassocieerd virus in de neonatale muisbrein. Deze methode biedt een snelle en eenvoudige manier om levenslange expressie van vireel aangeboden transgenen te bereiken.

Intracerebroventriculaire Viral Injectie van de Neonatale Mouse Brain voor persistent en wijdverbreide Neuronale Transduction

Op basis van in vitro lentivirale engineering van neuronale precursoren, hun co-transplantatie in wild-type hersenen en gepaarde morphometrische evaluatie van "test" en "Control" derivaten, maakt deze methode nauwkeurige modellering van in vivo gencontrole van neocorticale neuron morfologie op een eenvoudige en betaalbare manier.

Intraveneuze triculaire transplantatie van engineered neuronale precursoren voor in vivo Neuroarchitecture studies

Hier presenteren we een protocol, ontworpen om gebruik te maken van chemogenetische hulpmiddelen om de activiteit van corticale Interneuron voorlopercellen getransplanteerd in de cortex van vroege postnatale muizen te manipuleren.

Transplantatie van Chemogenetisch gemanipuleerde corticale Interneuron progenitors in vroege postnatale Muizenhersenen

We beschrijven een protocol om menselijke huid-afgeleide fibroblasten te herprogrammeren in geïnduceerde Neuronal Progenitor Cells (iNPC's), en hun daaropvolgende differentiatie in geïnduceerde Astrocyten (iA's). Deze methode leidt tot een snelle en reproduceerbare generatie van iNPC's en iA's in grote hoeveelheden.

In vitro modellering voor neurologische ziekten met behulp van directe conversie van fibroblasten naar neuronale voorlopercellen en differentiatie in astrocyten

We beschrijven de intraparenchymale transplantatie van menselijke neurale voorlopercellen getransduceerd met een dual reporter vector die luciferase-groen fluorescerend eiwit (GFP) in de hersenen van muizen tot expressie brengt. Na transplantatie wordt het luciferasesignaal herhaaldelijk gemeten met behulp van in vivo bioluminescentie en GFP-tot expressie brengende getransplanteerde cellen geïdentificeerd in hersensecties met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Intracerebrale transplantatie en in vivo bioluminescentie tracking van menselijke neurale voorlopercellen in de hersenen van de muis

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol om sterk verrijkte culturen van astrocyten te genereren die zijn afgeleid van verschillende regio's van het centrale zenuwstelsel van postnatale muizen en hun directe omzetting in functionele neuronen door de geforceerde expressie van transcriptiefactoren.

Isolatie en directe neuronale herprogrammering van muisastryoten

Leer hoe je in vivo gliacellen omzet in parvalbumine-positieve interneuronen met AAV-virale vectoren in muismodellen. Deze methode biedt inzichten voor celvervangende therapieën bij psychiatrische aandoeningen.

In vivo directe herprogrammering van ingezeten gliacellen in interneuronen door intracerebrale injectie van virale vectoren

Meer video's verkennen